Odyssey 红外荧光扫描成像系统培训手册1

二、系统安装条件
1. 位置要求：稳定水平的操作平台放置设备，远离热源，避免阳光直射 2. 空间及载重要求：
操作平台尺寸（长×宽×高）：80×70×80cm 操作平台载重：40kg 3. 温度要求：15-25℃ 4. 湿度要求：不超过 60% 5. 电源：90-250V AC，47-63Hz。 6. 其它：通用插头接线板（至少 3 个插孔）
主要特点 1．高灵敏度,效果同于或者好于化学发光法，但不需信号放大步骤，信噪比高。 2．直接检测，无需曝光和显色底物，不需要 X 光片，不需要暗房，没有放射性 废料产生。 3．双色检测，可以在一次杂交中同时检测两种目的分子，直观，省时。 4．宽广的线性范围，可用于高准确性定量。 5．背景低，图像清晰，激光强度可调，不会丢失弱的信号 6．强有力的软件支持，结果分析如确定分子量和定量及图象处理编辑很容易 7．系统操作和维护简单
显示选择圈选图像的细节 表格形式显示所圈选的图像 显示所选泳道的峰值图 调整图像在圈选框中的位置 对图像的灰度值和浓度值做标准曲线 编辑分子标准
2 图象分析工具栏
3 图象分析
A 打开需要分析的图象，左侧的分析工具栏被激活 B 使用 矩形选择工具圈选图象上要分析的条带（尽可能小） C 系统自动给出该条带的灰度值 D 如果进行多个目标条带的分析，对多个目标条带进行圈选，然后拖动鼠标将 所有矩形框选中，则多个分析结果可以同时显示 软件分析的详细功能，请参照仪器说明书，并和相关技术支持联系
一、Odyssey 红外成像系统技术特点
一般的荧光染料的激发和检测波长都位于可见光谱区，在此波长范围内，化 学高分子物质（膜、胶、微孔塑料板等）也会发出荧光，因此易产生高背景的荧 光干扰，从而不能有效用于膜上蛋白或者核酸的直接荧光成像。而在红外波长区 这些大分子物质几乎不发出任何荧光信号，使得红外荧光染料在长波下检测时背 景荧光很低，具有很好的信噪比，这一特点使得核酸和蛋白的膜上荧光检测成为 可能。LI-COR 根据红外荧光的这一特点开发出 Odyssey 红外成像系统，独特的 采用 2 个红外激光作为激发光源，以扫描成像方式对样品进行检测。样品载体可 以是膜、凝胶和微孔板。该系统配置的 2 个红外激光激发光源，激发光波长分别 为 680nm 和 780nm，配置的 2 个高灵敏度光敏二极管可以分别检测 720nm 和 820nm 的发射荧光，因而 Odyssey 可同时检测两种 IRDyes 染料的荧光信号。IRDyes 染 料的最大吸收值与 Odyssey 的两个红外激光器 680nm 和 780nm 激发波长相匹配， 其发射光波长又与 Odyssey 的两个光敏二极管检测波长相匹配，与同时 IRDye700 和 IRDye800 的发射波长峰值相隔 100nm，因此 Odyssey 可以给出最大的灵敏度 和最小的信号交叉。同时由于采用二极管激光器和固态检测器，Odyssey 具有很 长的使用寿命（激光器使用寿命约 4-6 万小时），而系统维护的要求却很低。该 系统可广泛应用于信号传导，蛋白磷酸化分析，In-Cell-Western 分析等蛋白领域 研究。
八.常见问题处理
问题：高背景，但是是均匀分布的 可能原因 封闭液中有 Tween-20 存在 封闭液中有 BSA
Quality：图像的质量，在右侧的下拉框中选择需要的图像质量，一般的 Western blot 膜我们推荐使用 medium 即可。 Focus offset：聚焦平面选择，一般情况下当在上面 Preset 中选择好扫描选项后， 聚焦平面的值会根据上面的选择自动给出聚焦平面，一般来说，膜的聚焦平面为 零，胶的聚焦平面为胶厚度的一半（可根据胶实际的厚度手动输入） Channels：选择扫描的激光通道，根据所使用的二抗其激发后产生的发射光波长 为 720nm 或 820nm，选择相应的 700 或 800 通道，如果同时使用两个通道，也 可同时勾选这两种通道。 Intensity：在右侧的下拉框中选择激发光的强度，由 L2.0 至 10 共 24 种强度可 以选择，根据信号的强弱进行调整，信号弱时可将激发光强度相应调高。在进行 双通道扫描时，可根据不同的信号，设置不同的激光强度进行同步扫描。 Scan Area：在四个选项框中可以手动输入值，或者在右侧的 25×25 的扫描平面 模拟图中圈选要进行扫描的面积。
（避光）。
注：如果一抗稀释液中含有 0.1-0.2%的 Tween-20，则二抗稀释液也添加相同的 Tween-20。 如果使用 Tween-20 的同时添加 0.01-0.02%的 SDS 于二抗稀释液中可以比较好的降
低背景
15. 洗膜同 13（避光） 16. 用 PBS 洗去膜上残留的 Tween-20，接下来可直接进行扫描。 实验的详细的操作流程、注意事项、问题解决请参见附件以及《分子克隆实验 指南》。
Odyssey 的应用 应用领域：蛋白质研究，核酸研究 具体包括：Western 分析，In-Gel Western 分析，蛋白质定量分析，双色磷酸化
分析，考马司亮兰胶的扫描，蛋白双向电泳，双色 EMSA，双色微孔 板分析，BD PowerBlot Analysis，Northern Blot，Southern Blot 等
4 扫描点击 Start Scan 按钮，开始扫描
扫描开始后，扫描的图像可以实时出现，在右下角可以看到完成的百分数
5 图像调整 当扫描达到 100％后，扫描结束，弹出图像调整对话框
Flip：图像位置颠倒选项，可以将图像进行上下颠倒 Rotate：图像旋转选项，可对图像进行不同角度的旋转 Subtract：在原始图像截选取需要的范围 Crop：将选取的范围裁剪下来 Undo：返回上一步 Adjust Image：调整图像的色阶 Alter Image：调整图像的亮度和对比度 在图像调整完成后，点击进入图像分析界面
（通用试剂详细配方请参照《分子克隆实验指南》）
其它配套设备： 1) 蛋白电泳仪
2) 脱色摇床 3) 转膜仪 4) 分子生物学实验室常用工具：
加样器，Tip 头，量筒，离心管，离心机，冰盒等。
四、培训程序及时间安排
（请至少安排 2 名实验室长期工作人员参加培训，方便以后有人员变动您也能进行仪器 内部培训。）
Odyssey 红外荧光扫描成像系统 培训手册
二 oo 三 年 九 月
目录
一、Odyssey 红外成像系统技术特点 二、系统安装条件 三、Western 实验所需试剂设备及样品 四、培训程序及时间安排 五、仪器及试剂系统介绍 六、Western 实验操作流程介绍 七、软件使用培训 八、常见问题处理 九、注意事项
1. 仪器概况及相关应用讲座（1 小时） 2. 仪器使用培训（2 小时） 3. 用户实际操作练习与答疑（1 小时）
五、仪器及试剂系统介绍
1. Odyssey 红外成像系统技术特点讲解 2. 仪器系统组成和工作原理讲解 3. 配套试剂介绍
六． Western 实验操作流程介绍
荧光检测 Western 操作流程（以硝酸纤维素膜为例）： 1. 吸去培养液，用预冷的 PBS 洗细胞两次 2. 加入细胞裂解液，4℃放置 20min 3. 用细胞铲刮下细胞，转移到 1.5ml 离心管，13000rpm，4℃，20min 4. 取上清 5. 取 20-100µg 蛋白进行电泳 6. 电泳：聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）按分子克隆实验手册操作 7. 硝酸纤维素膜于转移缓冲液（PBS）中平衡 20min。（如果使用 PVDF 膜，请先
二、如何对图像进lysis 图标，打开图像，可以进行分析。
1 图像调整工具栏：
快捷图标 新建一个 project 打开已经存在的 project 打印显示的图像 扫描，由扫描仪获得图像 导出显示的图像，选择图像的分辨率和格式，并选择相应路径进行保存 在已有的 Scan 下，再次添加新的 Analysis 显示选中的 Analysis 将已打开的图像，再次打开并平行窗口排列 图像放大 图像缩小 图像比例调整 去除或显示图像上的标注 对图像的亮度和对比度进行调整 对图像的的色阶进行调整 显示 700 通道图像或显示双通道图像 显示 800 通道图像 将图像转化为黑白色 显示彩色图像 显示图像设置参数 显示图像背景设置参数
三、Western 实验所需试剂设备及样品
Western Blot 实验所需试剂耗材： 客户自备的蛋白样品(建议为新鲜制备的蛋白，最好用 western 验证过) 细胞裂解液 SDS-Page 胶 电泳缓冲液 硝酸纤维素膜 转移缓冲液 PBS TBS 封闭液（建议使用 5%进口脱脂奶粉） Tween-20 一抗 荧光标记的二抗（IRDye700 和 IRDye800） 锡箔纸
点击确定，保存文件。 3 点击工具栏中 图标，该图标在可以进行扫描时变为彩色状态
系统提示输入用户名和密码，一般情况下用户名和密码均为 user，点击 OK，弹 出扫描设置对话框，对扫描参数进行设置
Name：输入本次扫描的名称 Group：定义用户所归属的组别 Preset：设定选择扫描界面
可以根据实验的要求进行扫膜、扫蛋白胶、扫 DNA 胶、扫 96 孔板等选择操作 Resolution：扫描分辨率设定，在右侧下拉框里选择需要的分辨率，有 21、42、 84、169、337 五种分辨率可选，这里分选择的值越小，图像的分辨率越高，扫 描得到的图像越大。一般的扫描我们推举使用 169 就可以得到 300dpi 的图像。
仪器的操作流程： 1．在面板上打开仪器电源开关，再开启电脑，关机时相反。 2．用软布或无尘纸蘸双蒸水将扫描平面的玻璃擦拭干净。 3．将要扫描的胶或膜放到扫描平面上，记下坐标，扣上舱盖。 4．双击软件图标，输入用户名、密码，进入主菜单。 5．点击 scan 快捷键，选择要扫描的区域、介质、通道及合适的灵敏度、分辨率，
一、如何进行图像的扫描： 1 双击桌面上 Odyssey 的快捷方式图标
打开软件出现软件的使用界面
2 点击工具栏中 图标，建立一个新的 case