氟苯尼考残留检测ELISA试剂盒说明书

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氟苯尼考注射液在鸡体内残留消除研究

氟苯尼考注射液在鸡体内残留消除研究SONG Zhi-chao;ZHANG Chong-wei;CHEN Qiang;ZHU Lei;QIU Fu-na;WU Ning-peng;WU Zhi-ming【摘要】为研究氟苯尼考注射液在鸡体内的残留消除规律,采用35只约3 kg左右的健康白羽鸡,随机分为2组,给药组30只,对照组5只.给药组用药量为每次20 mg/kg,每隔48 h用药1次,连用2次,对照组不给任何抗菌药物,与给药组同环境饲养.在最后一次给药后6、24、72、120、168 h采集肉、肝、肾、皮脂样本,经LC-MS/MS法测定组织中的氟苯尼考及其标示物氟苯尼考胺残留量,并利用WT1.4软件计算休药期.结果显示:氟苯尼考注射液在鸡肌肉、肝脏、肾脏及皮脂中的休药期分别是3.41、2.06、2.25、1.47 d.为保证兽药使用安全、消费者健康和食品安全,推荐氟苯尼考注射液在鸡体内的休药期为4d.【期刊名称】《中国兽药杂志》【年(卷),期】2018(052)012【总页数】9页(P35-43)【关键词】氟苯尼考;鸡;残留;休药期【作者】SONG Zhi-chao;ZHANG Chong-wei;CHEN Qiang;ZHU Lei;QIU Fu-na;WU Ning-peng;WU Zhi-ming【作者单位】;;;;;;【正文语种】中文【中图分类】S859.796氟苯尼考属动物专用氯霉素类广谱抗菌药物，由美国Schering-Plough公司于1988年研制成功，并在1999年被我国批准为国家二类新兽药[1]。

因其吸收好、体内分布广、安全高效，并且无再生障碍性贫血的特点，氟苯尼考被广泛用于治疗猪、禽、牛及水产等养殖动物的细菌性疾病[2-4],但氟苯尼考对哺乳动物具有胚胎毒性，人体用药后还出现厌食、腹泻等不良反应，长期食用含有氟苯尼考及其代谢物的动物源食品将会对人体产生严重的安全隐患[5]。

兽用氟苯尼考说明书

兽用氟苯尼考说明书
一、药品名称
兽用氟苯尼考
二、药品组成
本品主要成分为氟苯尼考。

三、适应症
本品适用于治疗动物产后子宫内膜炎、盆腔炎及其它感染性疾病。

四、使用方法及注意事项
4.1 使用方法
本品为内服药物，可直接服用或与饲料混合饲用。

4.1.1 直接服用
将适量的本品直接放入动物口腹部，或用药品注射器注射到动物口腔，让动物直接吞服。

4.1.2 与饲料混合饲用
将适量的本品与饲料混合后，喂养给动物。

4.2 注意事项
•使用本品前应先检查是否过期，过期药品严禁使用；
•不得超过推荐剂量使用本品；
•使用本品期间，应避免给动物食用辛辣或刺激性食物；
•使用本品时，应注意兽医师的指导；
•禁止用于食品动物。

五、不良反应
使用本品过程中，偶尔会出现轻度食欲减退、拉稀等不良反应。

如出现不良反应，请及时咨询兽医师。

六、禁用病例
有以下情况的动物禁止使用本品： - 对本品过敏者； - 有严重肝脏疾病者； - 有其他严重疾病者。

七、规格
本品规格为XXg/瓶。

八、贮藏方法与有效期
本品需密封保存于阴凉干燥处，远离阳光直射。

有效期为XX年。

九、生产厂家
本品由XXX公司生产。

注：本文档仅作为兽用氟苯尼考的简要说明，并不代表最终说明书的内容。

具体使用时请参照实际产品的说明书进行操作。

鸡蛋中氟苯尼考残留检测的改进方法

氟苯尼考属于氯霉素类（CAPs ）［1］，包括氯霉素（CAP ）及其衍生物，又称酰胺醇类。

氟苯尼考为动物专用的半合成酰胺醇类抗生素，其特点是抗菌谱广、体内分布广泛、注射或内服均吸收良好［2］。

氟苯尼考（FF ）具有较强的免疫抑制作用［3］，并具有胚胎毒性［4］。

随着FF 在兽医临床的大量使用，其耐药菌株也在不断增加。

动物源性食品中CAPs 及其代谢产物的残留检测方法主要包括高效液相色谱法（HPLC ）、气相色谱法（GC ）、气相色谱-质谱法（GC-MS ）、液相色谱-质谱法（LC-MS ）、酶联免疫法（ELISA ），其中确证方法主要是质谱法［5］。

本试验参照《GB/T 22338-2008动物源性食品中氯霉素类药物残留量测定》，提出相应改进措施，在确保检测结果准确与可靠的前提下，简化前处理过程，缩短前处理时间，对提高鸡蛋中氟苯尼考残留检测的工作效率具有重要意义。

1材料与方法1.1试剂与耗材除非另有说明，本方法所用试剂均为分析纯，水为GB/T 6682规定的一级水。

甲醇：色谱纯，乙腈：色谱纯，氨水，正己烷，乙酸乙酯，氟苯尼考标准品：纯度≥99.0%；微孔滤头（尼龙）：孔径0.22μm 。

1.2仪器设备天平：感量0.01g 、0.00001g ，高速冷冻离心机：≥8000r/min ，液相色谱-串联质谱仪：带电喷雾离子源，移液器：100μL 、1000μL ，氮吹仪，均质器，多管涡旋振荡器。

1.3仪器条件色谱柱：ACQUITY UPLCTMBEH C18（1.7μm ，2.1×100mm ）；柱温：30℃；进样量：2.00μL ；流动相：A 乙腈，B 水。

1.4检测方法1.4.1标准储备液、中间液及工作液配制标准储备液（100μg/mL ）：准确称取约10.0mg 氟苯尼考标准物质（精确到0.1mg ）于100mL 容量瓶中，用甲醇定容至刻度，配制成100μg/mL 标准储备液（-20℃保存4个月）。

elisa试剂盒实验说明书

PRRSV N蛋白抗体检测间接ELISA方法的建立1 材料：1.1 蛋白、血清、酶标二抗原核表达PRRSV N蛋白；标准阳性血清和阴性血清，待检血清；自制HRP标记兔抗猪IgG；1.2 主要试剂和溶液包被液（50 mmol/L pH9.6的碳酸盐缓冲液）Na2CO3 1.59 gNaHCO3 2.93 g准确称取后，溶于950 mL的蒸馏水中，调pH值为9.6，定容到1 L；PBS-T洗涤液1000 mL 10 mmol/L pH7.4的PBS中加入0.5 mL Tween-20；封闭液和血清稀释液含10%小牛血清的PBS-T缓冲液，10%马血清的PBS-T缓冲液，含5%BSA的PBS-T缓冲液，含10%BSA的PBS-T缓冲液，含5%脱脂奶的PBS-T缓冲液；底物溶液100 mmol/L的柠檬酸溶液（21 g柠檬酸C6H6O7•H2O溶于去离子水，定容至1 L）24.3 mL，200 mmol/L Na2HPO4•12H2O（71.6 g Na2HPO4•12H2O溶于去离子水，定容至1 L）25.7 mL混匀，加入50 mg的四甲基联苯胺（TMB），临用前加入50 μL的30% H2O2；终止液（2 mol/L H2SO4）每200 mL终止液，由蒸馏水177.8 mL和浓硫酸22.2 mL 混和而成。

1.3 主要仪器设备电热恒温培养箱；4℃冰箱；酶标仪。

2 步骤：2.1抗原包被浓度和二抗稀释度的确定将原核表达的N蛋白分别作2.0 μg/mL，1.0 μg/mL，0.5 μg/mL，0.25 μg/mL，0.1μg/mL，0.05 μg/mL连续稀释6个稀释度，每个稀释度重复两孔，100 μL/孔，4℃包被酶标反应板过夜。

将自制HRP标记的兔抗猪二抗分别做1:50、1:100、1:200和1:400一系列倍比稀释，南京金益柏生物技术有限公司Tel:025-********Fax*************每个稀释度重复两孔，100 μL/孔，组成方阵确定重组蛋白的最佳包被浓度和二抗稀释度。

ELISA说明书翻译

实验步骤1. 开始ELISA 前一天，稀释包被抗体，取酶标板每孔加入100ul 包被抗体溶液，4 度过夜2. 使用前将所有试剂放置室温，强烈建议所有标准品和样品做复孔或三孔，各次检测均要求做标准曲线3. 洗涤液不少于300ul 洗板4 次，并在吸水纸上拍干板子，后续洗涤液同此4. 为了阻断非特异性结合和减少背景，每孔加200ul 样品稀释液5. 封板并在摇床上室温孵育1h6. 在上述期间，准备标准品稀释液和适当的样品稀释液（如必需）7. 标准品稀释：500 pg/ml, 250 pg/ml, 125 pg/ml,62.5 pg/ml, 31.25 pg/ml, 15.6 pg/ml, 7.8pg/ml 和0 pg/ml8. 如步骤3 洗板4 次9. 每孔加入100ul 标准品稀释液和样品到对应孔，如有需要可对样品进行稀释10. 封板并在摇床上室温孵育2h11. 如步骤3 洗板4 次12. 每孔加入100ul 已稀释的二抗，封板并在摇床上室温孵育1h13. 如步骤3 洗板4 次14. 每孔加入100ul稀释的HRP,封板并在摇床上室温孵育30min15. 如步骤3洗板5次，每次洗涤洗涤液浸泡30s至1min，有利于减少背景16. 每孔加入100UITMB显色液，并在摇床孵育15-30min，阳性孔将变为淡蓝色，此步无需封板17. 每孔加入100ul 终止液终止反应，阳性孔将由蓝色变为黄色18. 终止反应半小时内测定OD值（450nm）ELISA 实验基本原理基本原理1971 年Engvall 和Perlmann 发表了酶联免疫吸附剂测定（enzyme linked immunosorbent assay,ELISA ）用于IgG定量测定的文章，使得1966年开始用于抗原定位的酶标抗体技术发展成液体标本中微量物质的测定方法。

这一方法的基本原理是：①使抗原或抗体结合到某种固相载体表面，并保持其免疫活性。

氟苯尼考的毒性及残留检测方法应用进展

69氟苯尼考的毒性及残留检测方法应用进展王军红1 陈鹏举2*（1.河南省兽药饲料监察所，河南郑州 450000； 2.河南省现代中兽医研究院，河南郑州 450000）摘要：氟苯尼考为常用的氯霉素类广谱抗生素，常被用于禽畜养殖产业中动物疾病的防控。

但是，随动物产品中药用剂量的增多，民众食用含氟苯尼考超标的食品，进而诱发食物中毒而被要求限量使用。

文下介绍氟苯尼考的毒性，分析氟苯尼考毒性的检测方法，进一步概述氟苯尼考毒性检测存在的问题，展望未来氟苯尼考毒性检测的应用——对应药物特性遴选适宜的检测方法，建立对应药物的靶标检测组织，以弥补国内在该方面检测技术方面的空白，确保动物源食品的安全。

关键词：毒性；氟苯尼考；检测方法1 前言氟苯尼考为动物专用性广谱抗生素，吸收好、安全高效、广谱抗菌，对敏感菌造成的细菌性疾病有很好的治疗效果。

这些年，随氟苯尼考普遍应用而造成的动物产品中毒事件频发，已经引起有关部门的高度重视。

就此，成立相应的针对氟苯尼考及代谢物的毒性检测方法有极为重要的现实意义。

2 氟苯尼考的毒性2.1 影响红细胞生成氟苯尼考构成中，不存在硝基，由此不形成再生性障碍贫血。

但是，该化学物质会抑制红细胞的生产，尤其在给药期间应格外注意。

2.2 形成免疫抑制氟苯尼考呈强免疫抑制作用，服用期间会严重损害动物的免疫机能。

在临床试验中，氟苯尼考明显抑制牛血液嗜中性粒细胞的吞噬功能。

同时，40mg/ml 的氟苯尼考，还影响到鲤鱼头肾和脾脏离体B 细胞和T 细胞的增殖，抑制多形核嗜中性粒细胞和单核细胞的噬菌能力。

2.3 影响子代成活率繁殖毒性试验结果表明，氟苯尼考具有胚胎毒性，可使亲代雄性大鼠附拿重量明显减轻，子代幼仔的哺乳指标降低，存活率也较低，因此，建议培育的种牛等留种动物以及好娠期、哺乳期的动物禁用该药。

2.4 呈亚慢性毒性经过根据毒性试验评价判定，氟苯尼考为低毒慢性经过。

鼠经口给予氟苯尼考后没有急性毒性。

但是，鼠经腹腔给药后，其LD50接近2 000mg/kg。

CD62L)ELISA试剂盒简介说明

人L选择素（L—Selectin/CD62L）ELISA试剂盒简介说明试验原理：本试剂盒是固相夹心法酶联免疫吸附试验（ELISA）.已知待测物质浓度的标准品、未知浓度的样品加入微孔酶标板内进行检测。

先将待测物质和生物素标记的抗体同时温育。

洗涤后，加入亲和素标记过的HRP。

再经过温育和洗涤，去除未结合的酶结合物，然后加入底物A、B，和酶结合物同时作用。

产生颜色。

颜色的深浅和样品中指标的浓度呈比例关系。

试剂盒内容及其配制：试剂盒成份96孔配置48孔配置96/48人份酶标板1块板（96T）半块（48T）塑料膜板盖1块半块标准品1瓶（1.0ml）1瓶（0.5ml）空白对比1瓶（1.0ml）1瓶（0.5ml）标准品稀释缓冲液1瓶（8.0ml）1瓶（4.0ml）生物素标记抗体1瓶（8.0ml）1瓶（4.0ml）亲和链酶素HRP 1瓶（12ml）1瓶（6.0ml）洗涤缓冲液1瓶（20ml）1瓶（10ml）底物A1瓶（6.0ml）1瓶（3.0ml）底物B1瓶（6.0ml）1瓶（3.0ml）停止液1瓶（6.0ml）1瓶（3.0ml）自备料子：1．蒸馏水。

2．加样器：5ul、10ul、50ul、100ul、200、500ul、1000ul。

3．振荡器及磁力搅拌器等。

人L选择素（LSelectin/CD62L）ELISA试剂盒样品收集、处置及保管方法：1、血清操作过程中躲避任何细胞刺激。

使用不含热原和内毒素的试管。

收集血液后，1000×g离心10分钟将血清和红细胞快速当心地分别。

2、血浆EDTA、柠檬酸盐、肝素血浆可用于检测。

1000×g离心30分钟去除颗粒。

3、细胞上清液1000×g离心10分钟除颗粒和聚合物。

4、组织匀浆将组织加入适量生理盐水捣碎。

1000×g离心10分钟，取上清液5、保管假如样品不立刻使用，应将其分成小部分70 ℃保管，躲避反复冷冻。

尽可能的不要使用溶血或高血脂血。

ELISA检测试剂盒使用指南

ELISA检测试剂盒使用指南ELISA（酶联免疫吸附试验）是一种常用的免疫学实验方法，用于检测病原体、抗体或其他分子的存在和浓度。

它具有高灵敏度、高特异性、易操作和较低成本的优势，被广泛应用于生物医学研究、临床诊断和免疫学领域。

本篇文章将介绍ELISA检测试剂盒的使用指南，包括实验准备、试剂的使用步骤和结果解读。

一、实验准备1.阅读检测项目的说明书：在使用试剂盒前，仔细阅读说明书，了解试剂的使用方法、灵敏度和特异性等关键信息。

2.样本准备：根据实验要求，准备样本。

如果需要检测血清中的抗体水平，可以采集血液样本，离心分离血清；如果需要检测细胞培养上清中的分子，将上清收集，并使其清晰，避免细胞或杂质的污染。

3.样本预处理：根据实验需求，对样本进行必要的预处理。

例如，可以通过加热、稀释、酶解等方式来处理样本，以改变样本组分和浓度。

4.准备品质控制样品：制备阳性和阴性控制样品，用于评估试剂盒和实验操作的稳定性和准确性。

5.实验器材准备：准备所需实验器材，如酶标板、移液器、微孔板洗涤仪等。

确保器材的干净和完整，并按照说明书要求对其进行预处理。

二、试剂使用步骤1.试剂准备：根据说明书要求，将试剂从冰箱中取出，并在室温下放置一段时间使其恢复到室温。

确保试剂瓶盖紧闭，并避免暴露在直接阳光下。

2.实验操作：按照说明书的要求，将试剂加入到酶标板中，并根据实验设计进行标准曲线的设置。

标准曲线用于测量未知样品的数量，并计算出浓度。

3.孵育：根据试剂盒的要求，将酶标板放入孵育箱中进行孵育。

孵育温度和时间应根据实验要求进行调整。

4.洗涤：使用洗涤缓冲液对酶标板上的不特异性结合物进行洗涤。

洗涤过程应准确控制洗涤孔板次数和洗涤液的体积。

5.补液：在洗涤完成后，加入辣根过氧化物酶标况稀释液，促进酶标物与特异性结合物的反应。

6.孵育：根据试剂盒的要求，将酶标板放入孵育箱中进行二次孵育。

7.反应停止：根据试剂盒的要求，加入相应的停止液，停止酶反应。

ELISA 检测试剂盒说明书

本试剂盒只能用于科学研究，不得用于医学诊断人（Human Human））17-17-羟皮质类固醇（羟皮质类固醇（羟皮质类固醇（17-OHCS 17-OHCS 17-OHCS））ELISA 检测试剂盒使用说明书检测原理试剂盒采用双抗体一步夹心法酶联免疫吸附试验（ELISA）。

往预先包被17-羟皮质类固醇（17-OHCS）抗体的包被微孔中，依次加入标本、标准品、HRP标记的检测抗体，经过温育并彻底洗涤。

用底物TMB显色，TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。

颜色的深浅和样品中的17-羟皮质类固醇（17-OHCS）呈正相关。

用酶标仪在450nm 波长下测定吸光度（OD 值），计算样品浓度。

样品收集、处理及保存方法1.血清：使用不含热原和内毒素的试管，操作过程中避免任何细胞刺激，收集血液后，3000转离心10分钟将血清和红细胞迅速小心地分离。

2.血浆：EDTA、柠檬酸盐或肝素抗凝。

3000转离心30分钟取上清。

3.细胞上清液：3000转离心10分钟去除颗粒和聚合物。

4.组织匀浆：将组织加入适量生理盐水捣碎。

3000转离心10分钟取上清。

5.保存：如果样本收集后不及时检测，请按一次用量分装，冻存于-20℃，避免反复冻融，在室温下解冻并确保样品均匀地充分解冻。

自备物品1.酶标仪（450nm）2.高精度加样器及枪头：0.5-10uL、2-20uL、20-200uL、200-1000uL3.37℃恒温箱操作注意事项1.试剂盒保存在2-8℃，使用前室温平衡20分钟。

从冰箱取出的浓缩洗涤液会有结晶，这属于正常现象，水浴加热使结晶完全溶解后再使用。

2.实验中不用的板条应立即放回自封袋中，密封（低温干燥）保存。

3.浓度为0的S0号标准品即可视为阴性对照或者空白；按照说明书操作时样本已经稀释5倍，最终结果乘以5才是样本实际浓度。

4.严格按照说明书中标明的时间、加液量及顺序进行温育操作。

5.所有液体组分使用前充分摇匀。

ELISA_kit使用说明书

微囊藻毒素ELISA检测试剂盒使用说明书Microcystin Plate Kit一、基本原理酶联免疫（ELISA）是免疫酶技术的一种，是将抗原抗体反应的特异性与酶反应的敏感性相结合而建立的一种新技术。

ELISA的技术原理是：将酶分子与抗体（或抗原）结合，形成稳定的酶标抗体（或抗原）结合物，当酶标抗体（或抗原）与固相载体上的相应抗原（或抗体）结合时，即可在底物溶液参与下，产生肉眼可见的颜色反应，颜色的深浅与抗原或抗体的量成比例关系，使用ELISA 检测仪，即酶标仪，测定其吸收值可做出定量分析。

此技术具有特异、敏感、结果判断客观、简便和安全等优点，日益受到重视，不仅在微生物学中应用广，而且也被其他学科领域广为采用。

本试剂盒工作原理如下图所示。

二、已配试剂ELISA试剂盒中配备以下条目：1、96孔已包被好的酶标板2、1只阴性对照即0孔溶液3、标准1：0.1ng/mL的MC-LR标准溶液4、标准2：0.2ng/mL的MC-LR标准溶液5、标准3：0.5ng/mL的MC-LR标准溶液6、标准4：1ng/mL的MC-LR标准溶液7、标准5：2.5ng/mL的MC-LR标准溶液8、1瓶溶液1 (单抗)9、1只溶液2(二抗稀释液)10、一只二抗（小管乘装）11、1瓶溶液3（底物溶液）12、1瓶溶液4 （终止液）13、1袋固体PBS（配置洗涤液用）三、需配器材及试剂除试剂盒内的物品外，还需配备以下器材和试剂：1、酶标仪（若可能，可配有洗板机）2、微量移液器（100 L）（若可能，可配8道或12道微量移液器）3、吸管、橡皮吸头（洗板时用，若有洗板机，无需准备此项）4、纯水（用于配置洗涤液）5、玻璃瓶（盛装洗涤液）6、记时器（准确控制每步操作时间）7、封口膜（防止孔内液体挥发）四、酶标二抗的配置将小管中二抗用溶液2按1:3000稀释，充分溶解混匀，现用现配。

五、洗涤液的配置将固体PBS以纯水配置成1L溶液，加1mL Tween 20（PBS-T, pH7.4-7.6），室温保存。

兽药残留鸡蛋氟苯尼考检测依据

兽药残留鸡蛋氟苯尼考检测依据
氟苯尼考是一种广泛应用于畜禽养殖中的兽药，常用于预防和治疗动物身体内
的寄生虫和细菌感染。

然而，为了保障公众健康和食品安全，对兽药残留的监测变得至关重要。

在鸡蛋中检测氟苯尼考残留的依据主要有以下几点。

首先，兽药残留的监测以食品药品安全法规为依据。

许多国家和地区都制定了
相关法规来规范兽药使用和兽药残留限量。

这些法规要求对食品中的兽药残留水平进行定期监测，确保其不会对人体健康产生不良影响。

其次，实验室分析与检测方法也是检测依据的重要组成部分。

一般来说，检测
鸡蛋中的兽药残留可以采用高效液相色谱法（HPLC）、气相色谱法（GC）或质谱法等分析方法。

这些方法可以准确测定鸡蛋中氟苯尼考的残留水平，确保食品安全。

此外，还需要依据兽药残留监测的目的和要求。

监测的目的可以是评估兽药使
用对人体健康的潜在风险，或者是评估兽药使用是否符合法规要求。

根据不同的目的，监测的侧重点和方法可能会有所不同。

综上所述，对于鸡蛋中氟苯尼考残留的检测，主要依据是食品药品安全法规、
实验室分析方法以及监测目的和要求。

通过准确检测兽药残留水平，可以保障公众的健康和食品的安全性。

氟苯尼考的高效液相色谱检测方法

武汉轻工大学毕业论文论文题目：鸡血浆中氟苯尼考的高效液相色谱检测方法Development of a HPLC for determinationof florfenicol in chicken plasma姓名：吕阳学号： 110703112院（系）动物科学与营养工程学院专业动物生物技术指导教师刘宇2015年6月1日目录摘要 (1)Abstract (2)第一章绪论 (3)1氟苯尼考的研究进展 (3)1.1氟苯尼考的药品信息 (3)1.2氟苯尼考的临床应用 (4)1.3氟苯尼考的检测方法 ..................................................... 错误！未定义书签。

2研究目的与意义 ....................................................................... 错误！未定义书签。

3研究内容 (6)第二章试验研究 ............................................................................. 错误！未定义书签。

1 材料与方法 .............................................................................. 错误！未定义书签。

1.1试验材料 ......................................................................... 错误！未定义书签。

1.2试验动物 ......................................................................... 错误！未定义书签。

1.3试验方法 (7)2 结果与计算 (8)2.1波长选取 (8)2.1工作曲线 (10)2.2回收率与精密度 ............................................................. 错误！未定义书签。

1、ELISA 试剂盒使用说明书（5 孔板格式）

ELISA kitInstruction Manual5-plate formatJuly, 2006For research use only.Not for use in diagnostic or therapeutic procedures.ContentsAbbreviations 2 Introduction 3 Contents of the kit 4 Hazard information 4 Materials and reagents required but not provided 4 Working solutions 4 General procedure 5 Coating antibodies 5 Blocking 5 Test samples and standards 5 Biotinylated detector antibodies 5 SPP conjugate 5 Substrate 5 Cytokine standards 6 Storage kit reagents 6 Directions for washing 7 Trouble shooting 7 References 8AbbreviationsAPC Antigen presenting cellsBSA Bovine serum albuminCD Cluster of differentiationCSB Cytokine stabilization bufferDMSO Dimethyl sulfoxideELISA Enzyme linked immunosorbent assayGM-CSF Granulocyte-Macrophage Colony Stimulating Factor IFN InterferonIL InterleukinMHC Major histocompatibility complexOD Optical densityPB Phosphate bufferPBS Phosphate buffered salinePBST PBS containing 0.05% Tween-20PBST-B PBST containing 0.5% bovine serum albuminSPP Streptavidin-HRP polymerT h T helper subsetTMB TetramethylbenzidineTNF Tumor necrosis factorIntroductionCytokines are a group of regulatory proteins critically involved in many physiological processes such as immune recognition, cell differentiation and cell proliferation. They have been identified in many vertebrate species and are produced by a variety of different cell types. Cytokines are usually produced transiently and locally, acting in a paracrine or autocrine manner. They interact with high affinity cell surface receptors specific for each cytokine or cytokine group and are active at very low concentrations mostly in the picogram range.It is well known now that the type of an antigen-specific immune response largely depends on the selection or preferential activation of defined CD4+T cell subsets (i.e. T h1 and T h2). Activation of these subsets is characterized by the secretion of distinct patterns of cytokines. T h1, but not T h2 cells, primarily secrete IL-2 and IFN-γ while T h2, but not T h1 cells, produceIL-4, IL-5, IL-6, IL-10 and IL-13. Other cytokines, such as TNF-α and GM-CSF are produced by both T h subsets. In addition, the production of IL-12 and IL-10, produced by antigen presenting cells (APC) such as macrophages and dendritic cells, critically contributes to the preferential expansion of T h1- or T h2-type of cells. For instance, early production of IL-12 is considered essential for the development of T h1 cells. On the other hand, the absence or low concentrations of IL-12 and IFN-γ in the early phase of an immune response and concomitant production of IL-4 by cells of the mastcell/basophil lineage or T cells themselves is known to favor the development of T h2 cells. In addition to their regulatory effects on T h subset differentiation, the cytokines released by the two types of T h cells also produce distinct effector functions. For instance, IL-4 and IFN-γhave differential or antagonistic activities on immunoglobulin isotype selection or MHC class II expression. Therefore, the properties of an immune response can be best studied by determining the amounts of cytokines produced by the responding T cells and APC.Contents of the kitItemsQuantity(5-plate format)StorageconditionsCoating antibodies 1 vial 4ºC (39ºF)Cytokine standard 5 vials 4ºC (39ºF)Biotinylated detector antibodies 1 vial 4ºC (39ºF)SPP conjugate (Streptavidin-HRP polymer) 1 vial ≤ -20ºC (-4°F)TMB substrate tablets 5 4ºC (39ºF)Substrate buffer capsules 5 Rt*BSA stock solution (10%) 2 vials (24 ml) 4ºC (39ºF)Cytokine stabilization buffer (CSB)** 1 vial (5 ml) 4ºC (39ºF)Tween-20 1 vial (5 ml) Rt*ELISA plates8 Rt*Adhesive cover slips 10 Rt** Room temperature** For serum and plasma samples only; see under “Test samples and standards”Materials and reagents required but not provided•PB stock: dissolve 96.0 g Na2HPO4.2H2O plus 17.5 g KH2PO4in 1.0 L distilled water and adjust pH to 7.4•Sterile distilled water•H2SO4•Dimethyl sulfoxide (DMSO)•Pipetting devices for the accurate delivery of volume required for the assay performance •Plate washer: automated or manual (squirt bottle, manifold dispenser, etc)•Reading device for microtiter-plate set to 370, 450 and/or 655 nmWorking solutions•PBS: add 10 ml PB stock and 8.8 g NaCl to 1 L distilled water. Adjust pH to 7.4.Alternatively, use commercially available liquid PBS from Invitrogen or other suppliers.Do not use commercially available PBS tablets for the preparation of the coating solution (the filler in the tablets interferes with the coating process).•PBST: 0.5 ml Tween-20 dissolved in 1 L PBS.•PBST-B: 2 ml BSA stock solution (10%) added to 38 ml PBST.•Blocking buffer: 2 ml BSA stock solution (10%) added to 18 ml PBS (for 1 ELISA plate). •Substrate buffer: the contents of one capsule is dissolved in 100 ml distilled water (takes approximately 5 minutes). For optimal performance, the buffer solution should be used within60 minutes.•Stopping solution: 2 M H2SO4TMB (tetramethylbenzidine) and sodium perborate (in substrate buffer)General procedureCoating antibodies•Reconstitute the lyophilized antibodies by injecting 250 µl of sterile distilled water into the vial. Mix the solution gently for approximately 15 seconds and allow it to stand for 2 minutes at room temperature. Avoid vigorous shaking. To coat 96 wells of an ELISA plate 50 µl is pipetted out of the vial (or use a frozen aliquot of 50 µl; see "Storage kit reagents") and added to 5 ml PBS. Mix gently.•Add 50 µl of diluted antibody solution to each well of the ELISA plate and fill up to 100 µl with PBS.•Seal the plate to prevent evaporation.Incubate overnight at 4ºC or alternatively 1 to 2 hours at 37ºC.Blocking•Remove the coating antibody solution and wash the wells at least six times with PBST. •Add 200 µl of blocking buffer.•Seal the plate and incubate at 37ºC for 1 hour.Test samples and standards•Remove the blocking buffer but do not wash.•Add 1/20 volume of CSB to serum or plasma samples but not to other samples such as cell culture supernatants; CSB inhibits the degradation of cytokines in pure serum or plasma. •Dilute standards and test samples in an appropriate diluent (see “Cytokine standards”). •Add 100 µl to each well.•Seal the plate and incubate at 37ºC for 2 hours or overnight at 4ºC.Biotinylated detector antibodies•Remove test samples/standards and wash the wells at least six times with PBST. •Reconstitute the lyophilized antibodies by injecting 0.5 ml of sterile distilled water into the vial. Mix the solution gently for approximately 15 seconds and allow it to stand for 2 minutes at room temperature. Avoid vigorous shaking. Hundred microliter is pipetted out of the vial (or use a frozen aliquot of 100 µl; see "Storage kit reagents") and added to 10 ml PBST-B.Mix gently.•Add 100 µl of diluted antibody solution to each well.•Seal the plate and incubate at 37ºC for 1 hour.SPP conjugate•Remove detector antibody solution and wash the wells at least six times with PBST. •Reconstitute the contents of the vial by injecting 0.5 ml of sterile distilled water into the vial.Mix the solution gently for approximately 15 seconds and allow it to stand for 1 minute at room temperature. Avoid vigorous shaking. Hundred microliter is pipetted out of the vial (or use a frozen aliquot of 100 µl; see "Storage kit reagents") and added to 10 ml PBST-B. Mix gently.•Add 100 µl to each well.•Seal the plate and incubate at 37ºC for 1 hour.Substrate•Remove SPP conjugate and wash the wells at least six times with PBST.•Dissolve one TMB tablet in 1.0 ml DMSO (vortex at high speed for 5 minutes for complete dissolution)and than add 10 ml substrate buffer.•Mix thoroughly and immediately dispense 100 µl into each well. Leave the plate on the laboratory bench at room temperature (color development between 10 and 30 minutes).The substrate produces a soluble end-product that is blue in color and can be read spectrophotometrically at 370 or 655 nm. The reaction can be stopped by adding 50 µl of2 M H2SO4 (resulting in a yellow solution which can be read at 450 nm).Cytokine standardsFor maximum recovery, the vial with lyophilized cytokine standard should be reconstituted in 0.5 ml distilled water and allowed to stand for 1 minute at room temperature. Thereafter, the reconstituted cytokine standard (stock solution) is placed on melting ice and is immediately diluted as indicated below (preferentially within one hour). Use vials with cytokine standards only once.Please note that temperature of buffers and standard solution(s) should now be kept at 0-4ºC until use in the ELISA.The total amount of cytokine standard is indicated on the label of the vial (ng/vial). After reconstitution in 0.5 ml water, the concentration (ng/ml) will become twice the amount on the label [e.g. amount on label is 4.8 ng/vial; after reconstitution, the concentration becomes9.6 ng/ml = 9600 pg/ml].The standard stock solution is diluted to 320 pg/ml in PBST-B (highest concentration cytokine to be used in the standard range).The linear region of the cytokine standard curve is now obtainable in a series of two-fold dilutions in PBST-B ranging from 320 to 5 pg/ml. Always include a blank control (PBST-B only) in the standard range.Before establishing the standard curve, the OD value of the blank control (OD.bl) is subtracted from the measured OD values of the different standard solutions. The standard curve is now plotted as the standard cytokine concentration versus the corresponding (measured) OD value minus OD.bl. In addition, the actual OD values of the test samples are determined by subtracting OD.bl from the measured OD values.The concentration of the cytokine in the test sample can then be interpolated from the standard curve. It is useful to prepare a series of dilutions of the unknown test sample to assure that the OD will fall in the linear portion of the standard curve.Note 1: The OD value measured for the blank control (OD.bl) must be below 0.2.Note 2: for measuring cytokines in cell culture supernatant, samples should be diluted inPBST-B. However, when measuring cytokines in pure serum or plasma, the diluent for the standard and blank control should preferentially be control serum or plasma originating from the same species.Storage kit reagentsThe vials with lyophilized coating antibodies and biotinylated detector antibodies can be safely stored in a refrigerator for a defined length of time (expiry date indicated on the vial). After reconstitution, the antibodies remain fully active for minimal 6 months at 4ºC (39ºF) when kept sterile. However, it is strongly recommended to divide the reconstituted antibody solutions into small aliquots for single use. These aliquots should be stored at ≤-20ºC. Under these conditions the antibodies are stable for at least one year.Upon arrival, the vial with lyophilized SPP conjugate should be stored at ≤ -20°C. Storage of the vial at room temperature or at 4ºC for several months may lead to lower OD readings in the ELISA. After reconstitution, the SPP solution is stable for 2 months at 4°C but rapidly looses activity when stored at room temperature. It is strongly recommended that after reconstitution, the solution is immediately divided into small aliquots for single use and stored at ≤-20°C. Under these conditions SPP is stable for minimal 12 months.Directions for washing•Incomplete washing will adversely affect the assay. All washing must be performed with wash buffer (PBST).•Washing can be performed manually as follows: completely aspirate the liquid from all wells by gently lowering an aspiration tip (aspiration device) into each well. After aspiration, fill the wells with at least 300 µl wash buffer. Let soak for 10 to 20 seconds, then aspirate the liquid. Repeat as directed under "General procedure". After washing, the plate is inverted and tapped dry on absorbent paper.•Alternatively, the wash buffer may be put into a squirt bottle. If a squirt bottle is used, flood the plate with wash buffer, completely filling all wells. After washing, the plate is inverted and tapped dry on absorbent paper.•If using an automated washing device, the operating instructions should carefully be followed.Trouble shooting•Poor consistency of replicates can be overcome by increasing the stringency of washes particularly after the incubation step with detector antibody.•High values of the blank control (optical density > 0.2) can be overcome by shortening the incubation time with the substrate solution or is caused by improper washing procedures. •Inconsistent replicates may be due to cross-contamination of wells by improper pipetting procedures.•If no signal is observed in the wells with the standards•try a new vial with cytokine standard•check the pH of the substrate solution (between 5.0 and 5.5)•verify whether the antibody, SPP conjugate and standardpreparations were properly diluted•Avoid sodium azide in wash buffers and diluents, as this is an inhibitor of peroxidase activity.•Storage of reconstituted SPP at room temperature for several days can lead to a significant loss of SPP activity and consequently low OD readings.ReferencesBooks:•Practice and theory of enzyme immunoassays 1985In: Laboratory techniques in biochemistry and molecular biology, Vol.15 (eds R.H.Burdon and P.H. van Knippenberg)Science Publishers bv, Amsterdam, The Netherlands•ELISA and other Solid Phase Immunoassays.Theoretical and Practical Aspects 1988(eds D.M.Kemeny and S.J.Challacombe)John Wiley & Sons Ltd, Chichester, UK• A practical guide to ELISA 1991(ed D.M.Kemeny) Pergamon Press, Oxford, UKReview of U-CyTech ELISA references:Human cytokines:•Arend, S.M. et al. 2000 J. Infect. Diseases 181: 1850-1854 •Demirkiran, A. et al. 2006 Liver Transpl. 12: 277-284 •Hoogendoorn, M. et al. 2005 Clin. Cancer Res. 11: 5310-5318 •Tang, Y-M. et al. 2006 World J. Gastroenterol. 11: 4575-4578•de Waal, L. et al. 2004 J. Virol. 78: 1775-1781Monkey cytokines:•Fallon, P.G. et al. 2003 J. Infect. Dis. 187: 939-945•Hartman, G. et al. 2005 Vaccine 23: 3310-3317•Kornfeld, C. et al. 2005 J. Clin. Invest. 115: 1082-1091 •Mascarell, L. et al. 2006 Vaccine 24: 3490-3499•Polakos, N.K. et al. 2001 J. Immunol. 166: 3589-3598•de Swart, R.L. et al. 2002 J. Virol. 76: 11561-11569Mouse cytokines:•Eijkelkamp, N. et al. 2004 J. Neuroimmun. 150: 3-9•Kavelaars, A. et al. 2005 J. Neuroimmun. 161: 162-168•Vroon, A. et al. 2005 J. Immunol. 174: 4400-4406Rat cytokines:•Dieleman, J.M. et al. 2006 Life Sci. 79: 551-558•Pacheco-López, G. et al. 2005 J. Neurosci. 25: 2330-2337•Sajti, E. et al. 2004 Brain Behav. Immun. 18: 505-514•Teunis, M.A.T. et al. 2002 J. Neuroimmun. 13: 30-38。

试剂盒使用说明书

牛气肿疽(symptoinatic anthrax)酶联免疫分析（ELISA）试剂盒使用说明书本试剂仅供研究使用目的：本试剂盒用于测定牛血清，血浆及相关液体样本中牛气肿疽(symptoinatic anthrax)的含量。

实验原理：本试剂盒应用双抗体夹心法测定标本中牛气肿疽(symptoinatic anthrax)水平。

用纯化的牛气肿疽(symptoinatic anthrax)抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被单抗的微孔中依次加入牛气肿疽(symptoinatic anthrax)，再与HRP标记的牛气肿疽(symptoinatic anthrax)抗体结合，形成抗体-抗原-酶标抗体复合物，经过彻底洗涤后加底物TMB显色。

TMB在HRP酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。

颜色的深浅和样品中的牛气肿疽(symptoinatic anthrax)呈正相关。

用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），通过标准曲线计算样品中牛气肿疽(symptoinatic anthrax)浓度。

试剂盒组成：试剂盒组成48孔配置96孔配置保存说明书1份1份封板膜2片（48）2片（96）密封袋1个1个酶标包被板1×481×962-8℃保存标准品：1800pg/ml0.5ml×1瓶0.5ml×1瓶2-8℃保存标准品稀释液 1.5ml×1瓶 1.5ml×1瓶2-8℃保存酶标试剂3ml×1瓶6ml×1瓶2-8℃保存样品稀释液3ml×1瓶6ml×1瓶2-8℃保存显色剂A液3ml×1瓶6ml×1瓶2-8℃保存显色剂B液3ml×1瓶6ml×1瓶2-8℃保存终止液3ml×1瓶6ml×1瓶2-8℃保存浓缩洗涤液（20ml×20倍）×1瓶（20ml×30倍）×1瓶2-8℃保存样本处理及要求：1.血清：室温血液自然凝固10-20分钟，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。

申科sf9 hcp残留检测试剂盒（一步酶联免疫吸附法）说明书

SHENTEK®Sf9HCP残留检测试剂盒（一步酶联免疫吸附法）说明书货号：1301310在实验前请完整阅读本说明书，务必重视注意点和常见问题！版本：A/0仅供研究用湖州申科生物技术股份有限公司⏹产品名称通用名：Sf9HCP残留检测试剂盒（一步酶联免疫吸附法）。

⏹包装规格96测试/盒。

⏹预期用途Sf9HCP残留检测试剂盒（一步酶联免疫吸附法）适用于昆虫细胞Sf9来源的宿主蛋白残留定量检测，如基于昆虫细胞-杆状病毒表达系统的生物制品，包括但不限于重组蛋白、疫苗，基因治疗AAV载体等。

该试剂盒仅供研究使用，不可用于临床。

⏹检测原理本试剂盒基于固相酶联免疫吸附法（Enzyme-linked Immunosorbent Assay，ELISA），采用双抗体夹心的方式对样品中残留Sf9HCPs进行定量检测。

该试剂盒内的多克隆抗体是通过裂解sf9细胞所得HCPs作为抗原，免疫绵羊获得血清，进而通过亲合纯化方法得到高质量抗体。

抗体通过目前主流的覆盖率分析法规方法评估其覆盖率水平。

该分析方法通过在预包被抗Sf9HCPs多克隆抗体的酶标板中加入校准品或待测样品、HRP标记的抗Sf9HCPs多克隆抗体进行共孵育；洗涤后，利用加入的TMB底物进行显色反应，最后使用终止液终止酶催化反应。

利用酶标仪在450nm波长下测读吸光度值，其吸光度与校准品和样品中的HCPs浓度成正相关，通过剂量-反应曲线可计算得出样品中Sf9HCPs的浓度。

本试剂盒对实际样品无需进行特殊处理，仅需通过合适的稀释比例进行适用性验证即可直接使用。

本试剂盒检测步骤少，快速，专一性强，性能稳定可靠。

图1检测原理示意图试剂盒组分表1.试剂盒组分组分产品号规格说明Sf9HCP 校准品PNB0112瓶冻干粉。

精确量取500μL复溶液，溶解，静置约5分钟，溶液应该澄清透明，无肉眼可见不溶物。

具体浓度见瓶身标注。

抗Sf9HCP 预包被酶标板PNA0128孔×12条已包被适量的绵羊抗Sf9HCPs多克隆抗体，铝箔袋密封包装，含干燥剂。

动物可食性组织中甲砜霉素、氟苯尼考胺及氟苯尼考残留的测定

动物可食性组织中甲砜霉素、氟苯尼考胺及氟苯尼考残留的测定作者：***来源：《品牌与标准化》2024年第03期【摘要】建立高效液相色谱法测定动物可食性组织中氟苯尼考、氟苯尼考胺和甲砜霉素残留量。

试样经过乙腈-乙酸乙酯-氨水（体积比5∶15∶80）混合提取液提取，4%氯化钠溶液和正己烷液分配净化，再经HLB固相萃取柱净化，高效液相色谱仪测定，外标法定量。

结果表明，甲砜霉素在25～5000 ng/mL、氟苯尼考胺和氟苯尼考在5～500 ng/mL浓度范围内呈现良好的线性关系，甲砜霉素检测限为10μg/kg，氟苯尼考及氟苯尼考胺检测限为2.0μg/kg，回收率均值为73.6%～91.2%，批内、批间RSD值均小于20%。

本方法专属性强，灵敏度高，适用于动物可食性组织中甲砜霉素、氟苯尼考胺及氟苯尼考残留的测定。

【关键词】动物可食性组织；氟苯尼考；氟苯尼考胺；甲砜霉素；高效液相色谱法【DOI编码】10.3969/j.issn.1674-4977.2024.03.002Determination of Thiamphenicol， Flufenicomide and Flufenicol Residues in Edible Animal TissuesLIU Kai（Liaoning Inspection， Examination & Certification〔Liaoning Institute forAgro-product Veterinary Drugs and Feed Control〕， Shenyang 110036， China）Abstract： A high-performance liquid chromatography method has been established for the determination of flufenicol， flufenicomide， and thiamphenicol residues in edible animal tissues. The sample was extracted with a mixed extraction solution of acetonitrile-ethyl acetateammonia （volume ratio 5∶15∶80） and purified by 4% sodium chloride solution and n-hexane liquid-liquid distribution， and then purified with HLB solid-phase extraction column. The sample was determined by high-performance liquid chromatography and quantified using an external standard method. The results showed that there was a good linear relationship between the concentration range of 25 ng/mL to 5000 ng/mL of thiamphenicol， and between the concentrations of 5 ng/mL to 500 ng/mL of flufen icol and flufenicomide. The detection limit of thiamphenicol was 10μg/kg， while that of flufenicol and flufenicomide was 2.0μg/kg. The average recovery was 73.6% to 91.1%， and the RSD wereKeywords： edible tissues of animals； flufenicol； flufenicomide； thiamphenicolresidues；high performance liquid chromatography method甲砜霉素和氟苯尼考是氯霉素的主要替代品，应用较广，具有潜在的体内蓄积危险[1-3]，并且由于操作不慎引起残留的可能性很大。

氟苯尼考质量标准+氟苯尼考检验操作规程

氟苯尼考质量标准文件类别SMP 起草：年月日审核：年月日批准：年月日执行日期：年月日文件名称氟苯尼考质量标准文件编码 SMP-QMP20302 目的：制定氟苯尼考的质量标准。

适用范围：氟苯尼考的检验责任人：化验员、化验室主任、质量部长。

标准依据：《中国兽药典》2010年版一部内容：5．内容：本品为[R-（R *，R *）]-2.2-二氯-N-[1-氟甲基-2羟基4-甲基磺酰]苯基]乙基乙酰胺。

按无水物计算,含C 12H 14Cl 12FNO 4S 不得少于98.0%。

【性状】本品为白色或类白色粉末或结晶性粉末，无臭。

本品在二甲基甲酰胺中极易溶解,在甲醇中溶解,在冰醋酸中略溶,在三氯甲烷中极微溶解，在水中几乎不溶。

熔点本品的熔点为152～156℃。

比旋度取本品，精密称定，加二甲基甲酰胺溶解并制成每1ml 中约含50mg 的溶液，依法测定，比旋度为-16至-19º。

【鉴别】（1）在含量测定项下记录的色谱图中，供试品溶液主峰的保留时间应与对照品溶液主峰的保留时间一致。

（2）本品红外光吸收图谱应与对照的图谱一致。

【检查】酸度取本品0.1g,加水20ml,振摇，滤过,取续滤液依法测定,PH 值为4.5～6.5。

氯化物取本品0.5g,加水30ml,振摇，滤过,取续滤液15ml,依检查,与标准氯化钠溶液5.0ml 制成的对照液比较,不得更浓(0.02%)。

氟取本品约40mg,精密称定,照氟检查法测定,按无水物计算,含氟量不得少于4.8%。

有关物质取本品适量,用流动相溶解并制成每1ml 中含氟苯尼考0.5mg 的溶液,照含量测定下方法试验,取10ul 注入液相色谱仪,记录色谱图至主峰保留时间的2.5倍。

供试品溶液如显杂质峰,按峰面积归一法计算,最大杂质峰面积不得过0.5%,杂质峰面积的和不得过2.0%。

水分取本品,照水分测定法第一法)测定,含水分不得过0.5%。