噬菌体抗体库技术及其应用研究进展

综述doi:10．3969／j．issn．1009－0002．2010．04．031噬菌体抗体库技术及其应用研究进展潘博1，2，童贻刚11．军事医学科学院微生物流行病研究所，病原微生物生物安全国家重点实验室，北京100071；2．东北农业大学动物医学院，黑龙江哈尔滨150030［摘要］噬菌体呈现抗体库是近年发展的一项分子生物学新技术，它的建立是抗体技术领域中的一次革命性进展。

它以其独特的构建和筛选系统，彻底改变了抗体制备的传统途径，使抗体工程技术进入了一个新的发展阶段，并对生物学领域中许多技术的发展起到了巨大的推动作用。

该技术是迄今发展最成熟、应用最广泛的制备抗体技术。

我们简要综述此项技术的研究应用进展。

［关键词］噬菌体抗体库；抗体人源化；抗体工程技术［中图分类号］R392．1［文献标识码］A［文章编号］1009－0002(2010)04－0581－05Phage Antibody Library Technology and its ApplicationPAN Bo1,2,TONG Yi－Gang11．State Key Laboratory of Pathogen and Biosecurity,Beijing Institute of Microbiology and Epidemiology,Beijing 100071;2．College of Veterinary Medicine,Northeast Agricultural University,Haerbin150030;China［Abstract］Phage－displayed antibody library is a new thchnique which has been developed very rapidly and leads to revolution in the area of antibody engineering in recent years．This technology employes an unique system of antibody construction and screening,and changes the classical method of antibody preparation completely．It pro-motes antibody engineering,into a new developing stage and improves many other technologies in biological fields．So far phage antibody library is the most developed and widely applied technique in the field of antibody prepara-tion．In this review,we focused on the progress of this technique．［Key words］phage antibody library;antibody humanization;antibody engineers and technicians抗体是机体防御系统的重要分子，用于识别和清除外来入侵物。

自19世纪末发现抗血清能中和细菌毒素以来，制备抗体技术的研究经历了3个发展阶段。

第一阶段为抗血清多克隆抗体，即第一代抗体。

第二阶段始自1975年德国学者Kohler和英国学者Milstein应用杂交瘤技术制备了鼠单克隆抗体[1]，即第二代抗体。

这类抗体具有纯度高、特异性好、能无限传代等优点。

然而，当把第二代单克隆抗体应用于人类疾病治疗时，由于单抗的异源性特点，常会引起人抗鼠抗体（human anti－mouse anti-body，HAMA）反应，导致治疗不能持续有效地进行。

虽然人们一直希望用这种技术制备出人单克隆抗体，但却因人的染色体易丢失、杂交瘤不稳定、产量低及亲和力差等因素，用人杂交瘤技术[2－3]制备人源单抗进展缓慢。

因此，围绕着如何生产人源化单克隆抗体，对现有鼠源性单克隆抗体进行人源化改造等问题，第三代抗体———基因工程抗体应运而生，它包括嵌合抗体、改形抗体和用抗体库技术制备的抗体。

目前，抗体工程领域中最突出的研究进展就是噬菌体抗体库技术。

该技术的出现开创了一条简便、快捷的基因工程抗体生产路线[4]，并在许多领域得到了广泛应用，已显示出强大的生命力。

1噬菌体抗体库技术的基本原理噬菌体抗体库技术的产生主要依赖于3项技术的进展：一是PCR技术的出现，使人们可以用一套引物，通过RT－PCR，直接从总RNA中克隆出全套免疫球蛋白可变区基因[5]；二是大肠杆菌分泌有结合功能的免疫球蛋白分子片段获得成功[6]；三是建立了噬菌体表面展示技术[7]。

在此3项技术的基础上，噬菌体抗体库技术的操作路线变得十分便捷。

其［收稿日期］2010－01－13［作者简介］潘博（1984－），男，硕士研究生，（E－mail）panbo198401＠yahoo．com．cn原理是：用PCR技术扩增抗体的全套可变区基因，通过噬菌体表面展示技术，将抗体分子的Fab或scFv等片段与单链噬菌体外壳蛋白形成融合蛋白，展示于噬菌体颗粒表面，经过“吸附－洗脱－扩增”过程筛选并富集特异性抗体。

该融合蛋白既能识别相应抗原并与之结合，又能感染宿主菌以进行再扩增，并且具有强大的筛选功能，能够在体外模拟体内的抗体生成过程，是抗体在同一噬菌体颗粒基因型与表型的统一。

最早的抗体库的报道是1989年英国剑桥大学的Winter小组[8]在Nature上发表的关于单区（VH）抗体库的构建；其后，美国Scripps研究所的Lerner小组[9]在Scienc上发表了关于含有轻重链完整的抗体库构建的文章。

一般认为，后者才是真正的首例抗体库[10]。

他们都是利用噬菌体载体，通过噬菌斑印迹筛选抗体，但该技术出现不到一年就被更为优越的噬菌体抗体库技术所取代。

1991年Winter[11]和Lerner等[12]又分别发表论文，阐述了利用噬菌体展示技术构建抗体库。

这是噬菌体表面展示技术在基因工程抗体应用的成功范例和重大进展，使抗体工程技术进入了一个新的时代。

2噬菌体抗体库的构建及筛选噬菌体抗体库技术出现已近20年，期间有很大的发展，但构建及筛选的基本路线变化不大，主要包括以下4个方面的内容。

2．1免疫球蛋白基因片段的扩增免疫球蛋白基因可来源于杂交瘤细胞、体外免疫的细胞、致敏及非致敏的B淋巴细胞（骨髓、外周血、病灶局部引流淋巴结、扁桃体或经过免疫的小鼠脾脏等），其中以淋巴结的B淋巴细胞较好[13]。

当然，对于选用何种抗体基因是由研究目的来决定的。

获得的方法主要是提取总RNA，逆转录合成单链cDNA，以此作为模板扩增出全套抗体可变区基因。

5＇端引物通常根据各抗体V区家族的框架区（FR1）或前导区的保守序列而设计，3＇端引物主要依据抗体铰链区（J区）的保守序列而设计[14－17]。

为了获得抗体的全套可变基因，通常采用一组依据各种抗体基因家族序列而设计的5＇端引物，分别对模板进行扩增，然后将扩增产物混合。

一个成功的抗体库不仅需要有足够的库容，还必须有良好的多样性。

因此，从靶细胞中分离出的编码抗体可变区基因，一定要尽可能地扩增出不同家族所有抗体基因。

这对于构建一个高质量的抗体库来说是非常重要的。

这项技术在1989年由Orlandi等[5]成功地合成了“通用引物”后才取得了突破性的进展。

经过多年发展，国内外多数研究者构建噬菌体抗体库所用的引物为Daniele、Sblattero等[18]于1997年设计。

2．2噬菌体抗体表达载体的构建噬菌体抗体库技术一般采用的表达载体主要分为2类，一类是在噬菌体载体的基础上改造而成的新载体，另一类为噬粒载体[19]。

但近年来多数学者则以丝状噬菌体的复制起始点序列为基础，组建成噬菌粒（phagemid），以此作为表达载体，再利用辅助噬菌体超感染，得到野生型与融合蛋白混合表达型的噬菌体。

这些载体都具备表达载体所必需的元件，包括LacZ启动子、核糖体结合位点、PelB前导序列、供外源基因插入的多克隆位点，及丝状噬菌体M13的外壳蛋白基因等。

pComb3和pCANTAB5E 是建库的常用载体[20]。

使用这些载体构建抗体基因库时，将获得的全套抗体重链基因与轻链基因以适当的内切酶消化后，克隆到载体中的相应酶切位点。

一般而言，克隆进载体中的重、轻链基因间的配对存在着很大的随机性，因而增加了抗体库的多样性，构建成噬菌体抗体的表达载体。

2．3噬菌体抗体的表达免疫球蛋白分子在体内有膜型和可溶性2种表达方式。

噬菌体抗体的抗体分子以融合蛋白形式表达在噬菌体颗粒外膜上，相当于体内B细胞的膜型表达，这使我们能在体外模拟体内的抗原对特异性抗体的克隆选择过程。

除了呈现在噬菌体表面外，抗体片段还可以以可溶性的形式进行表达。

Hoogenboom等[21]在构建噬菌体抗体载体时，在抗体基因和外壳蛋白基因相接处设计了一个琥珀（am-ber）密码子（TAG）。

在含有琥珀抑制子（amber suppressor）的宿主菌中，抗体基因和GⅢ成为一个开放阅读框架，TAG可翻译为某种氨基酸而不起终止密码子的作用，抗体融合基因表达为抗体－外壳蛋白融合分子；在无琥珀抑制子的宿主菌中，TAG 则成为终止密码子，抗体分子不与GⅢ融合表达，便产生了可溶性蛋白质分子。

2．4特异性噬菌体抗体的筛选抗原以及其他信号刺激体内成熟B细胞成为活化B细胞，这类细胞经过一系列分化和增殖过程，最终成为抗体分泌细胞或记忆细胞。

此过程是体液免疫的启动过程，其亲和力可通过体细胞突变和生物选择过程得到提高。

噬菌体抗体库技术模拟了机体免疫系统的这种选择作用，在体外建库不仅能筛选出，而且能获得大量的各种特异性的抗体分子。

因此，它在这方面拥有得天独厚的优势。

由于抗体分子在融合到噬菌体外壳蛋白C端进行表达的过程中，可以自发地折叠成天然状态而呈现其生物学活性，所以，它可被相应的抗原分子识别，从而很容易地筛选出特异的抗体克隆[22]。

目前，大多数文献报道的抗体筛选方法是经典的筛选方法，即固相纯化抗原法。

其基本操作为：将靶抗原包被在固相介质上，加入待筛选的噬菌体，然后反复洗涤去除非亲和性或低亲和性的噬菌体，再洗脱并收集与抗原特异性结合的噬菌体，再次感染大肠杆菌，使特异性的噬菌体得到富集。

经过几轮这样的“吸附－洗脱－扩增”的筛选，可使特异性抗体的噬菌体富集20～1000倍。

利用噬菌体抗体库技术，借助高效筛选系统，能够方便地对库容106以上的抗体库进行筛选。