定量聚合酶链反应测定技术1
生化试验教材实验九：聚合酶链式反应
避免使用过期的试剂和仪器，以免影 响实验结果和造成安全隐患。
对于高温、高压、易燃、易爆、有毒 有害等危险品，应严格按照规定进行 管理和操作。
实验操作规范
01
在实验前应仔细阅读实 验步骤和注意事项，确 保对实验过程有充分的四种脱氧核苷酸， 即dATP、dCTP、dGTP和dTTP。
Taq DNA聚合酶
一种热稳定性的DNA聚合酶，负责 催化DNA的合成。
实验设备准备
01
02
03
04
PCR仪
提供PCR反应所需的温度循环 ，包括变性、退火、延伸等步 骤的温度设置和时间控制。
离心机
用于分离和纯化DNA、RNA 等生物分子。
结果验证与结论
结果验证
通过重复实验、使用不同引物或对 PCR产物进行测序等方法，验证结果 的可靠性和准确性。
得出结论
根据实验结果，可以得出关于基因表 达、变异或物种鉴定的结论。同时， 应注意结果的适用范围和局限性，以 及与文献报道的比较。
05 注意事项与安全
实验安全注意事项
实验前应穿戴实验服和防护眼镜，确 保个人防护措施到位。
移液器
精确移取和混合各种试剂。
显微镜
观察细胞和组织样本，以及 PCR扩增产物的大小和形态。
实验试剂准备
01
02
03
Buffer
一种化学试剂，用于维持 溶液的酸碱度和离子浓度， 以稳定酶的活性和促进酶 促反应的进行。
MgCl2
提供PCR反应所需的镁离 子，镁离子是Taq DNA聚 合酶的激活剂。
去离子水
环境和人体造成危害。
PCR检测技术(一) 模板
3.DNA聚合酶
目前PCR扩增中最常用的DNA聚合酶是TagDNA聚合酶，它是由水生栖热菌(Ther-masaquaticus)产生，热稳定性好，可耐94℃高温，在此温度下短时光内对活力无多大影响。最适反应温度为72℃,70℃催化核酸链延伸的速度是2800核苷酸/min，在100uL反应体系中普通用2单位，它的用量多少对PCR扩增效率及特异性有一定影响。除了TagDNA聚合酶外，近年来耐热的pfuDNA聚合酶也被广泛地用于PCR反应，此酶是山极端嗜热的激烈热球菌(Pyrococcusfuriosus)产生的DNA聚合酶，是迄今发觉的掺人错误率最低的耐热DNA聚合酶，但其延长速度比TagDNA聚合酶低550核苷酸/min；另外得到应用的还有一种rTthDNA聚合酶，因为PCR反应以DNA模板举行扩增反应，而rTthDNA聚合酶可将反转录和聚合作用融合在一起，挺直由其将RICA反转录后扩增出大量的DNA片段，因而可大大简化操作程序，提高效率。
TagDNA聚合酶往往会在DNA链3'末端加上非模板互补核苷酸，从而产生不易克隆的PCR产物。通过用其他DNA聚合酶(如T4DNA聚合酶)处理扩增产物，补平或除去突出末端可解决这一问题。
4．反应缓冲液
PCR反应中常用的反应缓冲液含10～50mmol/L(pH8.3～8.8)的Tris-HCl,50mmol/LKCl和1.5mmol/LMgCl2。反应缓冲液的pH至关重要，假如KCl浓度过高，则会抑制酶的活性。在反应中存在适当浓度的Mg2+至关重要，它是TagDNA聚合酶活力所必须的，并可影响PCR产物的特异性和产量、引物退火的程度、模板与PCR产物链的解离温度、引物的特异性、引物二聚体的形成以及酶的活性和精确性等。因为EDTA或磷酸根能影响Mg2+的浓度，所以应注重模板DNA溶液中的EDTA浓度和PCR反应中所加模板和引物的量以及dNTP浓度(dNTP可提供磷酸基团，从而影响Mg2+浓度)。要获得最佳反应结果，必需挑选合适的Mg2+浓度，普通为2～5mmol/L。
定量PCR 简介
定量PCR简介聚合酶链反应（polymerase chain reaction, PCR）是微量核酸扩增的有效工具，由于其灵敏、特异、快速等优点，在医学上已广泛应用与病毒、细菌病原体及遗传病、肿瘤的早期诊断。
随着PCR技术的发展，特别是病毒或肿瘤的治疗监测、疾病的诊断、机体基因表达调控方面，不仅需要检测其存在是否；而且还需要得知扩增前标本中的模板的数量，因而必须对PCR进行定量检测，即定量PCR技术，本文将对定量PCR的定量原理、技术类型以及相关进展方面综述如下：一、定量PCR的基本原理：在PCR实验条件下（Mg++、缓冲液、Taq酶、dNTP、引物、模板），经变性→退火→延伸的一个循环，引物在退火阶段与相应的模板结合，在延伸阶段进行复制，此时产物为：Yn=Yn-1×(1+Ev) ,Yn:n个PCR循环后PCR产物的分子数；Yn-1:为n-1个热循环后PCR产物的分子数；Ev:为扩增效率,0≤Ev≤1；若n个热循环中其Ev是一致的话，经n个循环后的扩增产物的分子数（Y）和反应物中原始分子数（X）之间关系，可描述为：Y=x×(1+ Ev)n。
1. 终点法定量原理：在最佳实验、循环次数n一定、Ev相同的前提下，根据扩增产物的量可以计数出反应物中原始分子数，若核酸提取效率相同（与标准品），进而计算出标本中靶分子的准确含量，即：lnx=lnY-n×ln(1+Ev)=lnY - b (b为常数)2. 实时检测法定量原理：在最佳实验、相同Ev以及相同扩增产物的情况下，反应物中原始分子数（X）与其所需要的扩增循环次数（n）成反比，若核酸提取效率相同（与标准品），进而计算出标本中靶分子的准确含量，即：LgX=LgY–n×Lg(1+Ev)=b - n×a (a、b为常数)3. 扩增效率（Ev）的影响因素：以上所述的定量原理均假定反应体系中扩增效率是不变，但是，实际上，Ev在不同的扩增管之间和同一扩增管的不同循环次数之间是不同，如何控制及解决Ev的变异以及标本制备的可靠性是PCR定量的可靠性所在，也是定量PCR的发展方向，那么，Ev的影响因素有：a. 引物和靶序列的结合能力（G+C%及突变），扩增产物的长度，G+C含量。
rtpcr步骤及原理
rtpcr步骤及原理RTPCR步骤及原理摘要：反转录聚合酶链反应（RTPCR）是一种常用的分子生物学技术，用于定量检测RNA或DNA中特定序列的数量。
本文将介绍RTPCR的步骤和原理，包括反转录、PCR扩增和结果分析等方面。
同时也会讨论RTPCR的优点、限制和在科研和临床中的应用。
引言在生物医学研究和临床实践中，准确测定RNA或DNA中特定基因或序列的表达水平或存在数量是非常重要的。
反转录聚合酶链反应（RTPCR）是一种被广泛应用的技术，能够对目标序列进行定量和扩增。
一、反转录反转录是RTPCR的第一步，也是从RNA到cDNA的转录过程。
这一步骤利用反转录酶将RNA模板转录成互补的cDNA。
反转录的关键是一条RNA模板和逆转录酶的结合，逆转录酶能够将RNA依据其互补碱基配对的原则合成cDNA。
反转录需要一些关键的试剂，如RNA模板、逆转录酶、引物和dNTPs等。
RNA模板是目标序列的来源，逆转录酶则是反转录的关键酶。
引物是用于使逆转录酶能够开始合成cDNA运输链的小片段，而dNTPs则是逆转录酶用来合成cDNA的原料。
二、PCR扩增PCR扩增是RTPCR的第二步，也是从cDNA扩增目标序列的过程。
PCR扩增是利用聚合酶将靶DNA序列经过多次循环扩增成数量可检测的水平。
PCR扩增需要两个引物，一个用于标记出序列的起始点，一个用于标记出序列的终止点。
PCR扩增需要通过一系列的循环反应来不断扩增目标序列。
每个循环有三个关键步骤：变性、退火和延伸。
变性是通过高温来使DNA 的两个链分离，退火是通过低温使引物与靶序列结合，延伸则是通过温度合适的聚合酶来合成新的DNA链。
三、结果分析RTPCR的结果分析可以通过几种不同的方法进行，最常见的是凝胶电泳和实时定量PCR。
凝胶电泳是一种常见的分离DNA片段的方法，可以将PCR扩增的产物根据大小分离成不同的带状，在凝胶上的迁移速率还可以推测出片段的大小，并对扩增的特定基因进行定性和定量分析。
聚合酶链反应技术
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y
y
图6-2-1 n
图6-2-2 n
y=A2n
y=A(1+R)n
图6-2 PCR扩增效率图
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三、PCR反应体系 ★
• 反应组成： （五要素）
– 模板（template）
• DNA
基因组DNA 质粒DNA
• RNA ： 总 RNA 、 mRNA 、 tRNA 、 rRNA 、 病 毒 RNA
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主要内容
第一节 聚合酶链反应技术的原理 第二节 聚合酶链反应技术的常见问题及体系优化 第三节 聚合酶链反应技术的方法发展及相关技术 第四节 荧光定量聚合酶链反应技术 第五节 聚合酶链反应方法的标准化
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第一节 聚合酶链反应技术的原理
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一、聚合酶链反应技术的简史
assay) • 荧光PCR
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(一)聚丙烯酰胺凝胶电泳特点及用途
• 特点： – 分辨力高，长度仅相差1bp的DNA分子即可分开； – 上样量远大于琼脂糖凝胶； – 回收的DNA纯度高； – 采用银染色DNA或RNA，灵敏度高，比琼脂糖凝 胶电泳中EB染色法高2-5倍，而且避免EB易退色 的弱点。
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模板DNA 94℃变性 55℃退火
72℃引物延伸 第二次循环
模板变性退火
延伸
经25-30次循环，目的DNA增加106-7
图6-1 PCR原理示意图
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PCR的基本原 理
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高温变性 低温退火 适温延伸
实时荧光定量PCR技术
荧光定量PCR过程
一 体系配制
组分名称 10×buffer（Tri-Hcl、 ( NH4)2SO4、K+、Mg2+等） 作用 缓冲液-提供反应环境
引物mix
探针mix Taq酶（10U/ul） UNG酶（1U/ul） dNTPs（dATP、dTTP、 dCTP、dGTP、dUTP）20mM H2O
四 数据分析
• 从核酸的提取到实验结果的获得，中间的步骤繁多，因而影响反应的因 素也很多，主要包括：反应体系，模板的浓度与纯度，Mg2+浓度，引物 与探针的浓度，反应循环数，Taq酶活性，扩增程序等。因而实验结果 也会出现各种各样的问题，主要包括：信号强度低，扩增效率低，特异 性低，体系稳定性差等。
• 反应过程
MGB探针
• 新型TaqMan探针，其3`端采用了非荧光性的淬灭基团，吸收报告基团的 能量后并不发光，大大降低本底信号的干扰。此外MGB探针3`端还连接 了一个小沟结合物--二氢环化吲哚卟啉-三肽，可以大大稳定探针与模 板的杂交，提高探针Tm值，使得较短的探针也能达到较高的Tm值，淬灭 效果更好，荧光背景更低。
TaqMan探针
利用Taq酶的5`外切活性，即Taq酶具有天然的5`-3`核酸外切酶活性 ，能水解双链DNA 5`端的核苷酸。 依据目的基因设计一条能与之特异杂交的探针，5`端标记报告基团 Reporter，3`端标记淬灭基团Quencher，正常情况下两个基团的空间距离 很近，构成FRET关系，荧光基团信号被淬灭。PCR扩增时，引物与探针结 合到模板上，探针位于上下游引物之间。当扩增延伸到探针结合的位置时 ，Taq酶利用5`-3`外切酶活性，将探针5`端连接的荧光分子从探针上切割 下来，破坏了两个荧光分子的FRET关系，从而发出荧光。
rt-pcr结果判读标准
实时定量聚合酶链反应（Real-time Quantitative Polymerase Chain Reaction，简称RT-qPCR）是一种用于检测和定量RNA表达水平的高灵敏度技术。
RT-qPCR结果的判读通常遵循以下标准：1. 阈值循环（Threshold Cycle，Ct值）：- Ct值是指达到检测阈值时的循环次数，它反映了样本中目标RNA的初始浓度。
- Ct值越低，表示目标RNA的浓度越高。
-通常，Ct值低于某个特定值（如30或35）被认为是阳性结果，高于这个值则认为是阴性结果。
2. 相对表达量：-相对表达量是通过比较不同样本的Ct值来计算的，通常使用2^(-ΔCt)的方法，其中ΔCt是目标基因与内参基因Ct值之差。
-相对表达量大于1表示目标基因的表达量高于参照样本，小于1则表示表达量低于参照样本。
3. 标准曲线和溶解曲线：-标准曲线是通过一系列已知浓度的标准品来建立的，用于校正实验中的技术变异，并确保目标RNA的准确定量。
-溶解曲线用于评估扩增产物的一致性和特异性，通常在扩增结束后进行。
4. 内参基因：-内参基因是用于校正样本间RNA提取效率差异的基因，其表达量通常不受实验条件影响。
-选择合适的内参基因对于正确解读RT-qPCR结果至关重要。
5. 数据分析：-数据分析时，应考虑实验的重复性、样本间的变异性和统计学显著性。
-应使用适当的统计测试来确定结果是否具有统计学意义。
6. 质量控制：-质量控制包括检查RNA的完整性、纯度和浓度，以及PCR扩增的效率和特异性。
-应使用阴性对照和阳性对照来验证实验的准确性和可靠性。
在判读RT-qPCR结果时，应综合考虑上述标准，并结合实验的具体情况和目的进行综合分析。
聚合酶链式反应分析仪校准规范
国 家 质 量 监 督 检 验 检 疫 总 局 发布
聚合酶链反应分析仪校准规范
Calibration Specifications
for Polymerase Chain Reaction Analyzer
J J F ×××× – ××××
本规范经国家质量监督检验检疫总局于××××年××月××日批 准，并自××××年××月××日起施行。
1
JJF××××——××××
3.6 温度波动性 Temperature volatility
温控装置（如加热模块）在一定时间间隔内，温度变化的范围。
3.7 定量示值误差 Quantitative error of a measuring instrument
DNA标准物质仪器测量值与标称值之间的一致程度。
jjf中华人民共和国国家计量技术规范jjf聚合酶链反应分析仪校准规范calibrationspecificationsforpolymerasechainreactionanalyzer发布实施国家质量监督检验检疫总局发布聚合酶链反应分析仪校准规范jjfcalibrationspecificationsforpolymerasechainreactionanalyzer本规范经国家质量监督检验检疫总局于年月日批准并自年月日起施行
3
JJF××××——××××
由若干个（通常为15个）精密温度探头、传感器、数据采集分析模块组成，探头测
温在（0~120）℃范围内，温度精度不低于0.01°C，且需要进过计量校准。
7.2.2 标准物质 DNA 标准物质：1.41E+14copy/ul（BW3638）。
8 校准项目和校准方法
8.1 校准项目
[2] SN/T 2102.2—2008/ISO 20836:2005 食源性病原体PCR检测技术规范 第2部分： PCR性能试验要求。
荧光定量和数字pcr-概述说明以及解释
荧光定量和数字pcr-概述说明以及解释1.引言1.1 概述概述荧光定量PCR（Polymerase Chain Reaction）和数字PCR（Digital Polymerase Chain Reaction）是现代分子生物学研究中广泛应用的两种重要技术。
它们在检测和定量分析目标DNA或RNA的过程中具有很高的灵敏度和准确性。
荧光定量PCR技术基于传统PCR的原理，通过引入一个与特定目标序列相匹配的荧光探针，实现了对PCR扩增产物进行实时监测和定量分析。
该技术不仅可以快速准确地检测目标基因的存在与否，还可以测量目标基因在样本中的相对表达水平。
荧光定量PCR 被广泛应用于疾病诊断、基因表达分析、病原微生物检测等领域。
数字PCR是一种相对较新的PCR技术，它通过将PCR反应液样品分割为大量微型反应容器，每个容器中只有一个目标DNA分子或没有DNA 分子，然后在每个反应容器中进行PCR反应，最终通过统计正反应容器的数目来计算目标DNA的起始拷贝数。
相比于传统的荧光定量PCR，数字PCR具有更高的灵敏度和准确性，并且可以排除样本中的任何潜在干扰物质。
本文将重点介绍荧光定量PCR和数字PCR的原理和应用。
首先将介绍荧光定量PCR的基本原理，包括扩增反应、荧光信号生成以及实时监测和定量分析的原理。
随后会详细探讨荧光定量PCR在疾病诊断、基因表达分析和病原微生物检测等领域的应用，并举例说明其在科学研究和临床实践中的重要性。
接着，我们将转向数字PCR技术。
我们将解释数字PCR与传统PCR 的不同之处，并详细介绍数字PCR的原理和操作步骤。
同时，我们还将详细讨论数字PCR在DNA拷贝数变异检测、稀有基因突变筛查和细胞无创诊断等方面的应用，并展示其在生命科学研究中的潜在价值。
最后，我们将总结荧光定量PCR和数字PCR的优势，并展望未来发展方向。
这两种PCR技术在遗传学和临床医学研究中具有广阔的应用前景，随着技术的不断进步和创新，我们有理由相信荧光定量PCR和数字PCR 将会为我们揭示更多的生命奥秘，为疾病的早期诊断、治疗和预防提供更可靠的科学依据。
Q-PCR技术
使用竞争性内标准的定量PCR方法
“竞争性”内标：人为构建的可与原始靶核酸竞争 酶、核苷酸和引物分子的核酸标准，其特点是， 与靶核酸具有相同的引物结合位点、但引物之间 的顺序需加以修饰，使得扩增产物在检测时能够 很容易地通过诸如凝胶电泳、探针杂交或高效液 相层析等方法区分。
测定方法极为关键。合适的非竞争性内标应为在 整个细胞周期中均匀表达的基因核酸，而竞争性 内标则应尽可能近似原始待测模板。 4.定量测定应在扩增的指数期进行，因此，更重要 的是要使涉及整个扩增过程的每个参数都理想化， 以便控制整个扩增，避开扩增“平台期” 。
总结
5.由样本制备（核酸提取）方法所引起的定 量测定的差异应仔细研究加以避免。
高浓度/高效率 高浓度/低效率 低浓度/高效率
N : 扩增分子的数 目
n : 扩增循环的次 数
n
定量PCR与定性PCR测定的最根本的区别
定量PCR测定的测定点为PCR扩增的指 数扩增期;而定性PCR测定的测定点则多为 PCR扩增的平台期。
定量PCR的方法
定量PCR方法可归为三大类，即外标方法、 动力学方法和内标共扩增方法
PCR及有关技术的发展历史（3）
1987 当年7月Cetus 公司在美国获得PCR基本技术
专利批准。 成立于1985年底的Perkin-Elmer Cetus仪器公
司 （ PECI ） 于这一年的11月推出了第一 个PCR 试剂产品及第一台热循环仪。
1989 Science 报道了耐热性DNA多聚酶 Taq 酶的 发现,预示着分子时代的到来。12月《Science》杂 志将PCR和它所使用的聚合酶命名为第一个“年 度分子”。 Hoffmann-La Roche 公司和Cetus 开 始合作将 PCR应用于临床诊断 。
实时荧光定量聚合酶链反应技术
实时荧光定量聚合酶链反应技术实时荧光定量PCR（real-time quantitative PCR）是实时荧光PCR（real-time PCR）的一种。
实时荧光PCR是指在PCR反应体系中加入可以反映PCR扩增进程的荧光基团，并在PCR过程中实时监测荧光信号的变化。
实时荧光定量PCR技术则是将定量PCR的原理应用到实时荧光PCR，通过在实时荧光定量PCR的基础上引入已知浓度的参照基因，或者通过标准曲线来达到对目的基因初始浓度的定量，换句话说，实时荧光定量PCR是指在PCR反应体系中加入荧光基团（如荧光染料、荧光基团标记的探针或引物），并在整个PCR进程中实时监测荧光信号的累积，最后通过参照基因或标准曲线对未知浓度的模板进行定量分析。
实时荧光定量PCR是20世纪90年代初期快速发展起来的可对起始DNA模板浓度精确定量的PCR方法。
在实时荧光定量PCR技术的发展进程中，两个重要的发现起着关键的作用：①在20世纪90年代早期，Taq DNA多聚酶的5′核酸外切酶活性的发现，它能降解特异性荧光记探针，因此使得间接的检测PCR产物成为可能；②此后，荧光双标记探针的运用使在一密闭的反应管中能实时地监测反应全过程。
随着实时荧光定量PCR技术方法的成熟与稳定，以及配套仪器的不断完善，实时荧光定量PCR已经走向临床，如应用于各种病原体的检测。
一、定量PCR的原理与类别定量PCR是指以参照物为标准，对PCR终产物进行分析或对PCR过程进行监测，从而达到评估样本中靶基因的拷贝数。
定量PCR的可行性定量一般是在PCR扩增的指数期进行。
根据PCR扩增过程中是否加入某种标记物、标记物的种类和最后检测的信号的不同可分为至少4种类型：直接定量检测法、放射性核素标记定量检测法、酶标记定量检测法和实时荧光定量PCR法。
根据反应体系是否设有参照物及其是否与标本在同一管中进行扩增，定量PCR可分为4种方法：（一）有限稀释法也叫倍比稀释法，其参照品的浓度是通过不断稀释直至靶基因不能再扩增为止，然后根据阳性结果的最大稀释度及内参标或外参标的极限检出底线，计算出待检标本中原始模板的分子数。
QPCR实验报告
QPCR实验报告一、实验目的本实验旨在通过实时荧光定量聚合酶链式反应（QPCR）技术，对特定基因的表达水平进行定量分析，以探究其在不同实验条件下的变化情况。
二、实验原理QPCR 是一种基于 PCR 技术的核酸定量方法。
在 PCR 反应体系中加入荧光染料或荧光标记的探针，随着 PCR 反应的进行，荧光信号不断累积。
通过检测荧光信号的强度变化，可以实时监测 PCR 反应的进程，并根据标准曲线对未知样品中的核酸浓度进行定量。
三、实验材料与设备1、实验材料提取的总 RNA 样品反转录试剂盒特异性引物QPCR 试剂盒2、实验设备实时荧光定量 PCR 仪离心机移液器微量核酸定量仪四、实验步骤1、 RNA 提取从细胞或组织中提取总 RNA，使用微量核酸定量仪测定 RNA 的浓度和纯度。
2、 cDNA 合成以提取的 RNA 为模板，使用反转录试剂盒合成 cDNA。
3、 QPCR 反应体系配制根据试剂盒说明书，配制 QPCR 反应体系，包括引物、cDNA 模板、PCR 反应液等。
4、 QPCR 反应将配制好的反应体系加入到 PCR 反应管中，放入实时荧光定量PCR 仪中进行反应。
反应条件通常为：95°C 预变性 30s，然后进行 40个循环，每个循环包括 95°C 变性 5s，60°C 退火/延伸 30s。
5、数据分析反应结束后，使用 PCR 仪自带的软件分析荧光数据，得到 Ct 值（Cycle threshold，循环阈值）。
根据标准曲线计算样品中目的基因的相对表达量。
五、实验结果1、标准曲线以不同浓度的标准品进行 QPCR 反应，绘制标准曲线。
标准曲线的线性关系良好，R²值大于 099，表明定量结果可靠。
2、样品检测结果实验样品中目的基因的 Ct 值如表 1 所示。
｜样品编号|目的基因 Ct 值|｜｜｜｜1|＿____|｜2|＿____|｜3|＿____|根据标准曲线和样品的 Ct 值，计算得到目的基因在不同样品中的相对表达量，结果如表 2 所示。
q-pcr的基本原理和应用
q-PCR的基本原理和应用1. 基本原理q-PCR（quantitative polymerase chain reaction，定量聚合酶链反应）是一种用于快速测定DNA或RNA中特定序列数量的技术。
它结合了PCR技术和荧光探针技术，通过荧光信号的增强和测量来确定目标序列的相对数量。
q-PCR的基本原理包括以下几个步骤：1.DNA或RNA的提取和纯化：从样品中提取目标DNA或RNA，并经过纯化步骤以去除杂质。
2.逆转录（RT）或DNA扩增：将提取的RNA逆转录为cDNA（逆转录PCR）或直接扩增DNA（DNA PCR）。
3.荧光探针引物的设计：设计用于特定目标序列的引物和荧光探针，探针上带有荧光物质和一个与目标序列互补的DNA序列。
4.PCR扩增：将逆转录的cDNA或DNA与引物和荧光探针一起加入PCR反应体系中，进行多轮的温度循环扩增。
每一轮循环包括DNA的解旋、引物与模板DNA的结合、DNA合成。
5.荧光信号的检测：在每一轮循环中，荧光探针与目标序列特异性结合，荧光信号量增加。
荧光信号在每一轮循环后进行检测和记录。
6.数据分析：通过测定荧光信号的增加速率和信号量来确定目标序列的相对数量。
根据荧光信号的阈值周期数（Ct值），计算目标序列的表达量或拷贝数。
2. 应用q-PCR在生物学研究和临床诊断中有着广泛的应用，主要包括以下几个方面：•基因表达分析：q-PCR可以 quant化目标基因在不同样本或条件下的表达水平，用于研究基因调控、细胞分化和发育等生物学过程。
•病原体检测：q-PCR可以快速、准确地检测和诊断病原体感染，如病毒、细菌和真菌等。
通过检测特定基因序列的存在与否，可以确定样品中是否存在病原体。
•肿瘤检测和诊断：q-PCR可以检测肿瘤相关基因的突变和表达水平变化，用于肿瘤的早期筛查、诊断、预后评估和治疗监测。
•遗传疾病诊断：q-PCR可用于检测遗传疾病相关基因的突变或拷贝数变异。
通过定量分析目标序列的拷贝数，可以确定遗传疾病的诊断和携带状态。
聚合酶链式反应(PCR)基本操作步骤
聚合酶链式反应（PCR）聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction，PCR）是体外酶促合成特异DNA片段的一种方法，为最常用的分子生物学技术之一。
典型的PCR由（1）高温变性模板；（2）引物与模板退火；（3）引物沿模板延伸三步反应组成一个循环，通过多次循环反应，使目的DNA得以迅速扩增。
其主要步骤是：将待扩增的模板DNA置高温下（通常为93℃-94℃）使其变性解成单链；人工合成的两个寡核苷酸引物在其合适的复性温度下分别与目的基因两侧的两条单链互补结合，两个引物在模板上结合的位置决定了扩增片段的长短；耐热的DNA 聚合酶（Taq酶）在72℃将单核苷酸从引物的3’端开始掺入，以目的基因为模板从5’→3’方向延伸，合成DNA的新互补链。
PCR能快速特异扩增任何已知目的基因或DNA片段，并能轻易在皮克（pg）水平起始DNA混合物中的目的基因扩增达到纳克、微克、毫克级的特异性DNA片段。
因此，PCR 技术一经问世就被迅速而广泛地用于分子生物学的各个领域。
它不仅可以用于基因的分离、克隆和核苷酸序列分析，还可以用于突变体和重组体的构建，基因表达调控的研究，基因多态性的分析，遗传病和传染病的诊断，肿瘤机制的探索，法医鉴定等诸多方面。
通常，PCR 在分子克隆和DNA分析中有着以下多种用途：(1) 生成双链DNA中的特异序列作为探针；(2) 由少量mRNA生成cDNA文库；(3) 从cDNA中克隆某些基因；(4) 生成大量DNA以进行序列测定；(5) 突变的分析；(6) 染色体步移；(7) RAPD、AFLP、RFLP等DNA多态性分析等。
一、试剂准备1. DNA模版2．对应目的基因的特异引物3．10×PCR Buffer4．2mM dNTPmix：含dATP、dCTP、dGTP、dTTP各2mM5．Taq酶二、操作步骤1．在冰浴中，按以下次序将各成分加入一无菌0.5ml离心管中。
定量逆转录-聚合酶链反应(RT-qPCR)
定量逆转录-聚合酶链反应（RT-qPCR）一、实验原理逆转录-聚合酶链反应(Quantitative Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction，RT-qPCR)的原理是：提取组织或细胞中的总RNA，以其中的mRNA作为模板，采用Oligo （dT）或随机引物利用逆转录酶反转录成cDNA，再以cDNA为模板进行PCR扩增，而获得目的基因或检测基因表达。
二、实验步骤（一）总RNA提取1.Trizol裂解收集各处理组细胞于1.5ml离心管，用PBS缓冲液洗涤1次，每5～10×106个细胞加入1ml Trizol，吹打数次，使细胞充分裂解，室温静置5min。
（裂解后若不能及提取RNA，可在加入Trizol后，将其保存于-80℃）2.氯仿（三氯甲烷）萃取（1）每管加入200ul氯仿（Trizol :氯仿= 5 : 1），盖好离心管后，涡旋震荡15s后，放置室温静置2min。
（2）4℃、12000rpm条件下离心15min后，溶液分为上、中、下3层，上层为水相（无色透明，含RNA），下层为有机层（粉红色，含DNA和蛋白质等）。
3.异丙醇沉淀（1）吸取上层水相（约500μL）至RNase-free离心管中。
（不要吸到中间层）（2）加入500μL异丙醇（与上层水相等量），颠倒混匀数次。
（不要剧烈摇晃）（3）4℃、12000rpm条件下离心15min后，吸弃上清液，保留底部白色沉淀。
4.75%乙醇洗涤沉淀（1）加入1mL 75%乙醇（现配现用，DEPC水:无水乙醇= 1:3，配制后上下颠倒混匀）洗涤沉淀，涡旋震荡。
（2）4℃、12000rpm条件下离心5min后，吸弃上清液，将离心管开盖干燥10min。
5. RNA干燥溶解每管加入50μL DEPC水，盖好离心管后，敲打溶解。
（二）RNA浓度和纯度检测1.提前10min对酶联免疫分析仪进行预热。
2.用DEPC水洗涤微量比色皿。
定时定量pcr的名词解释
定时定量pcr的名词解释引言：定时定量PCR（quantitative real-time PCR，qPCR）是一种生物学实验技术，被广泛应用于基因表达、病原体检测、遗传变异分析等领域。
本文将对定时定量PCR进行名词解释，介绍其原理、应用范围和优势。
1. 定时定量PCR的原理定时定量PCR是基于聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）的一种改进技术。
PCR是一种能够迅速复制DNA的方法，通过引物和DNA聚合酶的配合作用，使DNA模板在不断经历多轮的加热与退火过程，最终产生大量的复制片段。
定时定量PCR借助特殊的荧光技术，实现了PCR反应的实时监测和定量分析。
在反应过程中，荧光信号与DNA量的增加成正比，可通过荧光信号的变化来测定反应过程中DNA的扩增量。
2. 定时定量PCR的应用范围2.1 基因表达研究定时定量PCR广泛应用于基因表达研究中，可以测定不同条件下基因的表达水平，了解基因调控机制。
研究人员可通过定时定量PCR分析特定基因在细胞、组织或器官中的表达差异，从而揭示与疾病发生发展相关的分子机制。
2.2 病原体检测定时定量PCR在病原体检测中的应用越来越广泛。
通过设计特异性引物和探针，可以快速、准确地检测细菌、病毒和寄生虫等病原体。
定时定量PCR的高灵敏度和高特异性，使其成为常用的病原体检测方法，为临床诊断和疾病监测提供了强有力的工具。
2.3 遗传变异分析定时定量PCR还可用于遗传变异分析，比如SNP（single nucleotide polymorphism）分型和突变检测。
通过设计特异性引物和探针，可以准确捕获某一具体位点的变异，并进行定量分析。
这种方法在遗传疾病诊断、个体化药物治疗和DNA亲子鉴定等领域具有重要意义。
3. 定时定量PCR的优势3.1 高灵敏度和高特异性定时定量PCR可以精确测定样品中含有的目标DNA或RNA分子的数量，其高灵敏度和高特异性使其成为许多实验室首选的技术。
人微小病毒B19荧光定量聚合酶链式反应检测方法的建立
Abstrvch: Objective To establish c flrorescedi qrantitative polymerase ciain reactiou detea-
tiou metioU (PCR) metioU fun simultaaeouc detectiou of humna panovimc B19(HPV B19) . Meti-
sequeccec. The fluoresceei quantitative PCR methoU Uu detectina HPV B19 wnc estaniisPee，ant the
seqsitivito ant specmcito of tae metaou were evaluatee. Reshlts A stanOare carve drawa witli n
第25卷
现。HPV B12呈二十面体,直径为22 ~24 nm, 是一种无包膜的单链、线性DNA病毒。HPV B19 感染可引起胎儿水肿、再生障碍性贫血、肾小球病 等WT多种疾病。HPV B12基因组有2个开放阅 读框（ORF）,左端ORF编码对宿主细胞有细胞 毒性的结构蛋白NS1,该序列高度保守；右端 ORF编码该病毒的结构蛋白VP1和VP2, VP1和 VP2序列为高变区。
University，Nanjing，Jiangsp，314009 ； 2. Geg Testing Technolofy Applicatiou Demoitrahoo Centrs，Huai'aa COa Maternal ang Chili Health Hospital of' Jiangsp Province，Huai on，Jiangsp, 223022)
PCR定量方法概述
PCR定量方法概述宋 敏1 胡建民1 何孔旺23(1沈阳农业大学 辽宁沈阳 110161 2江苏省农科院 江苏南京210014) 聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction,PCR)是20世纪80年代中期发展起来的体外核酸扩增技术。
它具有特异、敏感、产率高、快速、简便、重复性好、易自动化等突出优点;能在一个试管内将所要研究的目的基因或某一DNA片段于数小时内扩增至十万乃至百万倍,使肉眼能直接观察和判断。
PCR技术自诞生之日起就决定了它不仅是一种检测核酸分子的定性方法,而且也是一个能对核酸分子进行定量分析的有力工具〔1～3〕。
定量PCR(Quantitative Polyerase Chain Reaction,Q-PCR)技术有广义概念和狭义概念。
广义概念的定量PCR技术是指以外参或内参为标准,通过对PCR终产物的分析或PCR过程的监测,进行PCR起始模板量的定量。
狭义概念的定量PCR技术是指用外标法(荧光杂交探针保证特异性)通过监测PCR过程(监测扩增效率)达到精确定量起始模板数的目的,同时以内对照有效排除假阴性结果。
本文对定量PCR相关技术的研究情况作如下综述。
1 传统外参法所谓“外参法”是指样本与阳性参照在两个反应容器内反应,要求两个反应管间的差别尽量小,且必须在反应到达平台期前得到各种数据,这种方法一般来说比较繁杂和费时。
外参法有两种实验方法,即滴定法和动力学分析法。
1.1 滴定分析法滴定分析法先把未知浓度的CDNA按一定比例稀释,同样把已知浓度CDNA或参照也按比例稀释,在不同管内扩增得到合成DNA的值,以起始CDNA分子数N0对合成DNA 分子数N的对数LO G(N)作图,以此来估计不同样品中目标CDNA的起始含量。
1.2 动力学分析法对于不同样品来说反映循环数n决定了合成CDNA(N)的量,由于两管PCR反应的效率基本相同。
两条曲线在指数阶段呈平行关系。
在平行阶段选择一个n值,则有两个LO G(N)值与之相对应,两个LO G(N)之间的差别正比于两个LO G(N0)间的差别。
qpcr扩增原理
qpcr扩增原理qPCR扩增原理解析1. 什么是qPCR？qPCR全称为定量聚合酶链式反应（quantitative polymerase chain reaction），是一种利用特定的酶和荧光探针来测量DNA或RNA 的数量的技术。
它可以在非常短的时间内测定起始样本中特定序列的拷贝数。
2. PCR扩增的基本原理qPCR是PCR技术的一种变种，因此我们首先来了解一下PCR的基本原理。
1.Denaturation（变性）：将待扩增DNA双链变性，将其分离成两条单链。
这一步通常在94-98°C的高温下进行，以破坏DNA的双氢键。
2.Annealing（退火）：将引物与已变性DNA单链相结合。
引物是已知序列的DNA片段，它们与目标DNA序列的两端互补配对。
退火温度一般选择在50-65°C之间。
3.Extension（延伸）：通过加入DNA聚合酶酶（例如Taq酶），引物在目标DNA上进行扩增。
聚合酶可以按照DNA的模板合成新的DNA链。
延伸温度通常在72°C左右。
重新循环以上三个步骤，每个循环都会使目标DNA的数量翻倍。
PCR扩增可以通过进行多次循环来构建指数级增长。
3. qPCR与PCR的不同之处qPCR相比于传统PCR，可以对扩增产物进行实时定量测定，而传统PCR只能获得是否成功扩增的信息。
qPCR采用荧光探针来监测扩增过程中的产物，而PCR只是通过检测末端标记的引物或染色剂来判断是否有扩增产物。
荧光探针中包含一个探针序列、一个荧光染料和一个辅助染料。
荧光探针能够与扩增产物的特定序列互补，同时荧光染料与辅助染料的相互作用导致荧光信号的释放。
4. qPCR扩增原理使用qPCR测量DNA或RNA数量的过程分为两个主要步骤：第一步：引物和荧光探针设计在qPCR实验之前，需要设计引物和荧光探针。
引物是一对针对目标序列的短DNA片段，其中一对引物分别位于目标序列的两侧。
荧光探针包含一个专门针对目标序列的探针序列和荧光染料。
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定量PCR测定技术实时荧光定量PCR
2）SYBR荧光染料：
定量PCR测定技术实时荧光定量PCR
3）MolecularBeacons Beacons
定量PCR测定技术动力学方法
通过确定PCR扩增的某 一阶段的效率E来计算 起始模板数。
定量PCR测定技术动力学方法
如果取的样本不连续，则可使用下述将 公式（2）重排后得到的更为通用的公式， 用参数j（取样中间隔的周期数）替代n， Yj（在较高循环周期数取样的产物量） 替代Yn，Yi-j（在较低循环周期数取样的 产物量）替代X： E＝－1＋（Yi/Yi-j）1/j (3)
定量PCR测定技术动力学方法
一旦效率确定后，根据公式（4）可从测 定的产物量和循环周期数计算得到X。公 式（4）来源于公式（2）的重新排列： X＝Yn/(1＋E)n （ 4）
即是在扩增检测待测样本的同时，扩
增一系列稀释的已知标准（通常为质粒
DNA），如果在该标准稀释系列发现扩增
产物/模板成线性相关，则可推导出同时
扩增的待测样本中PCR模板的相对量。
通过E的变化来定量起始模版数
定量PCR测定技术外标方法
定量PCR测定技术外标方法
广义外标定量PCR技术分三种类型：
（1）外参法+终产物分析 （2）外标法+过程监测 （3）外标法+过程监测+内对照
定量PCR测定技术PCR概论
• PCR扩增的理论模式 每一扩增周期后产物的量可以下式表达：
Yn=Yn-1· (1+E) 0＜E＜1
（ 1）
扩增产物的总数量可以下式表示： Yn=X· (1+E)n （ 2）
定量PCR测定技术PCR概论
PCR扩增的实际情况： 已知：扩增周期（n）、扩增总 产物量（ Yn） 未知：起始模版数（ Y0） 变量：扩增效率（E）
定量PCR测定技术PCR概论
定量PCR与定性PCR测定的最根本的区别
平台期
指 数 期
定量PCR测定技术方法
方法： 外标方法 动力学方法 内标共扩增方法
所有的定量PCR方法均围绕变量E展开
定量PCR测定技术方法
定量： 绝对定量（即测定X的分子数量） 相对定量（测定不同样本中X的 比率）
定量PCR测定技术外标方法
定量PCR测定技术动力学方法
优点: 1）不需要外标准； 2）如果能测定PCR产物分子的 绝对数量，则可得到待测样本 的不同的扩增效率（Ee）
定量PCR测定技术动力学方法
改良方法:有限稀释分析 首先将原始模板进行有限稀释，然后对 该稀释系列进行PCR扩增测定，最低的阳 性样本被认为含有与一已知的标准稀释 系列中最后的阳性样本中相同量的PCR模 板 缺点:不同批次的PCR测定的效率有可能 不同,因而测定重复性较差;存在高斯 （Gaussian）（正态）分布
定量PCR测定技术动力学方法
另一种方式是，根据公式（2）的对数形式， 以所测定的 Yn 值的对数对函数 n 绘图得到 X 值： logYn = logX + n×log(1+E) (5) 当 n ＝ 0时，可在图上读出 X值，或通过对公 式（5）的线性回归计算X值（图2）。
定量PCR测定技术动力学方法
定量PCR测定技术内标定量方法
优点 使用竞争性内标既可进行相对定量也可 进行绝对定量。 相对定量具有很好的精密度和重复性。 而绝对定量，关键是要证明竞争性内标 和野生型靶核酸的扩增效率相同。亦可 将竞争性内标臵于含已知量的野生型靶 核酸的样本中同时扩增来评价。
定量PCR测定技术内标定量方法
缺点： • 要定量单份的临床样本，必须进行数管 竞争性PCR测定，每管中靶核酸的量不变， 但改变竞争性内标的量，因为只有当待 测靶核酸与竞争性内标等摩尔量时才能 有可靠的定量。 • 由于竞争性PCR可排除管间和样本间的差 异，因此，其可作为准确的PCR定量方法， 适用于绝对定量及含低拷贝数样本的定 量。
定量PCR测定技术内标定量方法
非竞争性内标准的定量PCR方法 竞争性内标准的定量PCR方法 绕过E的问题，通过相对比值 来得到起始模版数的相对量
定量PCR测定技术内标定量方法
非竞争性内标准： （ 1 ）一般为与靶核酸无关的基因组； （2）既可是内源的也可是外源的； （ 3 ）与靶核酸无相同的引物结合位 点和扩增序列。
定量PCR测定技术临床应用
应注意的问题： 为什么要做定量测定？ 定性和定量测定结果报告上的混淆
定量PCR测定技术临床应用
为什么要做定量测定？ 用于已知病毒感染患者抗病毒治疗效果 的动态观察及抗病毒药物的临床研究； 用于基因表达方面的研究，如特定的 mRNA的定量测定。
定量PCR测定技术临床应用
3 cycle = 8 Amplicon
4 cycle = 16 Amplicon
5 cycle = 32 Amplicon
6 cycle = 64 Amplicon
5 6
7 cycle = 128 Amplicon
20
30
1,073,741,824
定量PCR测定技术PCR概论
PCR的反应动力学： DNA扩增呈 指数上升，
定量PCR测定技术临床应用
1.定量测定重在定量，即如何改善扩增指数期的 线性及其范围。 2.定量测定的准确性较之测定下限要重要得多。 3.非竞争性内标和竞争性内标对于使用内标的定 量测定方法极为关键。合适的非竞争性内标应 为在整个细胞周期中均匀表达的基因核酸，而 竞争性内标则应尽可能近似原始待测模板。 4.定量测定应在扩增的指数期进行，因此，更重 要的是要使涉及整个扩增过程的每个参数都理 想化，以便控制整个扩增，避开扩增“平台 期” 。
定量PCR测定技术之 PCR概论
PCR技术的基本原理：类似于 DNA的天然复制过程，PCR由 变性－退火－延伸三个基本 反应步骤构成
定量PCR测定技术之
PCR概论
定量PCR测定技术PCR概论
1 cycle = 2 Amplicon
2 cycle = 4 Amplicon
No. of No. Amplicon Cycles Copies of Target 1 2 3 4 2 4 8 16 32 64 1,048,576
定量PCR测定技术内标定量方法
非竞争性内标准的优缺点： 优点：内标的制备简单；复管测定可排 除管间差异，并且在一定程度上，可排 除样本间的差异 缺点：进行RNA的定量PCR测定极为困难； 不能进行绝对定量
定量PCR测定技术内标定量方法
竞争性内标准的定量PCR方法 “竞争性”内标：人为构建的可与原始 靶核酸竞争酶、核苷酸和引物分子的核 酸标准。 对内标准的修饰方法包括对野生型基因 组的点突变、部份缺失或插入外来顺序 等
谢谢大家!
定量PCR测定技术临床应用
病原体含量测定结果分析（定量） 1.病原微生物含量与病情之间的关系 2.新的病原体分子诊断标准 3.超早期感染治疗用药物及疗法的研 究与开发 4.病原微生物含量与用药之间的关系 5.新的愈后指标的研究
定量PCR测定技术临床应用
6、传染病的发病监控、预测与预防 7 、mRNA 的表达水平与是否肿瘤及其进展的关 系 o 肿瘤相关基因表达的检测：包括癌基因抗癌基 因、肿瘤转移基因及转移抑制基因 o 肿瘤标志物如癌胚抗原、同功酶、抗体、激素、 细胞因子、受体等 8、等位基因与遗传病之间的关系 o 等位基因检测 o 多基因遗传病的突变检测 o 基因表达异常所致遗传病检测
定量测定的结果报告： • 定量测定测定的是量的“多”或“少”； 定性测定则是测定某种物质的“有”或 “无”，用于未知病人的确认诊断。 • 定量测定结果报告：根据所使用的测定 方法的测定范围报告结果，如样本测定 结果高出此范围，则可报告>多少，也可 对样本稀释后再检测；如低于此范围， 则报告<多少，如<103拷贝数/ml，而不 能报告为0拷贝数/ml或阴性。
定量PCR测定技术外标方法
使用外标的定量PCR方法的优缺点
ห้องสมุดไป่ตู้优点：（1）方法简便，容易建立；（2）使用 双孔重复测定，这种方法可得到非常准确的结 果，甚至可排除管间的差异，但不能排除样本 间的差异； 缺点：（1）PCR反应体系中小的区别也会对测 定造成较大的影响。由于最后在扩增效率上的 差异，从而使得定量测定精密度和重复性不佳。 因此，如果建立一个使用外标准的 PCR 定量方法， 则必须进行方法的精密度（批内变异）和重复 性（批间变异）分析，以确定其应用的局限性。
定量PCR测定技术PCR概论
影响扩增效率E的因素 ——定量PCR的困难 引物/靶核酸的退火情况 参与扩增反应试剂的相对量（Taq 酶/靶核酸之比、 扩增仪孔中温度的不均一性、 临床标本中的Taq酶抑制物的去除 不完全）
定量PCR测定技术PCR概论
因此在扩增产物的数量与原始模 板数量之间没有一个固定的比例关 系，通过检测扩增产物很难对原始 模板进行准确定量。
定量聚合酶链反应测定技术及 临床应用
定量PCR测定技术之 PCR概论
PCR最早的设想：1971年Korana提出核酸 体外扩增的设想 1985年Mullis首先描述的多聚酶链反应 （ PCR， Polymerase Chain Reaction） PCR的改进与完善：TaqDNA多聚酶的应用 1993年 Kary Mullis 因PCR的发明获得 诺贝尔化学奖
定量PCR测定技术实时荧光定量PCR
实时荧光定量PCR原理： 是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利 用荧光信号积累实时监测整个PCR进程， 最后通过标准曲线对未知模板进行定量 分析的方法。
定量PCR测定技术实时荧光定量PCR
（1）Ct： C代表Cycle，t代表threshold，即每个 反应管内的荧光信号到达设定的域值时 所经历的循环数。