一株产红色素酵母菌的初步鉴定及色素提取工艺探究

色素分为人工合成色素和天然色素两大类 ,在 实际生活中 应用 广泛 。由于 合成 色素 的安 全性 问 题 ,不少合成色素在各国允许使用的程度被大大限 制 ,尤其是在食品 、医药和化妆品行业 。而天然色素 与人工合成色素相比 ,有无毒 、安全性高 、色泽自然 鲜艳 、并有很高的营养价值和药理功能等优越性 ,日 益受到人们的重视和青睐 ,天然色素的提取和应用 已成为现今和未来发展的主要方向 [1 ] 。目前天然色 素主要是从植物 、动物和微生物细胞中获取 ,由于动 植物材料生长繁殖受季节 、气候 、产地等因素的影 响 ,原料不足 ,从中提取的色素价格昂贵 ,其应用受 到很大的限制 ;而利用微生物资源生产天然色素 ,克 服了动 植 物 原 料 的 诸 多 缺 点 , 并 且 易 于 实 现 工 业 化 [2 ] 。因此 ,采用微生物生产天然色素可望逐渐成为 天然色素来源的主流 。本论文对腌制风鸭中分离到 的一株产红色素酵母菌进行了分类鉴定 ,并对色素
荡器中操作 。
表 1 正交实验因素水平表
水平
1 2 3
A 乙酸体积分数 (%) 100 95 90
因素 B 浸提时间
(m in) 20 40 60
C固液比 ( g /mL )
1∶4 1∶6 1∶8
2 结果与分析
211 菌种鉴定结果
21111 酵母菌培养特征
2111111 平板培养特征 菌落呈粉红色 ,正反面颜色
摘 要 :从传统腌制风鸭中分离出一株产红色素的酵母菌株 ,根据 Lodder分类方法初步鉴定为瓶型酵母属 ,通过液体 发酵培养 ,用乙酸浸泡细胞能有效提取红色色素 ,通过正交实验对提取工艺进行优化 ,确定乙酸水溶液体积分数 90%、 浸提时间 40m in、固液比 1∶4 ( g /mL )能获得最佳提取效果 。 关键词 :鉴定 ,瓶型酵母属 ,色素 ,提取工艺 ,正交实验
A b s tra c t: A s tra in of ye a s t p rod uc ing re d p igm e n t w a s s e le c te d from the tra d itiona l c u re d d uc k, a c c o rd ing to L od d e r’s ta xonom y, it b e long e d to P ity rosp o rum 1 A fte r liq u id fe rm e n ta tion, the re d p igm e n t c ou ld b e e x tra c te d from the c e lls b y us ing a c e tic a c id 1 The op tim um c ond ition w a s ob ta ine d w ith o rthog ona l e xp e rim e n t1 The re s u lt s how e d tha t the p igm e n t c ou ld b e e x tra c te d e ffe c tive ly w he n the c onc e n tra tion of a c e tic a c id w a s 90% , e x tra c tion tim e w a s 40m in, ra tio of m a te ria l a nd s o lve n t w a s 1∶4 ( g /m L ) 1 Ke y wo rd s: id e n tific a tion; P ity rosp o rum ; p igm e n t; e x tra c tion; o rthog ona l e xp e rim e n t 中图分类号 : TS20113 文献标识码 : A 文 章 编 号 : 1002- 0306 (2008) 01- 0090- 03
113 色素提取方法
11311 细胞的获取 将 FY- 48 斜面菌种接种于发酵 培养基上 , 30℃下摇床培养 3d,离心分离 ( 3500 r /m in、 10m in) ,收集菌体 沉 淀 , 蒸 馏水 洗 涤 , 重 复操 作 2～3
次 ,获得不含发酵液的湿细胞 。
11312 类胡萝卜素快速检测法 [5 ] 取上述湿菌体 2～
3g,放入 10mL 3mo l /L 的盐酸中 ,加热至沸腾 ,立即冷
却 ,加入 15mL 丙酮和 5mL 石油醚 ,移入分液漏斗中 ,
用力摇动 ,再加 20mL 水 ,溶液分为两层 ,若有类胡萝
卜素 ,则上层醚液呈金红色 。
11313 色素提取及最大吸收波长的确定 向湿细胞
中添加纯乙酸溶液 (固液比 1 ∶4 ) ,在 30℃, 120 r /m in 的恒温水浴振荡器中浸泡 015h,离心分离得红色上
1 材料与方法
111 材料与设备
红色 FY48菌株 从成都某食品厂生产的传统 腌制风鸭中分离得到 ; YPD 培养基 葡萄糖 2%、蛋 白胨 2% 、酵母膏 1%、琼脂 1%、自然 pH , 112℃灭菌 20m in;葡萄糖蛋白胨培养基 蛋白胨 015%、葡萄糖 015%、磷 酸 氢 二 钾 012%、pH710～712, 112℃灭 菌 30m in; 麦 氏 培 养 基 葡 萄 糖 011%、琼 脂 115%～ 210%、氯 化 钾 0118%、醋 酸 钠 0182%、酵 母 浸 膏 0125% , 113℃灭菌 20m in; 麦芽汁琼脂培养基 1kg 大麦芽粉与 216L 水混合 , 45℃连续搅拌 3h,升温至 63℃维持 1h, 120℃高压蒸汽灭菌 15m in 后过滤 ,滤 液加水 稀释 至 10 波 林 (比 重 1104 ) , 加入 2%琼 脂 (w / v) , 110℃高压 蒸汽 灭 菌 15m in; PDA 培 养 基 200g马铃薯洗净去皮切碎 ,加水 1000mL 煮沸 015h, 纱布过滤 ,加入 10～20g葡萄糖和 17～20g琼脂 ,充分 溶解后趁热纱布过滤 , 121℃灭菌 20m in后倒平板 ;发
一致 ,边缘与中心颜色也一致 ,边缘整齐 ,不透明 ,表
面无褶皱 ,不反光 。
2111112 液体培养特征 培养液浑浊 ,无璞 (浮膜 ) 、
环 、岛形成 ,沉淀较松 。
21112 子囊孢子的检查 个体呈粉红色 ,且无绿色
个体 ,无子囊孢子形成 。
21113 掷孢子的检查 无掷孢子产生 。 21114 生殖方式检查 菌株为无性繁殖 ,一端芽殖
112 酵母鉴定方法 [3, 4 ]
11211 酵 母 菌 平 板 培 养 特 征 观 察 菌 株 活 化 : 将 FY- 48菌株移种至新鲜的麦芽汁琼脂斜面上 , 25～ 28℃培养 24h左右 ,然后再转种 2～3次 。取活化后的 FY- 48菌株以无菌操作方式点种 (等距离 3 点或中 央 1点 )于 YPD 固体培养基上 , 28℃培养 3d。观察 菌落颜色 、边缘形状 、透明度 、表面是否褶皱及是否 反光 。 11212 酵母菌液体培养特征观察 配制葡萄糖蛋白 胨培养 基 1000mL , 过 滤 并 分 装 于 三 角 瓶 中 , 每 瓶 50mL , 112℃灭菌 30m in,空白培养 1d后使用 。以无 菌操作方式将活化后的 FY- 48菌以每瓶两环的接种 量接种于上述三角瓶中 , 28℃培养 3d。观察培养液 的清浊度 ,是否形成璞 (浮膜 ) 、环 (沿管壁环形生长 ) 或岛 (液面漂浮分散的菌体 ) ,沉淀的松紧程度 。 11213 酵母子囊孢子形成的观察方法 1121311 产 孢 培 养 以 无 菌 操 作 方 式 将 活 化 后 的 FY- 48菌株划线接种于麦氏固体培养基上 (一般诱 生孢子的培养基较贫瘠 ,需加大接种量 ) , 30℃培养 1 周左右 。 1121312 制片染色 滴加 5%孔雀绿染色液 (孔雀绿 5g、蒸馏水 100mL ) ,染色约 1m in, 再用 95%乙醇脱 色 ,然后水洗 ,最后用 015%的番红 (番红 015g、蒸馏水 100mL )复染 ,水洗 ,晾干 。 1121313 镜检 在显微镜下观察是否有子囊孢子形 成 。若 有 , 则 子 囊 孢 子 呈 绿 色 , 菌 体 及 子 囊 呈 粉 红色 。 11214 掷孢子的检查 将 FY- 48 菌株在 PDA 培养 基平面上沿两条垂直直径划线接种 ,并将接种后的 培养皿倒置放入另一个稍大的培养皿中 ,底层的培 养基中也放有 PDA 培养基 ,并在培养基上放一个无 菌载玻片 。将两个培养皿扣紧 , 28℃培养 3～10d。若 有掷孢子产生 ,则释放的掷孢子将在下层培养基上 形成菌落 。取出载玻片上收集的掷孢子 ,进行显微 镜检查 。 11215 生殖方式 (无性生殖 )及真假菌丝检查 取活 化菌株 FY48,在 YPD 培养基上培养 ,在培养期间第 1、2、3d时 ,分别制片镜检 ,观察菌株生殖情况 ,有无 真假菌丝及裂生子 。
收稿日期 : 2007- 08- 07 3 通讯联系人 作者简介 :马诚 (1986- ) ,女 ,硕士研究生 ,研究方向 :食品生物技术 。 基金项目 : 四川省科技厅基础研究项目 (05JY029- 073) 。
90 2008年第 01期
的乙酸提取工艺进行了探讨 ,以期为微生物色素的 开发利用起到一定的推动作用 。
清液 ,用 TU - 1901 双光束紫外可见光光度计进行波
长扫描 ,测得最大吸收波长 。
114 正交实验方法
根据乙酸的弱酸性 [6 ] 以及未知色素性质的不确
定性 ,选择不同体积分数乙酸水溶液 、不同固液实
验 (见表 1) ,浸提均在 30℃, 120 r /m in的恒温水浴振
PH S- 2C型精密酸度计 上海雷磁仪器厂 ; 2002 型恒温水浴振荡器 常州国华电器有限公司 ; TU 1901双光束紫外可见分光光度计 北京普析通用仪 器有限责任公司 ;低速离心机 北京医用离心机厂 ; YXQ1L311400型电热立式蒸汽消毒器 四川射洪医 疗器械有限公司 ; YJ - 875B 垂直净化工作台 上海 阳光实验仪器有限公司 。