Folin-酚试剂法测蛋白质含量

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2-folin-酚试剂法测定蛋白质含量

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绘制标准曲线-1
以A500值为纵坐标，牛血清白蛋白标准液浓度为横坐标，用铅笔绘制标准曲线。
吸光度A
0.6 0.4 .
.
.
0.2 . 40 80 120 160 蛋白质浓度C（μg/ml）
（要写图题）
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绘制标准曲线-2
根据所描点的分布情况，作直线或光滑连续的曲线，该线表示实验点的平均变动情况，因此该线不需全部通过各点，但应尽量使未经过线上的实验点均匀分布在曲线或直线两侧。
ห้องสมุดไป่ตู้
复习思考题
1、试述Folin-酚试剂法的优点？ 2、应用本方法有哪些干扰作用？为什么？应如何注意？
请将答案附在实验报告上！
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值日生工作
实验完毕，组长登记实验室使用记录。关闭仪器电源。
清洁、归整实验台面，扫地、倒垃圾。
回收试剂：将血清、Folin-酚试剂、牛血清白蛋白标准液试剂收回放至准备室冰箱。碱性硫酸酮试剂（每天最后实验的专业负责倾倒并清洗干净，将试剂瓶放至准备室）。
注意事项2
因Lowry反应的显色随时间不断加深，因此各项操作必须精确控制时间。
即第1支试管加入2.0mL碱性硫酸铜试剂后，开始计时，1分钟后，第2支试管加入2.0mL碱性硫酸铜试剂，2 分钟后加第3支试管，以此类推。全部试管加完碱性硫酸铜试剂后若已到10分钟，则第1 支试管可立即加入0.20mL Folin-酚试剂，1分钟后第2 支试管加入0.20mL Folin-酚试剂，2分钟后加第3支试管，以此类推。
什么是双缩脲反应？
两分子尿素加热脱氨缩合成的双缩脲（H2N-OC-NH-CO-NH2），因分子内含有两个邻接的肽键，在碱性溶液中可与Cu2+发生双缩脲反应，生成紫红色络合物。

folin酚试剂法测定蛋白质含量实验过程

folin酚试剂法测定蛋白质含量实验过程以folin酚试剂法测定蛋白质含量实验过程为标题一、引言蛋白质作为生物体内最重要的有机大分子之一，在生物学研究、生物医学和食品科学等领域中具有广泛的应用。

准确测定蛋白质的含量对于科学研究和实验分析至关重要。

本文将介绍一种常用的方法——folin酚试剂法测定蛋白质含量。

二、实验原理folin酚试剂法利用蛋白质中的酪氨酸、色氨酸和组氨酸等具有芳香环的氨基酸与酚试剂发生氧化反应，在碱性条件下生成蓝色化合物，通过测定其吸光度从而计算蛋白质的含量。

该方法具有灵敏度高、操作简便等优点。

三、实验步骤1. 样品制备：将待测蛋白质样品溶解于适量的缓冲液中，使样品浓度控制在合适的范围内，通常为0.1-1.0 mg/mL。

2. 加入酚试剂：取适量的样品溶液，加入等体积的folin酚试剂。

3. 摇匀并静置：用试管或离心管摇匀试剂和样品，然后静置15-30分钟，使试剂与蛋白质充分反应。

4. 吸光度测定：将反应体系转移到光波长范围在650-750 nm之间的比色皿中，以空白试剂为对照，使用分光光度计测定吸光度。

5. 绘制标准曲线：取一系列已知浓度的标准蛋白质溶液，按照上述步骤进行处理和测定，绘制蛋白质浓度与吸光度之间的标准曲线。

6. 计算样品蛋白质含量：根据样品的吸光度值和标准曲线，通过插值或计算得出样品中蛋白质的含量。

四、结果与讨论将实验得到的吸光度值代入标准曲线中，可以得到样品中蛋白质的含量。

folin酚试剂法对于大多数蛋白质都有较好的测定效果，但对于一些特殊的蛋白质，如硫酸肌酸和硫酸软骨素等，可能会出现干扰。

此外，在使用过程中应注意控制各步骤的操作时间和条件，以保证实验的准确性和可重复性。

五、实验注意事项1. 保持实验环境清洁，避免杂质对结果的影响。

2. 注意使用过期的试剂可能导致结果的偏差。

3. 操作时要注意避免酚试剂和其他化学品的接触，避免引起意外事故。

4. 在吸光度测定时，应使用适当范围的波长，避免光吸收过高或过低。

Folin-酚试剂法测定蛋白质含量

Folin-酚试剂法测定蛋白质含量Folin-酚试剂法测定蛋白质含量一、实验目的1，掌握Folin-酚试剂法测定蛋白质含量的原理及其具体实验操作技术；2，掌握制作标准曲线的要领；3，学会通过标准曲线求样品溶液中待测定物质含量的方法。

二、实验原理1，蛋白质分子中含有的肽键在碱性条件下可以与Cu2+螯合形成蛋白质- Cu2+复合物，即发生双缩脲反应。

而此复合物中的含酚羟基的酪氨酸或色氨酸残基可以还原Folin-酚试剂的磷钼酸盐-磷钨酸盐，产生蓝色化合物（钼蓝和钨蓝的混合物），即发生Folin-酚显色反应。

同时，在碱性条件下Folin-酚试剂极不稳定，从而易被蛋白质还原而呈蓝色反应。

2，在一定浓度范围内，蓝色化合物的蓝色深浅与蛋白质浓度呈正比。

故通过测定相应浓度梯度的蛋白质标准溶液吸光度可依其作出标准曲线，以此绘制的标准曲线和供试品中蛋白质溶液吸光度可求出供试品中蛋白质的含量。

三、材料和方法样品：健康人血清（300倍稀释）；正常人血清蛋白质含量：60~80 g/L试剂：牛血清白蛋白标准液（200µg/ml）；碱性硫酸铜溶液（现配）；Folin-酚试剂仪器与器材： V-1100分光光度计；恒温水浴箱；试管6支、试管架；加样枪、加样枪架；坐标纸实验步骤示意详细步骤A ，配置一定浓度梯度溶液: 取6支试管分别编号1至6，按下表加样。

（1作空白对照，2-5作标准，6为待测样品）1，加样时按横向顺序加样，并在加入碱性硫酸铜时：于一号试管加入碱性硫酸铜溶液2ml 后等待一分钟再往下一支试管加入同量的碱性硫酸铜溶液，摇匀。

如此类推混匀并将其静置在室温下。

2，在全部试管加完碱性硫酸铜试剂之至距第一支试管加样10分钟后，于第1支试管立即加入0.20mL Folin-酚试剂，并于2s 内摇匀。

1分钟后第2支试管加入0.20mL Folin-酚试剂，2分钟后加第3支试管，以此类推。

B ，加样完毕后将各试管每隔1min 按1-6顺序放一只试管入水浴箱，分别40℃水浴10min 后取出冷却至室温。

蛋白质含量测定方法folin—酚试剂法

蛋白质含量测定方法——Folin—酚试剂法Folin—酚试剂法是一种常用的蛋白质定量方法，其原理是蛋白质分子中酪氨酸和半胱氨酸残基在Folin试剂存在下氧化成碘，与酚试剂结合形成一种蓝色复合物。

由于蛋白质的量与Folin 试剂呈正比，因此可以通过比色法测定蛋白质含量。

步骤：1. 准备一系列浓度的标准蛋白质溶液（从低到高），并设置空白对照。

2. 取一定量的Folin试剂和样品混合，充分摇匀后静置2-3分钟。

3. 用酚试剂对样品进行稀释，制备出一系列浓度的标准样品。

4. 对比观察各标准样品的颜色变化，找到蛋白质浓度和颜色的对应关系。

5. 绘制标准曲线，再用于样品蛋白质的测定。

6. 根据样品中剩余的Folin试剂颜色，求出样品中的蛋白质含量。

注意事项：1. 必须严格控制反应温度和时间，以免影响测定的准确度。

2. 在加入Folin试剂后，需要摇动几次以确保充分反应。

3. 如果要测定的样品含有维生素C或其他具有抗氧化性质的物质，需要事先进行去除或中和。

4. 对于浓度过高的样品，建议先进行稀释再进行测定。

在实践中，除了遵循以上步骤，还可以参考以下技巧和经验：* 使用干净的玻璃器具来操作，避免使用塑料器具导致的颜色干扰。

* 在加入Folin试剂后，可以加入少量无水乙醇来稳定颜色反应。

* 在绘制标准曲线时，可以使用不同浓度的标准蛋白质溶液制备一系列梯度样品，这样可以更准确地找到蛋白质浓度和颜色的对应关系。

* 对于未知样品，可以先进行预实验，大致确定蛋白质浓度范围，以便更好地控制实验进程。

总之，Folin—酚试剂法是一种简便、灵敏的蛋白质定量方法，通过遵循正确的步骤和注意事项，可以获得较为准确的测定结果。

Lowry’s法(Folin-酚试剂法)

然后乘以稀释倍数（300），得出每毫升未稀释血清含蛋白质的微克数，即每毫升血清中蛋白质的微克数(μg/ml)。
血清蛋白浓度(μg/ml)=样品蛋白质浓度×2×300
本方法的特点：
优点：1.灵敏度高，比双缩脲法灵敏约100倍。 2.操作简单，不需特殊仪器设备。
缺点：1.费时间较长，要精确控制操作时间 2.标准曲线也不是严格的直线形式 3.专一性较差，干扰物质较多。
– 水浴10min，冷却后，每一分钟测一管。
数据处理
各管A值
测定次数
2
3
4
5
6
1
2
3
各管平均A值
绘制标准曲线
以A500值为纵坐标，牛血清白蛋白标准液浓度为横坐标，绘制标准曲线。
吸光度A
0.6
.
0.4
.
.
0.2
.
蛋白质浓度C（μg/ml）
计算
根据未知样品溶液的吸光度值，在绘制好的标准曲线图中查出样品溶液中的蛋白质含量。
40
0.60 2.0
80
0.40 2.0
120
0.20 2.0
160
0.50 0.50 2.0
未知
各管混匀，室温放置10min。向各管内加入Folin-酚试剂0.20mL, 2s内迅速混匀！ 40℃放置10min。冷却至室温后，以500nm波长比色，用1号管作空白，读取各管吸光度。
注意事项
复习思考题
1、试述Folin-酚试剂法的优点？ 2、应用本方法有哪些干扰作用？为什么？应
如何注意？
请将答案附在实验报告上！
Lowry’s法（Folin-酚试剂法）测定蛋白质含量
Determination of protein content by Lowry‘s method

folin酚试剂法测定蛋白质含量

注意事项2
因Lowry反应的显色随时间不断加深，因此各项操作必须精确控制时间。
– 即第1支试管加入2.0mL碱性硫酸铜试剂后，开始计时，1分钟后，第2支试管加入2.0mL碱性硫酸铜试剂，2 分钟后加第3支试管，以此类推。 – 全部试管加完碱性硫酸铜试剂后若已到10分钟，则第1 支试管可立即加入0.20mL Folin-酚试剂，1分钟后第2 支试管加入0.20mL Folin-酚试剂，2分钟后加第3支试管，以此类推。
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选择测定方法时应考虑
实验对测定所要求的灵敏度和精确度；蛋白质的性质；
溶液中存在的干扰物质；
测定所花费的时间等。
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本法概述
1921年，Folin 首创，利用蛋白质分子中酪氨酸和色氨酸残基（酚基）与还原酚试剂（磷钨酸 -磷钼酸）起蓝色反应。 1951年，Lowry对此法进行了改进，先于标本中加碱性铜试剂，再与酚试剂反应，提高了灵敏度。
试剂
1.牛血清白蛋白标准液（200μg/ml）
2.碱性硫酸铜溶液（当日有效） 3.Folin-酚试剂
仪器与器材
1.V-1100分光光度计
2.恒温水浴箱 3.试管6支、试管架 4.加样枪、加样枪架
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操作步骤
取6支试管，做好标记，按下表顺序操作：
加入物（ml） 1 2 3 4 5 6
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V-1100分光光度计操作步骤
开机，预热30分钟转动波长旋钮，调所需波长。按将黑体放入光路中，合上盖，按
MODE 0%
键切换到T档键校零
开盖，将参比液按空白液、标准液、待测液顺序放入比色杯架上，合上盖，按键切换到A档 MODE

Folin-酚法测定蛋白质含量

实验二 Folin-酚法测定蛋白质含量一、目的要求了解Folin–酚法测定蛋白质的原理，掌握Folin–酚法测定蛋白质含量的分析方法。

二、实验原理用化学法测定蛋白质含量的方法主要有凯氏定氮法、双缩脲比色法、Folin–酚比色法、考马斯亮蓝比色法等。

凯氏定氮法多用于贮存蛋白的测定；后者常用于可溶性蛋白的含量分析，它们具有操作简便，迅速，可适合一般实验要求的特点。

其中Folin–酚法较双缩脲法灵敏100倍，与考马斯亮蓝比色法灵敏度相似，但干扰物对检测方法的影响不相同，选用时应予考虑。

Folin–酚试剂由甲、乙两部分组成。

作用机理是：首先蛋白质中的肽键与碱性铜盐产生双缩脲反应，生成铜—蛋白质复合物；然后该复合物还原磷钼酸—磷钨酸试剂，产生蓝色反应，其呈色强度与蛋白质含量成正比。

所测定蛋白质样品中若含有酚及柠檬酸均对实验有干扰。

浓度较低的尿素（约0.5%），三氯乙酸（约0.5%），乙醇（5%），丙酮（0.5%）等溶液对显色无影响。

若样品酸度较高，需提高碳酸钠—氢氧化钠溶液浓度1–2倍。

三、试剂和仪器（一）试剂1、酪蛋白标准溶液：称取50mg酪蛋白（预先用凯氏定氮法测定蛋白质含量），加30mL 0.05mol/L NaOH ，于磁力搅拌器下溶解，补加0.05mol/L NaOH 至100 mL。

酪蛋白含量0.5 mg/ mL。

2、Folin-酚试剂试剂甲：（1）4% Na2CO3；（2）0.2 mol/L NaOH；（3）1%CuSO4；（4）2%酒石酸钾钠溶液。

使用前，将（1）与（2）以等体积混合配置成Na2CO3–NaOH溶液；（3）与（4）以等体积混合，配成硫酸铜—酒石酸钾钠溶液；然后将这两种溶液以50:1的体积混合，即为Folin–酚试剂甲。

该试剂只能用一天，过期失效。

试剂乙：在1000 mL磨口回流装置内加入50g 钨酸钠（Na2WO4·2H2O），12.5g 钼酸钠（Na2M O O4·2H2O），350 mL 85%磷酸，50 mL浓盐酸，混匀。

Folin-酚法测定蛋白质含量

Folin-酚法测定蛋白质含量一、目的掌握Folin-酚法测定蛋白质含量的原理和方法，熟悉分光光度计的操作。

二、原理Folin-酚试剂法包括两步反应：第一步是在碱性条件下，蛋白质与铜作用生成蛋白质-铜络合物；第二步是此络合物将磷钼酸-磷钨酸试剂（Folin试剂）还原，产生深蓝色（磷钼蓝和磷钨蓝混合物），颜色深浅与蛋白质含量成正比。

此法操作简便，灵敏度比双缩脲法高100倍，定量范围为5～100μg蛋白质。

Folin试剂显色反应由酪氨酸、色氨酸和半胱氨酸引起，因此样品中若含有酚类、柠檬酸和巯基化合物均有干扰作用。

此外，不同蛋白质因酪氨酸、色氨酸含量不同而使显色强度稍有不同。

三、实验材料、主要仪器和试剂1．实验材料绿豆芽下胚轴（也可用其它材料如面粉）2．仪器（1）722型（或721型）分光光度计（2）4000r/min的离心机（3）分析天平（4）容量瓶（50mL）（5）量筒（6）移液管（0.5mL、1mL、5mL）3．试剂（纯度均为分析纯）（1）0.5mol/L NaOH(2)试剂甲：（A）称取10g Na2CO3，2g NaOH和0.25g酒石酸钾钠，溶解后用蒸馏水定容至500mL。

（B）称取0.5g CuSO4·5H2O，溶解后用蒸馏水定容至100mL。

每次使用前将（A）液50份与（B）液1份，即为试剂甲，其有效期为1d，过期失效。

（3）试剂乙：在1.5L容积的磨口回流器中加入100g钨酸钠（Na2WO4·2H2O）和700mL蒸馏水，再加50mL85％磷酸和100mL浓盐酸充分混匀，接上回流冷凝管，以小火回流10h。

回流结束后，加入150g硫酸锂和50mL蒸馏水及数滴液体溴，开口继续沸腾15min，驱除过量的溴，冷却后溶液呈黄色（倘若仍呈绿色，再滴加数滴液体溴，继续沸腾15min）。

然后稀释至1L，过滤，滤液置于棕色试剂瓶中保存，使用前大约加水1倍，使最终浓度相当于1mol/L。

04Folin酚法测定蛋白质含量

04Folin酚法测定蛋白质含量Folin酚法是一种测定蛋白质含量的方法，也被称为Lowry法。

该方法利用一种化学试剂（Folin酚试剂）与蛋白质结合形成复合物，进而产生颜色，利用光度计测量颜色强度，从而间接测定蛋白质的含量。

本文将对Folin酚法的操作流程、原理、注意事项等方面进行介绍。

Folin酚法的操作流程如下：1. 样品制备：将要测定蛋白质含量的样品加入到离心管中，并加入约5倍体积的碳酸氢钠（NaHCO3）溶液，使样品呈弱碱性，再加入NaCl，使浓度为50-100mM。

2. 加入Folin酚试剂：按照试剂的工业需求用水稀释Folin试剂，取样品中的0.1-2.0mL加入到TestTube中，再加入等量的加热后冷却的NaOH(1M) ，然后加入Folin试剂，快速摇匀并放置15分钟至30分钟。

会出现从棕色到蓝色等级变化（酚蓝色）。

3. 加入Na2CO3：在试管中加入5倍浓度的Na2CO3溶液，缓慢滴加并充分混合，使液体呈现深蓝色（如图），在紫外线灯下，黄色到红色颜色具有固定的比色距离和线性使用范围，通常是500-700nm。

4. 测量吸光度：样品和对照体使用小细长试管，在波长下读取吸光度数据。

对每一标准曲线，使用标准品生产的校正硝酸钠或牛清蛋白制备出蛋白标准品。

在制定标准曲线时，使用的标准品范围是0.1-1.0mg / ml因为该范围内蛋白质浓度的吸光度与蛋白质浓度之间的线性关系较好。

对一定量的蛋白质或多肽样品添加到含有Folin试剂和NaOH的试剂中，在碱性条件下，Folin试剂会被蛋白质中的酪氨酸、苯丙氨酸、组氨酸等还原物质还原，形成可被吸收的蓝色化合物。

随着Na2CO3添加，蛋白质中的肽键还原Cu2+为Cu+，与Folin试剂中还原少量的Cu2+形成可吸收的化合物，产生蓝色颜色。

其实质是铜离子作为氧化剂，被蛋白质中的酚类、组氨酸等还原，然后由还原形成的电子捕获剂向Folin试剂中的fosfomolybdate 复合物媒介过渡，形成可吸收的复合物，具体反应方程式如下：a. Cu(II)+RNHCO-R’-R’’ → Cu(I)+R-NH2 + R’CO-R’’（还原）b. Cu(I)+3MeOH+NaF-Fe(III)(CN)5(NO) → Fe(II)(CN)5NO+NaF+Cu(II)+3MeOHc. Folin-Ciocalteu试剂+Copper-chelating(还原Cu2+->Cu1)+MeOH+(±)Na2CO3 → (MeOH的)紫色染料吸收（‘Folin-Ciocalteu’光度分光光度），与Na2CO3浓度成比例注意事项：1.样品的体积或质量应该控制在不同范围内，不宜过多或过少。

生化大实验实验五Folin–酚试剂法测定蛋白质含量

进行测定时，加 Folin氏试剂要特别小心，因为 Folin氏试剂仅在酸性 pH条件下稳定，但上述还原反应只是在pH 10 的情况下发生，故当Folin氏试剂加到碱性的铜 - 蛋白质溶液中时，必须立即混匀，以便在磷钼酸 - 磷钨酸试剂被破坏之前，还原反应即能发生。
【操作步骤】
各管混匀后加入5mL试剂甲，混匀，于37℃放置10分钟。再加入0.5mL试剂乙（Folin氏试剂），立即振摇均匀，在37℃保温30分钟，然后于500nm或650nm比色测定。以吸光度为纵坐标，蛋白质浓度为横坐标绘制标准曲线。
这个测定法较双缩脲法灵敏得多，但要费较长时间。对双缩脲反应发生干扰的离子同样容易干扰Lowry反应，而且对后者的影响还要大得多。所测蛋白质样品中若含酚类及柠檬酸均有干扰作用。浓度较低的尿素（约0.5％左右）、胍（0.5％左右）、硫酸钠（1％）、硝酸钠（1％）、三氯乙酸（0.5％）、乙醇（5％）、乙醚（5％）、丙酮（0．5 ％）等溶液对显色无影响，这些物质浓度高时必须做校正曲线。含硫酸铵的溶液只须加浓碳酸钠 - 氢氧化钠溶液即可显色测定。若样品酸度较高，显色后色浅，则必须提高碳酸钠 — 氢氧化钠溶液的浓度1～2倍。
2.样品测定：取1.0mL样品溶液（约含20 ～250μg 多肽或蛋白质）于试管中，加入5mL试剂甲，混匀后同标准溶液测定。（本次实验样品取0.1加 0.9ml蒸馏水再测定）
3.结果与计算：根据测定管吸光度查标准曲线，由
标准曲线计算样品蛋白含量。
【试剂】
1.标准蛋白质溶液：可用结晶牛血清白蛋白，配制成250μg/mL的溶液。 2. Folin - 酚试剂的配制（均用分析纯试剂）：试剂甲：由下述四种溶液配制，（1）4％碳酸钠（Na2CO3）溶液；（2）0.2mol/L氢氧化钠溶液；（3）1％硫酸铜（CuSO4·5H2O）溶液；（4）2％酒石酸钾钠溶液（或酒石酸钾、酒石酸钠）。在使用前，将（1）与（2）等体积混合配成碳酸钠 — 氢氧化钠溶液，将（3）与（4）等体积混合配成硫酸铜 — 酒石酸钾钠溶液。然后将这两种溶液按50： 1的比例混合，即为Folin — 酚试剂甲。该试剂只能用一天，过owry法）测定蛋白质含量

folin酚试剂法测蛋白质含量测定实验报告.doc

生物化学实验报告姓名：学号：专业年级：组别：生物化学与分子生物学实验教学中心实验名称Folin-酚试剂法测蛋白质含量测定格式要求：正文请统一用：小四号，宋体，1.5倍行距；数字、英文用Times New Roman；标题用：四号，黑体，加粗。

需强调的地方请用蓝颜色标出。

不得出现多行、多页空白现象。

一、实验目的1、掌握Folin-酚试剂法测定蛋白质含量的原理及其实验操作技术。

2、掌握制作标准曲线的要领和通过标准曲线求样品溶液中待测定物质含量的方法。

二、实验原理Folin-酚反应是利用蛋白质分子中酪氨酸和色氨酸残基（酚基）还原酚试剂（磷钨酸-磷钼酸）起蓝色反应。

为了提高该反应的敏感度，先于标本中加碱性铜试剂，再与酚试剂反应。

1、双缩脲反应：在碱性溶液中,双缩脲(H2NOC－NH－CONH2)能与Cu2+作用,形成紫色或紫红色的络合物,这个反应叫做双缩脲反应。

由于蛋白质分子中含有与双缩脲结构相似的多个肽键,因此有双缩脲反应。

即在碱性溶液中，蛋白质分子中的肽键与碱性铜试剂中的Cu2+作用生成紫红色的蛋白质- Cu2+复合物。

2、Folin-酚显色反应：蛋白质或多肽分子中有带酚基酪氨酸或色氨酸，在碱性条件下，可使酚试剂中的磷钼酸化合物还原成蓝色（生成钼蓝和钨蓝化合物）。

在一定浓度范围内，蓝色的深浅度与蛋白质浓度呈线性关系，故与同样处理的蛋白质标准液比色即可求出蛋白质的含量。

即根据预先绘制的标准曲线求出未知样品中蛋白质的含量。

三、材料与方法：以流程图示意1、材料：①样品：健康人的血清（稀释300倍）②试剂：牛血清蛋白标准液（200μg/ml ）、碱性的硫酸铜溶液、蒸馏水、Folin-酚试剂③仪器及器材：V-1100型分光光度计、恒温水浴箱、试管6只、试管架、加样枪、加样枪架、加样枪头2① 取6支试管编号1~6，按下表依次加入试剂并混匀，室温放置10min 。

表格 1 Folin-酚试剂定量蛋白质实验步骤② 往6支试管中分别加入Folin-酚试剂0.20ml ，在2s 内立即混匀。

Folin-酚试剂法测定蛋白质含量Lowry基本法

㈡试剂乙（磷钼酸-磷钨酸混合液）受蛋白质中半胱氨酸、酪氨酸、色氨酸和组氨酸等作用，使钨酸、钼酸两者同时失去 1 个、 2个或 3 个氧原子，还原成含有多种还原型的混合酸，并且有特殊的蓝色。

利用蓝色深浅与蛋白质浓度的关系，可制备标准曲线，测定样品中蛋白质含量。本法可测定的蛋白质含量为15-280g/ml。
试剂配制：
1）10g Na2CO3、2gNaOH和0.25g酒石酸钾钠溶于500ml蒸馏水。（2）0.5g CuSO4· 5H2O溶于100ml蒸馏水中。每次使用前将(1)：（2)=50:1之比例混合，即为试剂甲（有效期1天）。
1. 试剂甲
2.试剂乙以100g Na2WO4· 2H2O、25gNaMoO4· 2H2O、溶于700ml蒸馏
水中，并加入8.67mol/L H3PO4（85%）50ml、浓HCl 100ml，混合在1.5L 容积的磨口回流瓶中，接上回流冷凝管与小火回流10h。回流结束后，加入150g Li2SO4· H2O、50ml蒸馏水，并随之加入一定量的液体溴，开口继续沸腾，使溶液由绿色变黄色（与回流开始前溶液颜色相似）。过量的溴可煮沸去除。冷却后，稀释至1L，过滤，滤液置于棕色试剂瓶中保存。使用时用标准NaOH滴定，以酚肽为指示剂，然后适当稀释（约加水1倍）, 使最终的酸浓度为1mol/L。
Folin-酚试剂法标准曲线制作步骤
牛血清蛋白标准溶液/ml
管号 1 2 3
蒸馏水 /ml
0.4 0.3 0.2
各管加试剂甲2.5mL，混匀放置 10min后，加入试剂乙 0.25mL，立即混匀，放置10min
OD500
0.1 0.2 0.3
4 5 6
0.4 0.5 0

Folin-酚试剂法测定蛋白质含量

Folin-酚试剂法测定蛋白质含量一、目的掌握Folin-酚法测定蛋白质含量的原理和方法，熟悉分光光度计的操作。

二、原理Folin-酚试剂法包括两步反应：第一步是在碱性条件下，蛋白质与铜作用生成蛋白质-铜络合物；第二步是此络合物将磷钼酸-磷钨酸试剂（Folin 试剂）还原，产生深蓝色（磷钼蓝和磷钨蓝混合物），颜色深浅与蛋白质含量成正比。

此法操作简便，灵敏度比双缩脲法高100 倍，定量范围为5～100μg 蛋白质。

Folin 试剂显色反应由酪氨酸、色氨酸和半胱氨酸引起，因此样品中若含有酚类、柠檬酸和巯基化合物均有干扰作用。

此外，不同蛋白质因酪氨酸、色氨酸含量不同而使显色强度稍有不同。

三、实验材料、主要仪器和试剂1．实验材料绿豆芽下胚轴（也可用其它材料如面粉）2．仪器（1）722 型（或721 型）分光光度计（2）4 000r/min 的离心机（3）分析天平（4）容量瓶（50mL）（5）量筒（6）移液管（0.5mL、1mL、5mL）3．试剂（纯度均为分析纯）（1）0. 5mol/L NaOH(2) 试剂甲：（A）称取10g Na2CO3，2g NaOH 和0.25g 酒石酸钾钠，溶解后用蒸馏水定容至500 mL。

（B）称取0.5g CuSO4·5H2O，溶解后用蒸馏水定容至100mL。

每次使用前将（A）液50 份与（B）液1 份，即为试剂甲，其有效期为1d，过期失效。

（3）试剂乙：在1.5L 容积的磨口回流器中加入100g 钨酸钠（Na2WO4·2H2O）和700mL 蒸馏水，再加50mL 85 ％磷酸和100mL 浓盐酸充分混匀，接上回流冷凝管，以小火回流10h。

回流结束后，加入150g 硫酸锂和50mL 蒸馏水及数滴液体溴，开口继续沸腾15min，驱除过量的溴，冷却后溶液呈黄色（倘若仍呈绿色，再滴加数滴液体溴，继续沸腾15min）。

然后稀释至 1L，过滤，滤液置于棕色试剂瓶中保存，使用前大约加水1 倍，使最终浓度相当于1mol/L。

生化实验：Folin-酚试剂法(Lowry法)测定蛋白质浓度

试剂乙
深蓝色
(Folin试剂)
实验步骤
1．样品的稀释：准确取血清0.1ml (擦慢吹) ，置
于50ml容量瓶中，加生理盐水至刻度，倒置摇匀。 2．取玻璃试管7支，
表1 Folin-酚试剂法(Lowry法)测定血清蛋白质含量的测定步骤
3
实验结果
1 各管吸光值记录 2 制作标准曲线（坐标纸做，贴于实验报
Folin-酚试剂法（Lowry法）测定蛋白质浓度
1
实验目的
1. 掌握Folin-酚法测定蛋白质含量的原理及操作。 2. 掌握标准曲线的制作方法。
实验原理
碱性铜试剂试剂甲
蛋白质（肽键）
铜-蛋白质络合物（双缩脲反应）
-CO-NH-
紫红色
铜-蛋白质络合物（酪氨酸，色氨酸）
磷钼酸-磷钨酸
磷钼蓝 + 磷钨蓝
告）
标题，制作日期，时间，测定管数据标注于图中文字说明：利用标准曲线求得待测蛋白浓度值
3 利用公式法求出待测蛋白浓度
4
实验讨论与分析实验结论思考题：绘制标准曲线的意及制作注
意事项？
5

Folin酚比色法测定蛋白质含量

实验一 Folin-酚比色法测定蛋白质含量一. 目的学习Folin-酚法测定蛋白质含量的原理和方法二. 原理Folin-酚法，又名Lowry法，所用的试剂由两部分组成：试剂甲为碱性硫酸铜溶液，相当于双缩脲试剂，可与蛋白质中肽键起双缩脲反应，生成Cu2+-蛋白质络合物；试剂乙为磷钨酸-磷钼酸混合物，在碱性条件下极不稳定，易被上述络合物以及酪氨酸和色氨酸残基还原成钨蓝和钼蓝。

在一定蛋白质浓度范围内，钨蓝和钼蓝在500nm波长处的光吸收与蛋白质含量成正比，以此可测定蛋白质的含量。

该方法灵敏度高，测定范围为25μg～250μg，比双缩脲法灵敏100倍，用作一般浓度的测定较为适宜，且操作简便、快速，所以是一般实验室中经常使用的方法之一。

注意，酚类物质、柠檬酸、甘氨酸、EDTA、各种糖以及各种还原剂等对测定均有干扰作用。

三. 实验材料及设备1. 材料绿豆芽2. 仪器分光光度计电子天平3. 器材普通试管：20mL×8容量瓶：100mL×1移液管：1mL×4 5mL×1烧杯：250mL×1 50mL×1滤纸：φ11cm滴管： 2洗耳球： 2坐标纸研钵、漏斗、洗瓶、试管架、移液管架、玻棒：各1四. 试剂的配制1. 牛血清白蛋白标准液（250μg/mL）精确称取0.0250g牛血清白蛋白，用蒸馏水溶解后定容至100mL。

2. Folin-酚试剂甲●溶液A：Na2CO310gNaOH 2g 用蒸馏水溶解后定容至500mL；酒石酸钾钠0.25g●溶液B：CuSO4·5H2O 0.05g 用蒸馏水溶解后定容至10mL；●使用前，将溶液A和溶液B以50:1相混合。

该混合液只能保持一天。

3. Folin-酚试剂乙●在1500mL容积的磨口烧瓶中，加入100g钨酸钠(Na2WO4·2H2O)、25g钼酸钠(NaMoO4·2H2O)及700mL蒸馏水，再加入50mL 85%正磷酸和100mL浓盐酸，充分混合后，接上回流冷凝管，以小火回流10小时。

Folin酚法测定血清蛋白质含量

实验8 Folin—酚法测定血清蛋白质含量一、目的1、学习分光光度计的原理和使用方法。

2、学习Folin—酚法测定蛋白质含量的原理和方法。

3、进一步掌握比色法或分光光度法，准确测定未知样品。

二、原理蛋白质浓度从它们的物理化学性质，如折射率，比重，紫外吸收测定而得知，或用化学方法，如定氮，双缩脲反应，Folin—酚法是一般实验室中经常使用的方法。

Folin—酚法是双缩脲法的发展，反应的第一步涉及到在碱性溶液中铜一蛋白质复合物的形成，然后这个复合物去还磷钼酸—磷钨酸试剂（Folin氏剂），产生深蓝色（钼蓝和钨蓝混合物）。

Folin—酚法灵敏度高，较双缩脲法灵敏100倍。

所测蛋白质样品中若含酚类及柠檬酸均有干扰作用，浓度较低的尿素（约0.5%左右），胍（0.5%左右），硫酸钠（1%），硝酸钠（1%），三氯乙酸（0.5%），乙醇（5%）乙醚（5%），丙酮（0.5%）等溶液对显色反应影响，这些物质浓度高时必须做校正曲线。

含硫酸铵的溶液只须加浓碳酸钠—氢氧化钠溶液即可显色测定。

若样品酸度较高，显色后色浅。

则必须提高碳酸钠—氢氧化钠溶液的浓度1—2倍。

三、材料、试剂与器具（一）材料血清：使用前稀释100%（二）试剂1、标准酪蛋白溶液：称取125毫克酪蛋白粉末，用0.1N氢氧化钠溶液溶解，加蒸馏水到250 毫升，则配成500微克/毫升的标准酪蛋白溶液。

2、Folin—酚试剂甲：由下述四种溶液配制而成。

（1）4%碳酸钠溶液（2）0.2N氢氧化钠溶液（3）1%硫酸铜（CuSO4·5H2O）溶液（4）2%酒石酸钾钠溶液，在使用前，将（1）和（2）等体积混合成碳酸钠—氢氧化钠溶液。

将（3）与（4）等体积混合配成硫酸铜—酒石酸钾钠溶液。

然后将这两种溶液按50：1的比例混合，即为Folin—酚试剂甲。

该试剂只能用一天，过期失效。

3．Folin—酚试剂乙：在2升的磨口回流装置内加入钨酸钠（Na2WO4·2H2O）100克，钼酸钠（Na2MOO4·2H2O）25克，蒸馏水700毫升，85%磷酸50毫升和浓盐酸100毫升，充分沸合后以小火回流10小时，再加入硫酸锂（L i2SO4）150克，蒸馏水50毫升及数滴液体溴。