近红外荧光成像技术——定量Western Blot的新标准
WesternBlot检测标准流程
Western Blot检测 SOP1目的为了使抗体部生产活动正常进行,特制定本规程。
2 范围适用于Western Blot检测工作人员的生产活动.3 责任生产部门组织制定和实施，行政部负责监督。
4 程序4。
1 WB检测原理蛋白质印迹（Western blot），是根据抗原抗体的特异性结合检测复杂样品中的某种蛋白的方法.WB采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳,被检测物是蛋白质，“探针”是抗体,“显色”用标记的二抗.经过PAGE分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜)上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质,且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。
以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分.4。
2 WB检测小组的工作内容4.2。
1 细胞和组织裂解液的制备4。
2。
2 小鼠血清阳性的WB检测4.2。
3 融合后的杂交瘤细胞株单阳性的WB检测4.2。
4 每次亚克隆后细胞株单阳性的WB检测4。
2.5 小鼠腹水阳性的WB检测4。
2。
6 多抗生产中，兔血清的WB检测4.3 细胞和组织裂解液制备标准流程4。
3。
1 贴壁细胞：去除培养基，用冰冷的的PBS洗三次， 6孔板加50—100ul EBC裂解液，直径10cm平皿或25cm2（T25)培养瓶加200-400ul裂解液,一般加200ul合适，用细胞刮使裂解液与细胞充分接触（通常裂解液接触细胞1—2秒后，细胞就会裂解），再将刮下的裂解液收集于离心管中。
4.3.2 悬浮细胞:离心收集细胞,用冰冷的PBS洗三次，每次5ml左右，用手指轻弹收集细胞管管壁，使细胞均匀散开，1000—2000rpm离心根据细胞压积每100ul加1ml裂解液,再用手轻弹细胞管管壁，使裂解液与细胞充分接触,以便于充分裂解细胞。
4.3。
3 组织：分析天平准确称取组织，将组织用PBS清洗干净,按照1g组织加10ml裂解液（Tissue lysis buffer）的比例加入适量裂解液并将组织剪碎，转移到玻璃匀浆器中,研磨10～20min,直到将组织充分磨碎，将研磨液转移到离心管中.4.3。
定量Western Blot 一定要有内参质控(上)
定量Western Blot 一定要有内参质控（上）Western blot是生物修炼的一大实验，现在不做定量Western blot，都不敢自诩学霸的了，暗暗擦汗的有没有？在讨论如何从western blot中获得定量数据之前，先定义一下我们所说的“定量”是什么意思是非常有用的，何为定量，必须符合下列准则:使用一个定义的过程进行检测，即western blot这个过程产生一个可重复的结果，即是精确度测量反映了一个“真实”的结果，即是准确度定量Western blot除了需要进行蛋白抽提、蛋白定量、等量蛋白上样电泳、转膜、靶蛋白抗体孵育、显色等步骤以外，是一定要检测内参的，也就是内部参照（Internal Control），目的是校正蛋白质转印和上样过程中导致的实验误差，保证实验结果的准确性。
对于哺乳动物细胞表达来说，内参通常指由管家基因编码表达的蛋白(Housekeeping Proteins)，它们在各组织和细胞中的表达相对恒定，在检测蛋白的表达水平变化时常用其作为参照物。
在发表文章时，western blotting实验结果需内参进行校正，但仍有一些科研人员在实验中忽略内参的使用，将蛋白浓度测定作为规范是比较各种样品间上样量等同的唯一方法。
然而各种蛋白质浓度定量方法，都存在局限性，例如BCA方法对还原性试剂兼容性差，Bradford方法对去垢剂兼容性差，A280方法影响因素比较多，不能完全准确的确定各种样品的准确蛋白浓度。
在Western blotting实验时使用内参，即可简便地对转印和上样步骤产生的误差进行校正。
谁能看出这是“GAPDH”那么如何实现Western Blot实验中内参的检测呢？简单讲就是在WB过程中，除加入靶标蛋白的抗体外，也加入内参蛋白的抗体，同时实现靶标蛋白和内参蛋白的检测。
通过归一化，可以校正上样误差和转印误差，从而获得比较准确的western blot结果。
使用荧光方法进行定量western blot检测，可进行多重检测，荧光信号稳定，持久，影响因素少，不用剥离膜和剪膜，实验条件一致，更容易获得定量Western blot 的数据。
试述western blot技术的原理、方法、注意事项及其在医学科研中的应用。
试述western blot技术的原理、方法、注意事项及其在医学科研中的应用。
1. 引言1.1 概述Western blot技术是一种常用的分子生物学实验方法，用于检测、定量和分析特定蛋白质在复杂混合物中的表达和相互作用。
它具有高灵敏度、高特异性和较为准确的测量能力，因此在医学科研领域中得到广泛应用。
1.2 文章结构本文将详细介绍Western blot技术的原理、方法、注意事项以及在医学科研中的应用。
首先，我们将阐述免疫检测原理、蛋白质分离与转移原理以及免疫染色与检测原理，帮助读者全面了解该技术的基本原理。
其次，我们将描述样品制备与电泳条件设置、蛋白质转移与固定方法以及免疫染色及可视化方法，为读者提供详细的实验步骤。
随后，我们将介绍实验室操作要求及安全措施、样品处理和保存注意事项以及技术参数调整和结果解读注意事项，以保证实验的准确性和可重复性。
最后，在医学科研领域中的应用方面，我们将以蛋白质表达水平检测、蛋白质亚细胞定位分析以及蛋白质相互作用和功能分析为例，展示Western blot技术在疾病诊断和药物研发等方面的重要应用。
1.3 目的本文的目的是为读者提供对Western blot技术全面了解，并指导其在医学科研中正确应用该技术。
通过详细介绍该技术的原理、方法和注意事项，读者将能够准确地进行实验操作并正确解读结果，同时也能够认识到其在医学科研中的重要性和广泛应用价值。
2. Western blot技术原理2.1 免疫检测原理Western blot技术是一种常用于检测特定蛋白质的免疫学方法。
它基于抗原与抗体的特异性结合关系，通过将蛋白质溶液经过电泳分离、转移到固体载体上，并使用特异性抗体识别目标蛋白质，从而实现对目标蛋白质的定性和定量检测。
在Western blot中，首先需要将待检测的蛋白样品进行SDS-PAGE电泳分离。
然后，通过将蛋白质转移到聚丙烯酰胺凝胶或其他固体载体上，在固相载体上形成一个被称为“Western blotting”的蛋白质模式。
western blot技术的原理方法注意事项
western blot技术的原理方法注意事项一、原理Westernblot是一种常用的蛋白质检测技术，其基本原理是蛋白质的印迹技术，即把蛋白质从复杂的样品中分离出来，并转移到固相支持物上，再与特异性抗体结合，通过显色或电子显微镜观察鉴定蛋白质的表达和分布情况。
二、方法1.样品处理：首先，需要将蛋白质样品进行提取、分离和纯化。
根据样品性质，可以采用不同的提取方法，如细胞裂解液、组织匀浆液等。
2.凝胶电泳：将分离纯化的蛋白质样品转移到分离胶中，通过电泳将不同分子量的蛋白质分离。
3.免疫反应：将膜上的蛋白质与特异性抗体结合，形成抗原-抗体复合物。
4.显色反应：通过化学反应，使抗原-抗体复合物显色，便于观察和拍照。
5.电子显微镜观察：对于较小的样品，可以采用电子显微镜对蛋白质进行观察和定量分析。
三、注意事项1.样品处理：提取的蛋白质样品应尽可能保持完整性和纯度，避免在提取、分离和转移过程中发生变性或降解。
2.凝胶电泳：分离胶的选择应根据待测蛋白质的分子量大小进行，以确保蛋白质能够完全分离。
同时，应注意电泳过程中的电压、电流和时间等参数，避免过度电泳导致蛋白质失活或降解。
3.免疫反应：应注意抗体滴度的选择，确保抗体能够充分识别目标蛋白质。
同时，应避免使用过期或质量不佳的抗体。
4.显色反应：应注意显色试剂盒的质量和操作步骤，确保显色反应充分且颜色易于观察。
同时，应注意显色颜色的稳定性，避免因颜色不稳定影响结果判断。
5.电子显微镜观察：应注意电子显微镜的操作步骤和设备维护，确保电子显微镜能够正确成像。
同时，应注意样品的制备和处理，确保样品能够被电子显微镜准确观察。
6.实验条件：实验过程中应注意调整实验条件，如孵育时间、洗膜次数、抗体稀释度等，以确保实验结果的准确性和可靠性。
7.重复性：在进行Westernblot实验时，应注意重复性实验的开展，以减少实验误差和提高实验结果的可靠性。
总之，Westernblot技术虽然复杂，但只要掌握了其原理和方法，并注意以上注意事项，就能够获得准确可靠的结果。
(最新整理)westernblot详解
蒸馏水至 1000ml
溶解后室温保存,用时稀释10倍，并加入甲醇至
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20%
（2）夹子黑的一面：海绵-3张滤纸-胶-NC膜-3张滤纸海绵
①将夹子打开使黑的一面保持水平。在上面垫一张海绵 垫。在垫子上垫三层滤纸，固定滤纸,擀去其中的气泡。
②刮去玻璃板上的浓缩胶，小心剥下下层胶，用手调整 使其与滤纸对齐，轻轻用玻棒擀去气泡。将NC膜盖于 胶上，要盖满整个胶并除气泡。在膜上盖3张滤纸并除 去气泡。膜盖下后不可再移动。最后盖上另一个海绵垫， 擀几下就可合起夹子。
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具体情况依照说明书
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灌分离胶： 用1ml的移液枪吸取1ml胶沿玻璃放出，溶液缓 慢加入到装配好的玻璃板中至凝胶高度为6cm左 右，预留1.5cm高度配制浓缩胶。 用1ml的移液枪吸取1ml左右的异丙醇，压平。 沿玻璃放出，注意速度要慢，否则胶会被冲变形 。 温箱放置0.5-1h左右至聚合完全。
注意：边配边平摇烧杯混匀，配好胶后迅速灌胶， 灌胶速度须缓慢，避免产生气泡 灌胶之上轻轻加一层异丙醇，用来压平
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灌制分离胶
隔绝空气
ddH2O 0.1%SDS:<8% 异丁醇：>8%
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二 配制浓缩胶
准备物品： 移液枪 烧杯（ 1 ml 200ul 20ul） Tips： 30%Acrylamide 1M （4度冰箱）， Tris-HCL 溶液（PH=6.8）， ddH2O 10%AP （-20冰箱） ， TEMD（4度） ，SDS（常温）
制作标准曲线 （插入表格）
检 测 样 品 蛋 白 含 量 ： 取 一 管 考 马 斯 亮 蓝 +95 l
western blot 检测相关参数及常见问题
Western Blot（WB）检测注意事项及相关参数发布日期：2009-11-16 来源：生技网信息中心浏览次数：985成功完成Western Blot检测，必须满足4 个条件：（1）转移期间蛋白质必须从凝胶中洗脱出来,如果蛋白质还截留在凝胶中,将无法在膜成功完成Western Blot检测，必须满足4 个条件：（1）转移期间蛋白质必须从凝胶中洗脱出来,如果蛋白质还截留在凝胶中,将无法在膜上进行分析（2）在转移过程中蛋白质必须吸附到膜上，如果蛋白不吸附，将无法在膜上进行分析（3）在转移后的处理过程中蛋白质必须保持吸附在印迹膜上（4）被吸附的蛋白质必须能够与检测试剂接触，如果蛋白质被掩盖则无法检测此外，成功进行WB检测，必须设置合适正确的对照，只要正确设置了这些对照，即可快速和准确的找到WB的问题所在，并保证实验结果的准确性和特异性。
一般需要设置的对照如下：阳性对照：明确表达检测蛋白的组织或细胞，用于检测抗体的工作效率阴性对照：明确不表达检测蛋白组织或细胞，用于检测抗体的特异性二抗对照：不加一抗，用于检测二抗的特异性内参对照：检测标本的质量和二抗系统空白对照：不加一抗和二抗；用于检测膜的性质和封闭的效果附一：WB检测基本过程及相关参数1、获取细胞或组织裂解物1)根据检测蛋白的位置选择合适的裂解buffer,亦可购买商业化的蛋白提取试剂盒来保证标本制备的质量2)选择合适的蛋白酶抑制剂，避免蛋白降解，从而保证检测的准确性！2、蛋白定量常用的蛋白定量方法：Bradford assay, Lowry assay 或BCA assay。
定量后，可根据情况将标本保存在-20°C /-80°C 备用，进行免疫沉淀（IP）或者直接进行电泳分离蛋白3、蛋白质的分离根据目的蛋白的性质，利用电泳方法将其进行分离。
为提高电转移的效率，通常采用SDS/PAGE技术。
分离实验结束后，首先将样品墙的上边缘用小刀去除，然后在胶板的右上角切一个小口以便定位，小心放入转移缓冲溶液中待用。
详细介绍westernblot
详细介绍westernblotWestern blot（也称为蛋白印迹法）是一种常用的分子生物学技术，用于检测特定蛋白质在复杂混合物中的存在和表达水平。
该技术是通过使用亲和力进行特异性识别，结合电泳和免疫检测技术，从而能够分离和检测复杂混合物中特定蛋白质的目标。
Western blot技术的步骤可以分为样品制备、蛋白质分离、电泳传输、印迹、检测和图像分析。
首先，在样品制备阶段，需要从细胞或组织中提取蛋白质。
这通常涉及到对样品进行裂解，以释放蛋白质，并添加蛋白质抑制剂以避免蛋白质降解。
接下来，需要用一种分离方法（如聚丙烯酰胺凝胶电泳）将蛋白质按照大小进行分离。
其次，通过电泳播迁将分离的蛋白质转移到聚丙烯酰胺凝胶膜上。
在此过程中，聚丙烯酰胺凝胶膜的上、下端通过卷曲与电泳缓冲流体连接，形成电场。
由于电正极在凝胶的远侧，而负极在近侧，蛋白质被运移到膜上，此过程被称为“电泳传输”。
第三步是印迹。
在印迹过程中，将膜上的蛋白质固定住，并用抗体与所需检测的特定蛋白质结合。
这通常涉及到用一种阻断试剂（如牛血清蛋白或非脂牛乳）阻断膜表面非特异性结合位点，并使抗体能够特异性地与目标蛋白质结合。
然后，在检测阶段使用适当的二抗标记物来检测结合在蛋白质上的主抗体。
常用的标记物有辣根过氧化物酶（HRP）和碱性磷酸酶（AP），它们能够与特定底物产生可视化的颜色。
最后，通过用相应的检测设备（如摄像机或化学发光成像系统）显示并分析Western blot的结果。
这些图像可以用来确定蛋白质的存在和表达水平，并且可以与其他样品进行定性和定量比较。
Western blot技术在生物医学研究中有着广泛的应用。
例如，它可以用于检测一些特定蛋白质的存在和表达水平，从而帮助研究人员了解蛋白质的功能和调控机制。
此外，Western blot还可以用于检测抗体在临床诊断中的应用，如检测病原体感染、疾病标志物或药物残留物。
值得注意的是，Western blot技术也存在一些限制。
蛋白免疫印迹(Western Blot)技术手册
注：大蛋白和小蛋白的转膜
电转移缓冲液中 SDS 与甲醇的平衡、蛋白的大小、胶的浓度都会影响转膜效果，如下调整 可以增加转膜效率：
大蛋白（大于 100 KD） 1．对于大蛋白而言，其在凝胶电泳分离迁移较慢，而从凝胶转出也非常慢，因此对于这种 大分子量蛋白应该用低浓度的凝胶，8%或更低，但因低浓度的胶非常易碎，所以操作时需十 分小心， 2.大蛋白易在凝胶里形成聚集沉淀，因此；转膜时在电转移缓冲液加入终浓度为 0.1%的 SDS， 以避免出现这种情况，甲醇易便 SDS 从蛋白上脱失，因此应降低电转移缓冲液中甲醇的浓 度至 10%或更低，以防止蛋白沉淀。 3.降低电转移缓冲液中甲醇的比例以促进凝胶的膨胀，易于大蛋白的转出。
3．简略步骤
宝枫林
4. 蛋白样本提取制备
蛋白样品制备是 Western Blotting 的第一步，更是决定 WB 成败的关键步骤，总体原则和注 意事项： （1）尽可能提取完全或降低样本复杂度只集中于提取目的蛋白（通过采用不同提取方法或 选择不同的试剂盒产品） （2）保持蛋白的处）提取过程防止蛋白降解、聚集、沉淀、修饰等，（低温操作，加入合适的蛋白酶和磷酸 酶抑制剂） （4）尽量去除核酸，多糖，脂类等干扰分子（通过加入核酸酶或采取不同提取策略） （5）样品分装，长期于-80 ℃中保存，避免反复冻融。
考马斯蓝法：用 40%双蒸水, 10% 醋酸, 50%甲醇的溶液固定胶中蛋白，考马斯蓝 R-250 染液 （凯基产品）室温染色 4 小时至过夜，保持摇匀，转入 67.5%双蒸水, 7.5% 醋酸, 25%甲醇 l 摇 匀至脱去多余的染料，蛋白被染成深蓝色。
8.2 蛋白转膜 蛋白因结合 SDS 而带电荷，在电场下从胶中转至膜上，转膜操作根椐电转仪制造商的说明
Western-Blot-原理和操作方法(全)要点
Western Blot 原理和操作方法（全）工作原理蛋白质的电泳分离是重要的生物化学分离纯化技术之一,电泳是指带电粒子在电场作用下,向着与其电荷相反的电极移动的现象.根据所采用的支持物不同,有琼脂糖凝胶电泳,淀粉凝胶电泳,聚丙烯酰胺凝胶电泳等.其中,聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)由于无电渗作用,样品用量少(1-100μg),分辨率高,可检出10-9-10-12mol的样品,凝胶机械强度大,重复性好以及可以通过调节单体浓度或单体与交联剂的比例而得到孔径不同的凝胶等优点而受到广泛的应用.SDS-PAGE是最常用的定性分析蛋白质的电泳方式,特别是用于蛋白质纯度检测和测定蛋白质分子量.PAGE能有效的分离蛋白质,主要依据其分子量和电荷的差异,而SDS-PAGE(SDS变性不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳)的分离原理则仅根据蛋白质的分子量的差异,因为SDS-PAGE的样品处理液是在要跑电泳的样品中假如含有SDS和巯基乙醇(2-ME)或二巯基赤藓醇(DTT),其可以断开半胱氨酸残基之间的二硫键,破坏蛋白质的四级结构,SDS是一种阴离子表面活性剂即去污剂,它可以断开分子内和分子间的氢键,破坏蛋白质分子的二级及三级结构,并与蛋白质的疏水部分相结合,破坏其折叠结构,电泳样品假如样品缓冲液后,要在沸水中煮3-5分钟使SDS 与蛋白质充分结合形成SDS-蛋白质复合物,SDS-蛋白质复合物在强还原剂巯基乙醇存在时,蛋白质分子内的二硫键被打开而不被氧化,蛋白质也完全变性和解聚,并形成榛状结构,稳定的存在于均一的溶液中,SDS与蛋白质结合后使SDS-蛋白质复合物上带有大量的负电荷,平均每两个氨基酸残基结合一个SDS分子,这时各种蛋白质分子本身的电荷完全被SDS掩盖,远远超过其原来所带的电荷,从而使蛋白质原来所带的电荷可以忽略不计,消除了不同分子之间原有的电荷差别,其电泳迁移率主要取决于亚基分子质量的大小,这样分离出的谱带也为蛋白质的亚基.样品处理液中通常加入溴酚蓝染料, 溴酚蓝指示剂是一个较小的分子,可以自由通过凝胶孔径,所以它显示着电泳的前沿位置,当指示剂到达凝胶底部时,即可停止电泳.另外样品处理液中也可加入适量的甘油或蔗糖以增大溶液密度,使加样时样品溶液可以沉入样品加样槽底部.重要参数①聚丙烯酰胺凝胶(PAG)制备原则:由于孔径的大小取决于单体和双体丙烯酰胺在凝胶中的总浓度(T)以及双体占总浓度的百分含量即交联度(C)决定的,因而制胶之前必须首先知道这两个参数.一般可以由下述公式计算:T%=(a+b)/m*100%; 和C%=a/(a+b)*100%其中: a=双体(bis)的重量;b=单体(arc)的重量;m=溶液的体积(ml)②当分析一个未知样品时,常常先用7.5%的标准凝胶制成4-10的梯度凝胶进行试验,以便选择理想的胶浓度.如果蛋白质的分子量已知,可参考下表选择所需凝胶浓度:蛋白质分子量范围(Da) 适宜的凝胶浓度(%)<10420-301×104-4×10415-204×104-1×10510-151×105-5×1055-10>5×1052-5蛋白分子量 (kDa)凝胶浓度 (%)4-40 20 12-45 15 10-70 12.5 15-100 10 25-2008③分离胶（5ml 体积）:5%的积层胶的配置：蛋白质的样品制备：蛋白质的样品制备是Western Blotting 的第一步，样品制备是关键步骤，要求尽可能的获得所有蛋白质，应注意以下问题：1：在合适的盐浓度下，应保持蛋白质的最大溶解性和可重复性。
(整理)WesternBlot实验技术
四川大学硕士研究生课程考试试卷四川大学生命科学学院制Western blot摘要：本文主要是针对Western blot的原理及操作进行了简单的阐述，Western印迹法是利用抗原抗体的免疫反应，先将蛋白通过SDS-PAGE电泳分离开来，然后再利用电场力的作用将胶上的蛋白转移到固相载体（NC膜）上，然后再加抗体形成抗原抗体复合物，利用发光或显色原理将结果显示到膜或底片上。
同时对Western blot在实际操作中应注意的细节问题进行了归纳以及与其它免疫技术就抗体检测方面进行了比较。
关键词：Western blot；免疫反应抗体；转膜；显色；蛋白条带印迹法是指将样品转移到固相载体上，而后利用相应的探测反应来检测样品的一种方法。
1975年，Southern建立了将DNA转移到硝酸纤维素膜（NC）上，并利用DNA-RNA杂交检测特定的DNA片段的方法，称为Southern印迹法。
而后人们用类似的方法，对RNA和蛋白质进行印迹分析，对RNA的印迹分析称为Northern印迹法，对单向电泳后的蛋白质印迹分析称为Western印迹法（Western blot），对双向电泳后蛋白质分子的印迹分析称为Eastern印迹法。
一、Western blot的原理Western blot的发明者一般认为是美国斯坦福大学的乔治·斯塔克（George Stark）。
在尼尔·伯奈特（Neal Burnette）于1981年所著的《分析生物化学》（Analytical Biochemistry）中首次被称为Western Blot。
Western blot首先是要将电泳后分离的蛋白从凝胶中转移到NC膜上，通常有两种方法：毛细管印迹法和电泳印迹法。
毛细管印迹法是将凝胶放在缓冲液浸湿的滤纸上，在凝胶上放一片NC膜，再在上面放一层滤纸等吸水物质并用重物压好，缓冲液就会通过毛细作用流过凝胶。
缓冲液通过凝胶时会将蛋白质带到NC膜上，NC膜可以与蛋白质通过疏水作用产生不可逆的结合。
高分文献中的定量WesternBlot是如何实现的？
高分文献中的定量WesternBlot是如何实现的？Western Blot 是分子生物学中研究蛋白的经典方法，被广泛应用于检测细胞或组织样本中蛋白表达量。
传统的Western Blot被认为是定性或半定量Western Blot，那么高分文献中的定量Western Blot （Quantitative Western Blot）是如何实现的？基因小编和您一起来了解定量Western Blot。
首先需要明确：什么是定量Western Blot？为什么要对Western Blot进行定量分析？如何实现定量Western Blot？一、什么是定量Western Blot？定量Western Blot：是指信号和靶蛋白量成很好的线性比例关系，如果用标准蛋白做标准曲线可以得到目的蛋白准确的定量信息，与Real-Time PCR（以下简称qPCR）有异曲同工之妙。
文献中定量Western Blot使用最多的成像技术是LI-COR Odyssey双色近红外荧光成像，并且经查证定量Western Blot领域中LI-COR Odyssey有超过一万多篇文献数量（HighWire）。
二、为什么要对Western Blot进行定量分析？分子生物学研究中，核酸水平的研究常用PCR的方法进行定性或半定量研究，用qPCR的方法进行定量分析；而在蛋白质水平的研究，传统的Western Blot仅能进行定性或半定量研究，想要实现准确的定量研究，必须使用定量Western Blot的方法。
很多发表的文章中都采用qPCR方法对mRNA表达水平进行定量分析，并同时用LI-COR Odyssey 定量Western Blot方法对蛋白表达水平进行定量分析。
如2015年发表在Cell Stem Cell上的一篇文章（介绍神经精神疾病建模过程使用基因条件敲除，发现NRXN1中杂合突变引起突触传递缺陷现象，证明人类神经元中杂合NRXN1突变会伴随CASK蛋白表达上调），作者分析了mRNA水平包括CASK mRNA（使用定量PCR方法，图A）和蛋白水平的变化（使用LI-COR Odyssey 定量Western Blot方法，图B），文章显示cKO和cTr NRXN1突变体iN细胞中CASK蛋白水平增加60％-80％，定量PCR和定量WesternBlot 结果相辅相成，与其他方法共同揭示了NRXN1的杂合失活直接损害人类神经元突触功能。
近红外荧光WB的优化-201605
绿色：Tubulin；红色：Actin
信号“交叉”
双色Western blot Highly cross-absorbed secondary antibody
LI-COR offers IRDye whole IgG (H + L) secondary antibodies and IRDye Subclass Specific secondary antibodies.
TBS体系的封闭液可能更适合检测磷酸化蛋白质。
Phospho-Akt
Phospho-EGFR
去垢剂的使用
Tween20
封闭液中不加Tween20 NC膜：一抗二抗稀释液加0.1-0.2% Tween20；
PVDF膜：一抗二抗稀释液加0.1% Tween20，过高会增加背景 Wash buffer加0.1% Tween20
降低背景：膜、封闭液、去垢剂、一抗
图像上出现气泡
气泡
转膜过程中 的气泡
膜和扫描平 台之间气泡
扫描平台的清洁：灰尘、染料等
图像上出现白点
Intensity
• 检测高丰度蛋白质 时容易出现，比如 Loading control； • 降低扫描强度； • Odyssey CLx选择 Auto模式；
条带框选 背景校正 数据导出
背景校正
稀释范围： 1:5000-1:25000 建议: 1:15000-1:20000 二抗浓度不同，图像 背景有所差异，可通 过调整扫描时的 intensity来进行调 整，或成像结束后调 整图像Sensitivity、 亮度和对比度。
默认设置 Intensity=5 Sensitivity =Auto
高灵敏定量western blot的伙伴——Azure Bosystems 新一代分子成像分析系统
高灵敏定量western blot的伙伴——Azure Bosystems 新一代分子成像分析系统Werstern Blot是蛋白相关研究的常规方法之一，随着科学技术的进步和对蛋白研究的深入，从原来简单的高丰度蛋白转为人们更感兴趣的低丰度蛋白的研究。
随着研究难度的加大，对检测手段的要求也加大。
Western Blot主要是依靠化学发光作为检测手段，用怎样的检测方法决定了实验者是否能观察到自己想要的蛋白。
压片法是以前人们最常用的化学发光检测手段，但随着冷CCD技术的问世、兴起、成熟，现在很多实验室都采用数字成像采集图像代替传统的压片方法。
化学发光是公认的检测Western blot最为灵敏的方法，灵敏度可以达到fg级。
但决定灵敏度最终是否能检测到目的蛋白与Western Blot许多流程有关联，包括上样量，转膜效率的好坏，成像仪器的好坏等等，每一环节都可能影响其检测的灵敏度。
Azure公司一直致力于Western blot提供良好的解决方案。
压片的灵敏度和图像的锐利度确实得到公认，但是他存在很大的局限性，特别是在操作过程繁琐和动态范围所体现出来的不足。
AzureC系列的设计的最终目的就是让实验者摆脱繁琐的操作步骤和反复曝光所带来的实验误差。
Azure C 系列采用830MP像素，F0.95的镜头，，超高品质的CCD，触摸屏平板电脑，简单化的操作成像软件，将AzureC系列成像的灵敏度和成像质量可以提高到胶片级甚至替代胶片级。
与此同时，AzureC系列兼具多色荧光和近红外荧光的功能，能够得到更准确的上样量控制和蛋白定量的效果，能够给实验者带来更高的成像体验，成像质量和灵敏度都可以和胶片相媲美，给实验者更便捷的体验。
同时AzureC系列还整合了SSG免染胶Western Blot技术，免染胶对转膜起到一个实时监控的作用，节省实验者考染脱色的时间，环保无毒，使用方便，简化转膜的过程。
免染技术可在跑完蛋白胶之后再AzureC系列上紫外激活成像，AzureC系列标配302nm和365nm双波长，可以用302nm激发，365nm采集图像，达到最佳效果。
PearlTrilogy小动物活体成像系统-生物通
Pearl® Trilogy 近红外荧光&生物发光小动物活体成像系统2LI-COR公司美国LI-COR公司是近红外荧光技术研究的创始者。
公司自1971年成立以来，一直致力于近红外荧光技术标记和检测系统的研究。
公司基于近红外荧光专利技术研发的Odyssey双色红外激光成像系统已经成为定量Western Blot检测的金标准。
Pearl Trilogy是LI-COR公司推出的一款专业的近红外荧光和生物发光成像系统，专为小动物活体成像量身定做。
该系统保持了近红外荧光在活体成像中背景低，穿透力好的特点，同时具备生物发光检测的能力，满足客户多样的需求。
此外，仪器操作简便，您无需成为仪器的操作专家，就可以获得高质量的实验结果。
2FieldBrite TMXi 2 技术是Pearl Trilogy成像系统的核心。
FieldBrite TM Xi 2 专门优化用于小动物活体成像，保证获取高质量的实验数据。
确保整个荧光成像区域有均匀的光照，从而能够准确地检测到非常小的变化。
以近红外激光器为光源，获得最佳的信噪比，从而检测到动物体内深层的目标。
业界领先的6个数量级的动态范围，避免信号饱和，因而能够用相同的相机参数获取图像。
将小鼠器官（大脑）放置在6个不同的位点分别成像，整个视野的CV值<3%。
重复性对于研究至关重要。
因为很多研究是纵向研究，所以图像上观察到的变化必须反映真实的生物学变化，而不是源于光学系统的局限。
FieldBrite Xi 2能够产生均匀的光照（CV< 3%）。
激光光源在整个研究过程中保持稳定，从而保证图像上观察到的变化源于真实的生物学过程。
均匀照明卓越的灵敏度宽动态范围3组织对近红外波段的光吸收最低，且该波段的光散射也少，从而保证更好的组织穿透性。
在近红外波段，动物组织的自发荧光显著降低，因此能够得到更优的信噪比。
近红外激光器的激发光波长分布集中、能量高，与近红外荧光染料相得益彰，提升整体表现。
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— +EGF
— +EGF
800 nm channel
ERK
700 nm channel
phospho ERK
700 and 800 nm
Results Overlaid
EGF刺激后A431细胞，ERK1 and ERK2 (p44/42 MAP kinases) 磷酸化情况, 一抗分别是兔抗ERK抗体和小鼠 抗磷酸化ERK抗体,二抗用抗兔的IRDye800 标记的抗体 (green),和抗鼠的 Alexa680 标记的抗体 (red)。叠加后 为黄色，黄色的深浅即代表了磷酸化水平的高低，并且可以通过软件进行准确的量化分析。
Pearl活体成像流程简单
EGF-IRDye 800CW probe
Custom labeling
HA
2dGlucose IRDye 800CW probe
IRDye800CW
RGD-IRDye 800CW
PEG-IRDye 800CW probe
BoneTag-IRDye 800CW
CellVue NIR815 cell stain
11/10/2012
红外荧光－直接检测
Infrared dye (IRD800, Alexa680)
膜上抗原
一抗结合
不需要底物 不需要底片/暗室 信号持久
红外标记的二抗
Odyssey直接扫描
Odyssey—双色同时检测
• 两套独立激发检测系统 • 700通道：680nm激发 720nm检测 • 800通道：780nm激发 820nm检测
近红外荧光法
• 近红外荧光法能检测到0.6pg的蛋白（灵敏度高） • 近红外荧光成像呈现一个很好的线性（定量准确）
Moose Imaging – Signal/Background
Background
High S/B
Low S/B
近红外：低背景，高信噪比
近红外荧光的波长范围在700-800 nm之间，避开了NC膜、PVDF 膜微孔板等耗材的本底信号，提高了检测的信噪比和相对灵敏度
信号恒定，准确定量 荧光成像 膜上直接观察到Marker 两种蛋白同时检测
近红外荧光成像技术
• 荧光——准确定量、线性范围宽广 • 红外——背景低、信噪比高 • 双色——同时检测、同时输出
荧光－准确定量
化学发光
• 动态信号－信号随时间变化 • 信号不与目标蛋白浓度成比例关系
荧光
• 静态信号－信号不随时间变化 • 信号和目标蛋白浓度成比例关系
800 nm
Better Excitation Efficiency
800 nm
Cleaner Detection
LEGEND
Better Sensitivity
Absorption Spectra of Dye Emission Spectra of Dye Li2
In-Cell Western Assay
细胞处理效果和药物筛选的最佳选择
In-Cell Western Assay 快速、高通量、重现性好
细胞培养 细胞刺激 固定和透化 细胞裂解
上样 电泳 转膜 孵育抗体 成像 通量
膜上Western
√ √
√ √ √ √ √ √ 12 sample/Gel
NIR EMSA - 告别同位素！
（体外核酸和蛋白相互作用）
700 nm Channel
700 and 800 Overlay
DNA-Protein Complex Unbound DNA IRDye 800 Unbound DNA IRDye 700
800 nm Channel
Binding of T7 RNAP to two DNA fragments containing the T7 promoter sequence, labeled with either IRDye 700 (red) or IRDye 800 (green).
Saturation
INTENSITY
Background 0,0
TIME
High concentration / signal
0,0
Medium concentration / signal
TIME
Low concentration / signal
红外荧光 VS 化学发光
定量线性范围更宽
化学发光法
Source Excitation Light
Quality of Light
Excitation Efficiency
Background Noise
Overall Performance
800 nm
800 nm
800 nm
800 nm
NIR Laser Benefit
Lower Power
More Light
In-Cell Western √ √ √
√ √ 96或384/Plate
11/10/2012
NIR - 小动物活体成像
低
GFP
RFP
IRDye®
高
背
信
景
噪
比
11/10/2012
• 组织和细胞对近红外波长的光信号吸收最低 • 红外波段，光的散射更低 • 在近红外波长范围，自发荧光更低
波长特异性激光器作为激发光源
近红外荧光成像平台
Odyssey Fc
Odyssey CLx
Odyssey Sa
Pearl
近红外荧光成像的权威！
11/10/2012
总结
• 准确定量 —提供更完善的数据，提升文章档次 • 成像效果好 —背景低，条带清晰，没有吹泡现象 • 双色检测 —靶蛋白+总蛋白+Maker 同时检测 • 成本低 —无需底物，无需胶片，无需暗室，二抗
注射Pan-IR700 300µg的第一天即接种A431-HER1肿瘤细 胞系的第5天（此时肿瘤的大小已经长到＜500mm³）， 用IR照射小鼠，发现A431肿瘤体积明显减小。
IRDye800CW-coupled Fe3O4 nanoparticles 进行细胞标记和活体成像
J Nanobiotechnology. 2010 Oct 29; 8:25. Manufacture of IRDye800CW-coupled Fe3O4 nanoparticles and their applications in cell labeling and in vivo imaging. Hou Y, Liu Y, Chen Z, Gu N, Wang J. State key Laboratory of Bioelectronics, Southeast University, Nanjing 210096, China. wangjinke@.
近红外荧光成像技术
- 定量Western Blot的新标准
基因有限公司 李春燕
化学发光检测
近红外荧光检测
680 laser
800 laser
11/10/2012
化学发光检测
红外荧光检测
酶促化学反应，无法准确定量 暗房曝光 膜上无法直接观察到Marker 两种蛋白检测需Strip
11/10/2012
稀释倍数高
• 扩展应用 —ICW，EMSA，小动物活体成像等 • 近红外荧光系统平台市场占有率高，发表文献多
11/10/2012
Thank you!
11/10/2012
800 nm
700 nm
Overlay
双色－定量western检测
Target protein Anti-rabbit 800 channel
Normalizer target Anti-mouse 700 channel
11/10/2012
杂交条件均等，结果同时输出，直接比对
双色－蛋白磷酸化
— +EGF