SSH抑制性消减杂交文库构建方法介绍
抑制性减法杂交技术
抑制性减法杂交技术1996年，L. Diatchebko在RDA的基础上建立了抑制性减法杂交（supression subtractive hybridization, SSH）技术，该技术是RDA技术的发展，能有效克服RDA或cDNA RDA技术难以解决的问题，如两者不能用于分离两组基因表达差异较小的基因，也不能用于研究存在上调表达的基因等。
(1) SSH的主要原理SSH的核心技术是抑制性PCR (suppression PCR )，它是一种将检测子cDNA单链标准化步骤和消减杂交步骤结合为一体的技术。
其中标准化步骤均等了检测子中的cDNA单链丰度，而消减杂交步骤去除了检测子和驱赶子之间的共同序列，使检测子和驱赶子之间不同的序列得到扩增。
因此SSH显著增加了获得低丰度表达差异cDNA的概率，简化了对消减文库的分析。
抑制PCR是利用链内复性优先于链间复性的原理，使非目标序列片段两端的长反向重复序列(long inverted repeats)在复性时产生“锅柄样”(panhandle-like）结构或“发夹结构”而无法与引物配对，从而选择性地抑制了非目标序列的扩增。
同时，根据杂交的二级动力学原理，丰度高的单链cDNA复性时产生同源杂交速度要快于丰度低的单链cDNA，从而使得丰度存在差异的cDNA相对含量趋于基本一致。
（2）SSH的基本过程如图所示，SSH的主要步骤包括：限制性核酸内切酶切割，产生大小适当的平头末端cDNA片段。
②将检测cDNA分成均等的两份，分别接上接头1或接头2,接头（adaptor)由一长链(40nt)和一短链(l0nt)组成的一端是平末端的双链cDNA分子。
长链3′端与cDNA5′端相连。
长链外侧序列（约20nt）与第一次PCR引物序列相同，内侧序列则与第二次PCR引物序列相同。
此外，接头上含有升启动子序列及内切酶识别位点（如Not I, Srf I, Sma I和Xba I等），为以后将该片段插入克隆载体和测序提供便利。
抑制性消减杂交_SSH_技术及其应用
抑制性消减杂交技术（ＳｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎＳｕｂｔｒａｃｔｉｖｅＨｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ，ＳＳＨ）是Ｄｉａｔｃｈｅｎｋｏ等于１９９６年依据消减杂交和抑制ＰＣＲ发展起来的一种分离差异表达基因的新方法［１，２］，该技术具有假阳性率低、筛选效率高、操作简单等优点，特别适用于克隆分析造成某种特殊表型的目的基因及其功能。
而消减文库是使用两种遗传背景相同或大致相同但在个别功能或特性上不同的材料（如同类菌种的高产、低产品系），提取ｍＲＮＡ经反转录合成ｃＤＮＡ，在一定条件下用大大过量的不含目的基因的一方作为驱动子（Ｄｒｉｖｅｒ），与含有目的基因的试验方（Ｔｅｓｔｅｒ）进行杂交，选择性的去除两部分共同基因杂交形成的复合物，最后将含有相关目的基因的未杂交部分收集后，连接到载体形成文库。
高等真核生物的所有生命现象，例如细胞生长、器官形成、恶性转化、特定代谢产物分泌等都是基因选择性表达的结果，要弄清这些生命现象的分子调节机制，就要对选择性表达的基因进行分离、克隆、序列分析，然后研究其氨基酸组成，表达产物的结构功能。
抑制性消减杂交技术为寻找表达基因和研究已知基因的新生物学功能提供了一个有利工具。
１ＳＳＨ的基本原理与过程［３，４］１．１提取样本ｍＲＮＡ，利用随机引物反转录为双链ｃＤＮＡ，将不含目的基因的一方作为驱动子（Ｄｒｉｖｅｒ），含有目的基因的样品称为试验方（Ｔｅｓｔｅｒ）。
１．２用识别四碱基的限制性内切酶ＲｓａＩ（或ＨａｅⅢ）酶切。
双链ｃＤＮＡ经酶切后，每个片段一般小于６００ｂｐ，可防止长链ｃＤＮＡ片段所形成的复杂结构干扰消减杂交。
１．３将ｔｅｓｔｅｒｃＤＮＡ分成两组（１和２），分别于其５′端接上去磷酸化的接头１和接头２（ａｄａｐｔｏｒ１，ａｄａｐｔｏｒ２）。
两接头分别是具有一段反向末端重复序列的寡核苷酸序列，由一长链（约４０余个核苷酸）和一短链（约１０余个核苷酸）组成的双链ＤＮＡ片段，长链外侧２０余个核苷酸序列与第一次ＰＣＲ引物序列相同，而内侧序列与第二次ＰＣＲ引物序列相同。
抑制性消减杂交技术的应用[1]
![抑制性消减杂交技术的应用[1]](https://img.taocdn.com/s3/m/a11ab97801f69e3143329423.png)
・技术与方法・生物技术通报B I O TECHNOLOGY BULL ET I N2009年第5期抑制性消减杂交技术的应用李小庆 景志忠(中国农业科学院兰州兽医研究所家畜疫病病原生物学国家重点实验室农业部兽医公共卫生重点实验室甘肃省动物寄生虫病重点实验室,兰州730046) 摘 要: 基因的差异表达是调控各种生命活动的核心分子机制,而分离、克隆并进一步研究差异表达基因已成为现代分子生物学研究的热点,也是功能基因组学研究的重要内容。
在研究差异表达基因的诸多项技术中,抑制性消减杂交(SSH )技术具有特异性强、假阳性率低、灵敏度高和快速简便等优点,被广泛地应用于生命科学和医学领域的基因差异表达的研究中。
近年来,抑制性消减杂交(SSH )技术得到了相应的改进和完善,而在许多研究领域,该技术在广度和深度上都有了一些新进展。
主要就抑制性消减杂交技术的产生背景、原理、技术流程、特点及其最新应用研究进展等方面作简要综述。
关键词: 抑制性消减杂交 差异表达 功能基因 DS N 均一化技术 c DNA 微阵列Suppressi on Subtracti ve Hybr i di zati on Techn i que andProgress i n the Appli cati onL i Xiaoqing Jing Zhizhong(Lanzhou Veterinary R esearch Institute CAAS,Key Laboratory of Ani m al Parasitology of Gansu P rovince,Key Laboratory of Veterinary PublicHealth of M inistry of Agriculture,S tate Key Laboratory of Veterinary E tiological B iology,Lanzhou 730046) Ab s trac t: D ifferential exp ressi on of genes is the centralmolecular mechanis m of regulating all kinds of life acti ons 1Among all thetechnol ogies of identifying differential exp ressed genes,supp ressi on subtractive hybridizati on (SSH )is considered t o be with high s peci 2ficity,l ow backgr ound,high sensitivity,convenient mani pulati on,and had been widely app lied in life science and medicine research fields 1I n this paper,the p rinci p le,method,characteristics and the research p r ogress of SSH technique were intr oduced 1Key wo rd s: Supp ressi on subtractive hybridizati on D ifferential exp ressi on Functi onal genes DS N (dup lex 2s pecific nuclease )2nor malizati on method c DNA m icr oarray收稿日期:2008211211基金项目:国家自然科学基金项目(30871884),国家高新技术“863”项目(2006AA10A203),甘肃省支撑计划项目(0804NKCA076)作者简介:李小庆(19832),男,硕士,专业方向:畜禽疫病的分子生物学与免疫学通讯作者:景志忠,博士,研究员,主要从事病原与宿主的分子生物学与免疫学研究;E 2mail:zhizhongj@yahoo 1com 1cn 上世纪90年代以来,随着分子生物学技术的快速发展以及多物种包括人类的基因组全序列测定计划的陆续完成,分子生物学的研究热点已经从结构基因组研究转向基因功能和表达调控的功能基因组研究,于是多种用于差异表达分析的基因克隆技术相继问世。
抑制性差减杂交技术_SSH_在植物学研究中的应用
抑制性差减杂交技术( SSH) 在植物学研究中的应用
阎爱华, 王冬梅
( 河北农业大学 生命科学学院, 河北 保定 071001)
摘要 : 抑制性差减杂交是一种基于转录水平的杂交技术, 能将差异表达 基因扩增 千倍后富集, 具有 高效、灵 敏、操 作简单, 假阳性率低等特点, 已经越来越多的被应用在植物学研究领域。就该 技术的原理、特点 及其在植物 学方面的 应用研究进展作一简要介绍。
DNA 微阵列技术 DNA microarray
巨克隆技术 M egaclone
将基因片段、寡聚核苷酸、cDNA 等固定 在硅质、塑料、玻 璃或尼龙膜 上, 用不 同组 织或 来源 的 mRNA 制 成探 针, 与芯片杂 交, 根 据信 号 查找 差 异 片段 并 进行 克 隆 和分 析。 cDNA 连上不 同的标签 ( tag ) , 与 带有 antitag 的 microbeads 杂交, 固定 cDNA, 并 且每 个 microbead 上 只与 一个 c。
基因差异表达分析方法
Methods of different gene expression techniques
基本原理
The basic principles of different gene expression techniques
优点 Advantage
缺点 Disadvantage
mRNA 差异显示 PCR mRNA differential display
收稿日期: 2008- 08- 11 基金项目: 国家自然科学基金资助项目( 30671244) ; 河北省应有基础研究计 划重点基础研究 项目资助( 08965505D) ; 河北省自然科 学基金
抑制差减杂交技术原理及常见操作结果分析
将RsaI酶切完全的cDNA用adapter1和adapter2R两 种接头连接。通过PCR扩增检测连接效率。 PCR的引物根据RsaI位点和adapter1、adapter2R 的序列设计。这一般要求扩增的片段中不含RsaI 位点序列。在扩增后琼脂糖胶电泳检测结果中, 如果用一个基因特异性引物和一个接头引物所得 到的带亮度与两个基因特异性引物所得到的带的 亮度一致,说明连接较好;如果用一个基因特异性 引物和一个接头引物所得到的带亮度只有两个基 因特异性引物所得到的带的亮度的25%,则说明连 接效率不到25%,应检查RsaI酶切效果并重新连接。
3 抑制差减杂交技术的优缺点
3.1 与其他几种方法相比,SSH技术具有较明显的优越性: (1)通过两步消减杂交和两次抑制PCR可DDRTPCR和cDNA-RDA法中,低丰度的 mRNA一般不易被检测到,SSH方法所做的均等化和目 标片段的富集,保证了低丰度mRNA 也可被检测出。 (3)速度快,效率高。一次SSH反应可 以同时分离几十或成百个差异表 达基因。
抑制差减杂交技术原理 及常见操作结果分析
摘要
抑制差减杂交 (SuppressionSubtractiveHybridization,SSH)是一种 高效鉴定和分离克隆差异表达基因的新技术。 目前,该技术在分子生物学研究的各个领域得 到了广泛的应用作了较全面的介绍,可为研究者们 提供参考。
2.4 第一次杂交、第二次杂交和PCR扩增
将经RsaI消化的drivercDNA和分别连接有adapter1、 adapter2R的testercDNA混合进行第一次杂交。再将第一次 杂交的两个样本混合在一起,同时加入新鲜的drivercDNA, 以进一步富集差异表达序列。在两端具不同接头的差异 表达的cDNA形成新的杂交分子。
SSH protocol
1 PolyA+ mRNA的分离纯化PolyA+ mRNA的分离纯化采用Oligotex TM m RNA试剂盒(Qiagen公司)，首先确定总RNA的数量(OD260×40 µg/mL×稀释倍数×v)在250～500 µg之间，加无RNase的水至总体积为500 µL，然后再加入500 µL的Bufer OBB和30 µL的Oligotex悬液，通过吹打或轻弹使其充分混合。
在基因扩增仪上，70℃温浴样品3 min,(此时洗脱缓冲液OEB可一起预热)然后从水浴中将样品取出，室温(20--30℃)放置10 m in。
最大转速(140 00g )离心2m in，使Oligotex:mR NA的复合物沉淀，然后仔细的除去上清液。
保存上清液直到得到满意的结果。
用400 µL的洗涤缓冲液OW2通过涡旋振荡或吹打重悬Oligotex:mRNA沉淀，将重悬的样品加入到Small spin column(置于1.5 mL的离心管上)中，140 00g 离心1m in，然后将small spin column转移到一新的1.5 mL的无RNase的微量离心管中，再加入400 µL的洗涤缓冲液OW2于small spin cloumn,混匀，140 00g 离心1m in。
转移small spin column到一新的无RNase的1.5 mL的微量离心管中;取15 µL洗脱缓冲液OEB重悬Oligotex,14 0 00g 离心1m in。
将甩下的洗脱缓冲液OEB再重悬Oligotex,最高速离心，然后将甩下的洗脱缓冲液OEB转移至0.5 mL的离心管(无RNase )中，体积约10 µL左右。
重复洗脱三次，共计回收4管mRNA，最后几管测吸光值，看是否洗脱干净。
测OD 值，取1 µL 样品，加99 µL无RNase的水稀释，将样品从稀到浓进行OD260和OD280的测定，计算出mRNA的量(mRNA的含量>1 µg/µL). mRNA在洗脱液中可以贮存在-20 ℃或-70 ℃。
抑制性消减杂交技术介绍
M: ФX174-Hea Ⅲ消化。 1: 杂交骨骼肌肉tester二次PCR产物 2 : 未杂交的骨骼肌肉tester
18
G3PDH基因得到了极大的扣除
January 17, 2020
•
差异表达基因的富集与看家基因的扣除
以2ug/ml PHA和2ng/ml PMA处理72小时后的人类Jurkat T细胞的cDNA作 为Tester ，未处理的cDNA作为Driver。Tester cDNA、Driver cDNA及消减 后的cDNA扩增产物在1.5%的琼脂糖凝胶中进行电泳（每个孔上样量为 0.3ug）并转移到尼龙膜上，分别与已知活性的IL-2Rα基因和看家基因 G3PDH核酸探针进行杂交。
•
抑制后的应答基因 鉴定抗病毒相关基因 ......
6
January 17, 2020
•
抑制性消减杂交实验方法
正向消减
Tester
处理组
反向消减 Driver
Driver
7
非处理组
Tester
January 17, 2020
抑制性消减杂交
主要内容
1 抑制性差减杂交技术概 述
2 抑制性差减杂交原理
3 抑制性差减杂交流程
4
2
January 17, 2020
•
抑制差减杂交技术SSH
定义：抑制差减杂交（SSH）SSH 是一种基于抑制PCR和差减杂交 技术建立的,在转录水平上研究基 因表达的技术。
3
January 17, 2020
12
A, B, C, D
A B C
E
末端补齐
D
EE
January 17, 2020
•
实验流程
抑制性消减杂交：生成差异调控或组织特异性cDNA探针和文库的方法
Proc. Natl. Acad. Sci. USAVol. 93, pp. 6025–6030, June 1996Biochemistry抑制性消减杂交：生成差异调控或组织特异性cDNA探针和文库的方法L UDA D IATCHENKO*, Y UN-F AI C HRIS L AU†, A ARON P. C AMPBELL†, A LEX C HENCHIK*, F AUZIAM OQADAM*, B ETTY H UANG*, S ERGEY L UKYANOV‡, K ONSTANTIN L UKYANOV‡, N ADYA G URSKAYA‡,E UGENE D. S VERDLOV‡, AND P AUL D. S IEBERT*摘要一种高效消减cDNA文库构建的新方法，抑制性消减杂交（SSH），已被开发。
它是基于最近报道的抑制性PCR，并整合了常规和消减步骤。
常规PCR步骤使所有目标cDNA的丰度都达到同一水平，消减步骤则排除了检测子与驱赶子共有的序列。
在一个标准系统中，SSH技术能够在一轮消减杂交中富集稀有cDNA达1000倍以上。
我们通过构建一个睾丸特异性cDNA文库和用消减cDNA混合物作为杂交探针鉴定人类Y染色体粘粒文库中的同源序列证实了这一技术的有效性。
人类DNA在分离粘粒的插入，进一步确证了它在睾丸中特异性表达的方式。
这一结果表明SSH技术可应用于许多分子遗传和定位克隆研究，来鉴定疾病，发育和组织特异性或差异表达的基因。
正文在高等真核细胞中，例如细胞生长，器官形成等生物学过程都受控于基因表达的不同。
要弄清调控这些过程的分子机制，必须鉴定，克隆和深入研究相关的差异表达基因（1－3）。
消减cDNA杂交是鉴定和分离差异表达基因cDNA强有力的方法。
至今，已有大量的cDNA消减方法见于报端。
概括而言，它们都涉及用一种（检测子）cDNA与另一种（驱赶子）过剩的mRNA（cDNA）杂交，然后从杂交的共有序列中分离出不杂交的片断（目标片断）的方法。
SSH抑制性消减杂交文库构建方法介绍
SSH抑制性消减杂交文库构建方法介绍SSH抑制性消减杂交（Suppression Subtractive Hybridization，简称SSH）文库构建是一种用来富集和表达特定基因的方法。
它可以用于比较两种样品中的差异基因，以便进一步研究其功能和调控机制。
下面将介绍SSH文库构建的步骤及相关注意事项。
1.SSH文库构建的原理：SSH文库构建过程中，通过对目标样品和参考样品进行两轮的杂交和选择，可以移除两者之间相似的序列，从而富集出两者之间差异的序列。
这是通过抑制性消减和杂交的方式实现的。
第一轮杂交可以提取出高表达的差异基因，第二轮杂交可以进一步筛选出表达量更低的差异基因。
2.SSH文库构建的步骤：（1）制备目标DNA和参考DNA：从目标样品中提取总RNA，合成cDNA；从参考样品中提取总RNA，合成cDNA。
（2）第一轮杂交：将目标cDNA和参考cDNA进行杂交。
可根据实验要求对目标和参考cDNA进行标记，如将目标cDNA用偶联荧光物标记为红色，参考cDNA用偶联荧光物标记为绿色。
（3）第一轮选择：通过差异表达的双链RNA（dsRNA）的特性，使用RNAse H酶将dsRNA降解，保留差异表达的单链RNA（ssRNA），并与固相矩阵连接。
（4）第二轮差异杂交：将第一轮杂交产物与参考cDNA进行杂交，反转标记荧光物，即将红色标记转为绿色，绿色标记转为红色。
（5）第二轮选择：采用同样的方法将差异表达的ssRNA连接到固相矩阵上。
（6）PCR扩增：对固相矩阵上连接的差异基因进行PCR扩增，得到SSH文库。
3.注意事项：（1）杂交温度和时间：根据不同实验需求，可以调整杂交温度和时间，以保证高效的结合。
一般来说，较高的温度（如68℃）可以提高特异性结合。
（2）选择条件：选择条件要严格控制，以保证只有差异表达的ssRNA被固定在固相矩阵上。
（3）PCR扩增条件：PCR扩增过程中，应根据实验需求选择适当的引物和PCR条件，以获得高效的文库扩增。
[转载]基因文库构建的过程、原理及方法
![[转载]基因文库构建的过程、原理及方法](https://img.taocdn.com/s3/m/75baf7f9162ded630b1c59eef8c75fbfc77d94c1.png)
[转载]基因⽂库构建的过程、原理及⽅法原⽂地址：基因⽂库构建的过程、原理及⽅法作者：蓝茶基因⽂库构建的过程、原理及⽅法1 cDNA ⽂库的构建1.1 cDNA ⽂库构建的基本原理与⽅法cDNA ⽂库是指某⽣物某发育时期所转录的全部 mRNA 经反转录形成的 cDNA ⽚段与某种载体连接⽽形成的克隆的集合。
经典 cDNA ⽂库构建的基本原理是⽤ Oligo(dT) 作逆转录引物，或者⽤随机引物，给所合成的 cDNA 加上适当的连接接头，连接到适当的载体中获得⽂库。
其基本步骤包括：RNA 的提取(例如异硫氰酸胍法，盐酸胍—有机溶剂法，热酚法等等，提取⽅法的选择主要根据不同的样品⽽定)，要构建⼀个⾼质量的 cDNA ⽂库，获得⾼质量的 mRNA 是⾄关重要的，所以处理 mRNA 样品时必须仔细⼩⼼。
由于 RNA 酶存在所有的⽣物中，并且能抵抗诸如煮沸这样的物理环境，因此建⽴⼀个⽆ RNA 酶的环境对于制备优质 RNA 很重要。
在获得⾼质量的 mRNA 后，⽤反转录酶 Oligo(dT) 引导下合成 cDNA 第1链， cDNA 第2链的合成(⽤RNA 酶 H 和⼤肠杆菌 DNA 聚合酶 I，同时包括使⽤ T4 噬菌体多核苷酸酶和⼤肠杆菌 DNA 连接酶进⾏的修复反应)，合成接头的加⼊、将双链 DNA 克隆到载体中去、分析 cDNA 插⼊⽚断，扩增 cDNA ⽂库、对建⽴的 cDNA ⽂库进⾏鉴定。
这⾥强调的是对载体的选择，常规⽤的是λ噬菌体，这是因为λ DNA 两端具有由12个核苷酸的粘性末端，可⽤来构建柯斯质粒，这种质粒能容纳⼤⽚段的外源 DNA。
1.2 cDNA 全长⽂库经典 cDNA ⽂库的构建虽然⾼效、简便，但⽂库克隆的⽚段⼀般较⼩，单个克隆上的 DNA⽚段太短，所能提供的基因信息很少，⼤多需要⼏个克隆才能覆盖⼀个完整的全基因的 cDNA。
为了克隆到真正的 cDNA 全长，建⽴富含全长的 cDNA⽂库具有重要意义。
抑制差减杂交
抑制差减杂交（SSH）抑制差减杂交技术运用了杂交二级动力学原理,即高丰度的单链cDNA在退火时产生同源杂交的速度快于低丰度的单链cDNA,在试验组(tester)和驱动组(driver)的cDNA变性后再复性的过程中,原来在丰度上有差别的单链cDNA达到均一化。
同时,由于试验组的cDNA在进行杂交之前等分的两份加有不同的接头,因此杂交时将产生5种不同类型的分子a、b、c、d和e(图1),当采用与两个不同接头序列互补的引物进行PCR扩增时,只有目标序列得到有效扩增,非目标序列因两端存在反向重复序列,退火时易产生类似”锅柄”的结构,无法与引物配对,扩增受到抑制。
抑制差减杂交(SSH)技术的主要步骤有:(1)cDNA的合成与酶切;(2)试验组cDNA分成两份,并与两个不同的接头连接;(3)试验组(tester)的cDNA与过量的驱动组(driver)cDNA杂交;(4)选择性PCR扩增与接头相连的试验组cDNA分子;(5)克隆PCR产物,构建差减文库;(6)筛选文库SSH方法一般只用于两个样品的差异比较分析,样品间的差异不宜太大或太小,而对于多个样品则无能为力,这在很大程度上限制了它的应用。
提取tester RNA的时期非常关键,选择使用该方法时,首先要根据不同的研究目的确定取材的最佳时期,取材时期不当将会给试验带来意想不到的困难,或许只得到很少几个差减克隆或根本得不到克隆,或得到一些非目的克隆。
从技术本身讲,提取的tester RNA和driver RNA及从中分离的mRNA的质量、限制酶的酶切效率、接头的连接效率、第二次PCR产物的转化效率及差减克隆的筛选方法等关系着验的成败。
另外SSH所需的起始RNA量较大,一般为几微克,对于一些珍贵稀有的不易获得足够RNA的材料要慎重使用。
SSH方法在研究植物基因的差异表达方面已得到有效应用,该方法在应用范围和深度上可进一步拓宽和加深:(1)利用SSH方法研究生物(如细菌和真菌等)和非生物逆境(如干旱和寒冷等)对植物的影响及生物与寄主植物的互作时,可进一步提早取材时期(如逆境诱导后的6小时或更早)和缩短取材间隔,以获得植物差异表达基因的表达动态和进行有关转录因子等方面的研究,进而获得植物与逆境互作的关键点,更好地理解其互作机制,为从分子水平上定向培育抗旱、抗寒、抗病等作物提供更可靠的理论依据。
抑制差减杂交法_SSH_及其在植物中的应用
e)才得以指数扩增 ,而 c类因一端有接头 ,另一 端无接头 ,只能线性扩增 ,形成牢固的“锅 - 柄 ” 结构 ,不能有效扩增 。第二轮 PCR 实际上为巢 式 PCR ,极大地提高了扩增的特异性 ,使得差异 表达目的基因片段大量富集 。
3 SSH 的技术评价
3. 1 主要优点 (1)假阳性率较低 。 SSH方法采用加接头和
然后各自与过量的 D river cDNA 变性后退火杂 交 ,这时得到 4种产物 a, b, c和 d。这种不充分 杂交使单链 cDNA 分子在浓度上基本相同 ,同时 由于 Tester cDNA 与 D river cDNA 的序列相同片 段大都形成异源双链分子 c,使得差异表达基因 得到第一次富集 。然后混合两份杂交样品 ,同时 加入过量的新的变性 D river cDNA 进行第二次差 减杂交 ,这次杂交进一步富集了差异表达 cDNA , 并形成了两个 5’端分别接有不同接头的双链分 子 e。杂交完全后 ,补平末端 ,加入合适引物 (即 部分接头 1和接头 2的单链寡核苷酸片段 )进行 两轮 PCR扩增 。第一次 PCR 是基于抑制反应 , 只有两端连有不同接头的双链 cDNA 片段 (如
39
山西农业科学 2007年 35卷第 4期
玉米 、小麦 、马铃薯 、大豆 、辣椒 、胡萝卜 、大麦 、棉 花 、康乃馨 、拟南芥 、甘蔗 、甜菜 、人参 、芒果 、灌 木 、梭梭 、橡胶树等多种植物 。
目前 , SSH方法在植物上的应用主要包括两 个方面 :一方面涉及植物的生长发育及组织特异 性研 究 。如 刘 军 等 [ 6 ] 以 水 稻 茎 尖 分 生 组 织 ( SAM )为对照材料 ,幼穗分生组织 ( pb / sb)为试 验材料 ,进行抑制性差减杂交 ,分离得到了 40个 水稻幼穗分生组织中特异表达或表达增强候选 基因 ; Kim M 等 [ 7 ]通过此技术分离得到了辣椒素 的生物合成相关基因 ; Feng DR 等 [ 8 ]也对水稻茎 尖分生组织和开花分裂组织的差异表达进行了 筛选 ; Kloos DU 等 [ 9 ]对甜菜根中表达的基因进行 了分离和鉴定 ; 常青山等 [ 10 ]同样应用此技术对 矮败小麦花药中特异表达的基因进行了研究 ;罗 志勇等也进行了人参皂苷生物合成相关基因的 筛选和鉴定 [11 ] ; 张雷等应用此项技术分离了胡 萝卜体细胞胚根发育相关基因 [ 12 ]等 。
抑制性消减杂交技术
抑制性消减杂交技术抑制性消减杂交(suppression subtractive hybridization, SSH)技术是一种鉴定、分离组织细胞中选择性表达基因的技术，其原理是以抑制性多聚酶链反应(PCR)反应为基础的cDNA 消减杂交技术。
通过合成两个不同的接头，连接于测试cDNA 片段的5’末端，达到选择性扩增差异性表达的cDNA 片段，抑制非目的cDNA的扩增。
该技术是Diatchenko 等1996年在抑制性PCR的基础上建立起来的cDNA消减杂交方法，它克服了DD法的假阳性较高和RDA法消减杂交轮次较多的缺点，十分适用于克隆分析造成某种特殊表型的目的基因及其功能。
抑制性消减杂交技术是一种以抑制性PCR 反应为基础，将标准化测试cDNA 单链步骤和消减杂交步骤合为一体的技术。
通过合成两个不同的接头，接于经限制性内切酶消化后的测试cDNA 片段的5’末端，将测试和驱动进行两轮杂交。
所谓抑制性PCR 是利用链内退火优于链间退火，使非目的序列片段两端的长反向重复序列在退火时产生“锅柄样”结构，无法与引物配对，从而选择性抑制非目的序列片段扩增。
抑制性消减杂交技术的基本实验过程如下。
首先，将要进行比较的两种组织或细胞来源的mRNA 样品反转录为cDNA，把含有目的基因的cDNA 称为测试(tester)，把参考cDNA 称为驱动(driver)，用同一种限制性内切酶Rsa I 切割，产生末端平头的片段，将测试cDNA 分为两份，每份连接不同的接头，即接头1(adaptor 1)和接头2(adaptor 2)。
接头为双链DNA 片段，且5’- 端均无磷酸基，这样保证只有接头中的长链可以与cDNA 的5’- 末端连接，两个接头含有可识别的序列. 接下来进行两次杂交。
第一次杂交每个测试里加入过量驱动，然后变性、退火，根据杂交动力学第二定律，即丰度越高的分子退火速度越快，因此测试cDNA与驱动cDNA相同片段大都形成异源双链分子，使得差异表达的单链分子得到富集。
抑制消减杂交SSH步骤
抑制消减杂交SSH步骤一、cDNA第一链的合成1、在0.5ml经DEPC处理过的离心管中分别加入tester和driver的mRNA各2 ug，然后加入1ul（10uM）随机引物（9mer），70℃温浴2min，然后迅速置于冰上放置2min，然后在每管中加入如下混合物：2、42℃反应1.5hr，然后将离心管置于冰上，终止cDNA第一链的合成，然后马上进行第二链的合成。
二、cDNA第二链的合成1、在已经合成好cDNA第一链的离心管中加入每管如下反应物，16℃反应2hr：2、加入2ul（6U）T4 DNA Polymerase，16℃反应30min。
3、加入20×EDTA/Glycogen Mix 4ul，以终止反应。
4、加入100ul 苯酚：氯仿：异戊醇（25：24：1）抽提，并沉淀出cDNA双链，溶解于50ul双蒸水中。
三、cDNA质量检测设计特异性引物，目标片段大小为427bp。
以反转录所得cDNA为模板，若PCR 扩增能得到目标片段，说明线粒体mRNA已经成功反转录。
四、Rsa I酶切双链cDNA1、tester和driver cDNA经37℃过夜酶切，酶切体系为：2、每管用2.5ul EDTA/Glycogen混合物终止反应。
3、加入50ul 苯酚：氯仿：异戊醇（25：24：1）抽提，并沉淀出酶切后的cD NA双链，溶解于5.5ul双蒸水中。
五、接头连接酶切消化的tester双链cDNA分为两份，一份与Adaptor 1连接，另一份与Ad aptor 2连接，具体步骤如下：1、取1ul酶切的tester ds cDNA用5ul ddH2O稀释；2、连接反应液（Ligation Master Mix）的制备如下：3、在两个EP管中分别加入如下试剂：4、在另一离心管中混合1.5ul tester1-1和1.5ul tester1-2，连接反应完成后即为本实验所需要的unsubtracted tester control 1-c；5、轻微离心，16℃过夜连接；6、加入1ul 20×EDTA/Glycogen Mix，终止反应；72℃温育5min使ligase失活；7、取1ul unsubtracted tester control 1-c，用1ml ddH2O稀释，该样品将用来进行PCR检测；8、所有样品放入-20℃保存。
镜像选择(MOS)：消除抑制性消减杂交文库中假阳性克隆的方法1
镜像选择（MOS）：消除抑制性消减杂交文库中假阳性克隆的方法摘要：抑制性消减杂交（SSH）是分离差异表达转录本最有力，最普遍的方法之一。
然而，SSH 方法构建的文库经常含有一些代表非差异表达转录本的背景克隆。
为克服这一困难，我们研究了一个简单步骤，能充分降低背景克隆的数目。
这一方法的是以存在于目标与背景cDNA 间的以下差异为基础的：各种背景克隆分子只单向对应于SSH中两种不同侧翼接头序列中的一种，而真正差异表达的cDNA片断同时具有两种侧翼接头序列。
本文描述的方法能够筛选因这类镜像分子杂交而数目增多的分子。
引言：研究许多生物学过程遗传特性最有力的方法是鉴定在这些过程中表达水平有所变化的基因。
抑制性消减杂交（SSH）（1，2）是差异表达基因鉴定中应用广泛，效率较高的一种基于PCR的方法（3－5）。
它的一个关键特征是在消减的同时标准化，后者可使消减群体中目标cDNA的丰度均等。
由此，能富集稀有的差异表达转录本达1000倍。
但SSH实验的成功应用受限于包括cDNA样本高度复杂和cDNA样本间差异（目标）基因数目少等因素。
SSH主要的缺点是在消减文库中存在一些代表非差异表达（冗余）cDNA的背景克隆。
某些较难的例子（如脊椎动物大脑样本）中，消减文库中背景克隆的数目可能超过目标克隆的数目。
尤其富有挑战性的问题是初步筛选过程中出现包括所谓的“假阳性”克隆在内的差异信号，但无法通过进一步仔细分析来确定。
为克服这一问题，我们研发了一个简单步骤，能充分降低SSH方法构建文库中背景克隆的数目。
材料与方法手术摘取E15.5和E13.5小鼠胚胎的端脑。
去除脑脊膜后，从剩余的脑组织（基本神经中枢、海马和嗅核）中分离皮质。
按文献（6）方法纯化总皮质RNA。
人骨胳肌polyA+RNA 购自Clontech(CA),φХ174 DNA购自Promega(WI)。
用模板转换技术（Smart TM PCR cDNA Synthesis Kit;Clontech）合成双链cDNA。
抑制性消减杂交技术主要包括如下几个基本步骤
抑制性消减杂交技术主要包括如下几个基本步骤：（1）双链cDNA合成与酶切：分别提取待比较的两组细胞mRNA（实验方tester、驱赶方driver），利用随机引物反转录为双链cDNA后，用四碱基识别酶如Rsa I或HindⅢ切割成平均大小为600 bp左右的平端片段；该酶约在44=256 bp处就有一个切点，一分子而来的双链cDNA经该酶酶切后，可产生数个片段，每个片段一般＜600bp，可防止长链cDNA 片段所形成的复杂结构对有效消减杂交的干扰。
（2）两次消减杂交：将tester cDNA分为两组，分别于其5'端上接上两种不同的具有一段反向末端重复序列的寡聚核苷酸、去磷酸化接头（adaptor1, adaptor2），以利于随后的选择性扩增。
接头设计特点：①接头是由一长链（约40余个核苷酸）和一短链（约10余个核苷酸）组成的一端是平端的双链DNA片段，而且双链的5′均无磷酸基团，保证了接头以唯一方向与cDNA片段连接，即接头长链的3′端与cDNA双链5′端连接；②接头长链外侧（约20余个核苷酸）序列与第一次PCR引物序列相同，内侧序列与第二次PCR引物序列相同；③在接头上含有T7启动子序列，并且含有内切酶识别位点，为以后该片段插入克隆载体提供酶切位点。
两组tester cDNA样品分别与过量的driver cDNA进行第一次杂交，得到a、b、c、d四型分子，使原来丰度不同的单链cDNA得到大量富集，两组产物另加上新变性的drvier cDNA再次杂交，这样就产生了两个5'端有两个不同接头的e型分子，这种e型分子正是tester较driver特异表达cDNA，填平粘性末端。
第一次杂交中，将过量的driver cDNA分别加入两份tester cDNA中，变性后退火杂交。
第一次杂交后有4种产物a、b、c、d：a是单链tester cDNA；b是自身退火的tester cDNA 双链；c是tester和driver的异源双链；d是driver cDNA。
抑制性减法杂交。
两组产物另加上 新变性的drvier cDNA再次杂交，这 样就产生了两个5’端 有两个不同接头的e 型分子，这种e型分 子正是tester较 driver特异表达 cDNA，填平粘性末 端 。
(4)两轮抑制性PCR (4)两轮抑制性PCR 两轮抑制性
以两个长接头序列 分别设计成内外两对引 利用PCR原理扩增， 原理扩增， 物，利用 原理扩增 基于PCR抑制效应的存 基于 抑制效应的存 在，只有那些代表了具 有差异表达的， 有差异表达的，且两端 同时接有不同接头的双 片段（ 型分 链cDNA片段（e型分 片段 子）才能在PCR中得到 才能在 中得到 以指数扩增， 以指数扩增，
• SSH流程： 流程： 流程
cDNA合成 Rsa I 酶切 接头连接
第一次PCR
第二次 差减杂交
第一次 差减杂交
第二次PCR
初步筛选
SSH流程
• 合成DNA 将Tester分成2等份，连接不同的接头， Driver不与接头连接 2份Tester分别与Driver混合，进行第一步 差减杂交 将2份第一步差减杂交的产物未经变性就混 合，进行第二步差减杂交 抑制性PCR扩增差异表达的序列
• 缺点
（1）SSH技术对其实材 料要求多 （2）SSH技术得到的 cDNA是限制酶消化的 cDNA，不再是全场 cDNA （3）所研究材料的差异 不能太大
SSH的应用范围
• 抑制差减杂交（SSH） 在转录水平上研究 基因表达的技术,具有稳定、高效、可靠的 特点,可对生物的生长、发育、衰老、死亡 等生命过程及生物或非生物逆境胁迫对生 物所造成的影响等进行全面、系统的分析。
(3)两次消减杂交 (3)两次消减杂交
将tester cDNA分为两组，分别于其5‘端上接上 两种不同的具有一段反向末端重复序列的寡聚核 苷酸接头,两组tester cDNA样品分别与过量的 driver cDNA进行第一次杂交，得到a、b、c、d四 型分子，使原来丰度不同的单链cDNA得到大量富 集，
紫花苜蓿铝胁迫抑制消减文库的构建和初步分析
农业生物技术学报 Journal of Agricultural Biotechnology 2007,15(5):805~809*基金项目：浙江省科技重点攻关项目(No.2006C22045)资助。
**通讯作者。
Author for correspondence.教授， 博导， 主要从事牧草种质培育和资源开发研究。
Tel:057186971930;Email:<ymwu@>. 收稿日期：20070130 接受日期：20070316 ·研究论文· 紫花苜蓿铝胁迫抑制消减文库的构建和初步分析 *夏卓盛 1,2 , 吴跃明 1 **, 李新伟 1, 李进军 1 , 李海庆 1 （1.浙江大学动物科学学院， 动物分子营养学教育部重点实验室, 杭州 310029；2.浙江省舟山市畜牧兽医局， 舟山 316000）摘要： 为了分离和鉴定铝诱导基因， 用前期水培试验筛选的紫花苜蓿( )小冠品种为材料， 以经过 40 滋mol/L 铝离子胁迫的紫花苜蓿幼根为实验方， 未胁迫的为驱赶方， 用抑制消减杂交法 （SSH ） 构建了一个紫花苜蓿铝胁迫消减文库。
菌 落PCR 显示插入片段在 250 ～1200bp 之间，文库质量良好。
通过对文库阳性克隆随机测序共得到 34个有效 EST 序列。
经 BLASTX 分析表明， 有 25个 EST 与GenBank 中其它序列有同源性， 9个 EST 未找到相似性较高序列。
其中有 1个 EST 编码 果胶甲酯酶， 该酶能催化果胶的甲氧酯水解产生果胶酸和甲醇， 产生游离羧基， 可能在细胞壁结合铝离子过程中发挥作用。
其 它24个EST 序列分别编码过氧化物酶、 钙依赖蛋白激酶、 蔗糖转化酶、 蛋白磷酸脂酶调节因子、 蛋白转运体、 细胞色素P450和 乙酰氨基己糖苷酶等， 这些蛋白涉及到植物体的抗氧化作用、 信号传导、 发育和能量代谢等多种生理过程， 是植物在多种胁迫 下均会出现的非特异性应答反应。
消减杂交技术
消减杂交技术通过对《干旱胁迫下黄檗幼苗c DNA消减文库的构建和分析》的试验的介绍，说明消减杂交技术的原理，以及技术流程。
试验摘要以干旱胁迫下的黄檗幼苗cDNA 为tester, 正常生长的黄檗幼苗cDNA为driver, 利用抑制性消减杂交技术(suppression subtractive hybridization, SSH)构建了干旱胁迫下黄檗幼苗的消减文库并对其进行了EST序列分析。
从消减文库中随机挑取20个阳性克隆, 提取质粒进行酶切和PCR鉴定, 显示文库克隆的重组率大于95%, 插入片段大小大部分集中在300~800bp之间。
随机挑取816个克隆进行测序, 得到265个基因。
将其进行同源性分析, 划分为16类。
获得了热激蛋白70、脱水响应蛋白(RD22)、通用胁迫蛋白、金属硫蛋白(MTII), 晚期胚胎丰富蛋白(LEA14)等44种与干旱胁迫相关的基因,它们涉及了植物的渗透调节、信号传递、转录调控、活性氧清除等方面。
本研究为抗逆基因克隆和系统研究干旱胁迫下黄檗基因的表达奠定了重要的理论基础。
黄檗(黄檗Phellodendron amuranse Rupr.) 又名关黄柏、黄波罗, 为芸香科黄檗属, 是第三纪古热带区系的孑遗植物。
是东北重要的珍贵阔叶树种。
从生活史看, 黄檗经历了从第三纪炎热到寒冷等一系列的气候变迁, 对自然界的非生物胁迫(如高温、干旱、寒冷)有很强的适应力。
材料与方法• 1.1 实验材料•黄檗种子采于牡丹江市, 用70%乙醇对种子表面除菌后, 4℃低温层积2个月, 播种在珍珠岩中, 25~30℃光照培养箱培养。
大约生长60 d左右对黄檗幼苗进行胁迫处理, 减小加水量使其相对水含量达到65%~70%(约6~7d), 未处理的作为对照。
处理后, 取幼苗叶片和茎干置于液氮中速冻, −70℃保存。
1.2实验方法• 1.2.1 总RNA提取和mRNA纯化•以干旱处理的黄檗幼苗为实验组, 未处理的为对照组。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
SSH抑制性消减杂交文库构建方法介绍
SSH是一项可以快速获取两个不同生物材料中差异表达基因的分子生物学技术，是快速筛选差异表达基因的有效方法，也是寻找新基因的重要手段。
该技术尤其适合以genome尚不完全清晰的物种或者以特殊材料为研究对象的科研工作者。
是基因芯片技术的有效补充。
基本流程:通过差减文库构建，文库验证和筛选（逆向斑点杂交），获得阳性克隆，对阳性克隆测序及生物信息分析，可判定差异基因的情况。
另外结合RACE技术可进一步克隆所获得的差异基因的cDNA全长序列，并可用Northern blot 或Real－Time PCR加以验证。
抑制性消减杂交文库技术
是一种革命性的差异表达基因筛选技术。
该方法结合了抑制性PCR和消减杂交技术，即御用PCR反应链内退火有限于链间退火的特点和分子杂交二级动力学原理，经过体系不断优化建立起来的快捷、有效的差异基因筛选方法。
与传统的DD—PCR、SAGE及cDNA—RNA等技术相比，具有低丰度mRNA富集效率高、假阳性低、灵敏度高重复性好等特点。
现已广泛应用于动植物发育和分化、疾病易感性差异、抗药性差异和组织（病理和正常样本）差异及微生物基因分型差异的研究。
技术方法成熟有效
不需要利用传统的物理方法对单链、双链cDNA进行分离。
只要目的序列存在，就能进行指数扩增，筛选出差异基因片段。
放大稀有转录本
本技术在同一操作下完成转录本丰度平衡和差减，在我们的模型实验中，稀有转录本至少被放大了5000倍，也就是说，利用本及时可以极大地增加获得表达差异地稀有转录本地可能性。
仅仅需要500ng的poly A＋RNA
与其他的消减杂交方法不同，应用抑制性消减杂交技术只需要0.5－2的poly A+ RNA 即可进行有效实验。
如果您只有极少量（50ng-100ng）的总RNA，我们可以通过poly A＋RNA的高保真线性放大技术来合成足量的cDNA来进行抑制性消减杂交实验。