folin酚试剂法测定蛋白质含量

注意事项2
因Lowry反应的显色随时间不断加深，因此各项操 作必须精确控制时间。
– 即第1支试管加入2.0mL碱性硫酸铜试剂后，开始计时 ，1分钟后，第2支试管加入2.0mL碱性硫酸铜试剂，2 分钟后加第3支试管，以此类推。 – 全部试管加完碱性硫酸铜试剂后若已到10分钟，则第1 支试管可立即加入0.20mL Folin-酚试剂，1分钟后第2 支试管加入0.20mL Folin-酚试剂，2分钟后加第3支试 管，以此类推。
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选择测定方法时应考虑
实验对测定所要求的灵敏度和精确度； 蛋白质的性质；
溶液中存在的干扰物质；
测定所花费的时间等。
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本法概述
1921年，Folin 首创，利用蛋白质分子中酪氨酸 和色氨酸残基（酚基）与还原酚试剂（磷钨酸 -磷 钼酸）起蓝色反应。 1951年，Lowry对此法进行了改进，先于标本中加 碱性铜试剂，再与酚试剂反应，提高了灵敏度。
试剂
1.牛血清白蛋白标准液（200μg/ml）
2.碱性硫酸铜溶液（当日有效） 3.Folin-酚试剂
仪器与器材
1.V-1100分光光度计
2.恒温水浴箱 3.试管6支、试管架 4.加样枪、加样枪架
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操作步骤
取6支试管，做好标记，按下表顺序操作：
加入物（ml） 1 2 3 4 5 6
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V-1100分光光度计操作步骤
开机，预热30分钟 转动波长旋钮，调所需波长。按 将黑体放入光路中，合上盖，按
MODE 0%
键切换到T档 键校零
开盖，将参比液按空白液、标准液、待测液顺序放入比色杯架上，合上 盖，按 键切换到A档 MODE
拉动比色架拉杆，将空白液放入光路中，合上盖，按 键校零 读数后，将黑体推回光路中，开盖取出比色杯 将参比液倒回原试管中，清洗比色杯并晾干
100%
拉动拉杆，将标准、待测液依次放入光路中 ，即可读取其吸光度A
关机，盖上防尘盖，登记仪器使用登记本。
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复习思考题
1、试述Folin-酚试剂法的优点？ 2、应用本方法有哪些干扰作用？为什么？应如何 注意？
请将答案附在实验报告上！
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值日生工作
实验完毕，组长登记实验室使用记录。 关闭仪器电源。
清洁、归整实验台面，扫地、倒垃圾。
回收试剂：将血清、Folin-酚试剂、牛血清白蛋白标准液 试剂收回放至准备室冰箱。 碱性硫酸酮试剂（每天最后实验的专业负责倾倒并清洗干 净，将试剂瓶放至准备室）。
牛血清白蛋白标准液
样品液（300倍稀释） 蒸馏水
1.0
0.20
0.80
0.40
0.60
0.60
0.40
0.80
0.20
0.50 0.50
碱性硫酸铜溶液
各管蛋白浓度（ug/ml）
2.0
0
2.0
40
2.0
80
2.0
120
2.0
160
2.0
未知
各管混匀，室温放置10min。 向各管内加入Folin-酚试剂0.20ml, 2s内迅速混匀！ 40℃放置10min。 冷却至室温后，以500nm波长比色，用1号管作空白，读取各管吸光度。
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原理3
在一定浓度范围内，蓝色的深浅度与蛋白质 浓度呈线性关系，故与同样处理的蛋白质标准液 比色即可求出蛋白质的含量。 即根据预先绘制的标准曲线求出未知样品中 蛋白质的含量。
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实验材料
样品
健康人血清 （正常人血清蛋白质含量：60～80 g/L）
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结果计算
根据未知样品溶液的吸光度值，在绘制好的标准 曲线图中查出样品溶液中的蛋白质含量。
然后乘以稀释倍数（300），得出每毫升未稀释血 清含蛋白质的微克数，即每毫升血清中蛋白质的 微克数(μg/ml)。
血清蛋白浓度(μg/ml)=样品蛋白质浓度×2×300
最后浓度单位换算成 g/L
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本方法的特点：
优点：1.灵敏度高，比双缩脲法灵敏约100倍。 2.操作简单，不需特殊仪器设备。 缺点：1.费时间较长，要精确控制操作时间 2.标准曲线也不是严格的直线形式 3.专一性较差，干扰物质较多。
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原理2
第二步
Folin-酚显色反应
Folin-酚试剂在碱性条件下极不稳定，其磷钼酸 盐-磷钨酸盐易被酚类化合物还原而呈蓝色反应( 钼蓝和钨蓝的混合物)。由于蛋白质中含有带酚羟 基的酪氨酸( Tyr ) ，故有此显色反应。
即蛋白质- Cu2+复合物中所含的酪氨酸残基 还原酚试剂中的磷钼酸和磷钨酸，生成蓝色的化 合物。
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什么是双缩脲反应？
两分子尿素加热脱氨缩合成的双缩脲（H2N-OC-NH-CO-NH2） ，因分子内含有两个邻接的肽键，在碱性溶液中可与Cu2+发 生双缩脲反应 ，生成紫红色络合物。
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原理1
第一步：双缩脲反应
蛋白质分子含有大量彼此相连的肽键（-CO-NH-），同样能 在碱性条件下与Cu2+发生双缩脲反应，生成的紫红色络合物 （蛋白质- Cu2+复合物）。且在540nm处的吸光度与蛋白质的 含量在10～120g/L范围内有良好的线性关系。
– 水浴10min，冷却后，每一分钟测一管。
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实验数据记录表
各 测定次数 1 1 2 3 用各管平均A值绘制标准曲线图 2 3 4 5 6 管 A 值步骤
1、选择合适的坐标纸 2、画坐标轴 3、根据测得的数据描点 4、连线 5、求实验结果
Lowry’s法（Folin-酚试剂法） 测定蛋白质含量
Determination of protein content by Lowry’s method
南方医科大学 生物化学与分子生物学实验教学中心
实验目的
掌握Folin-酚试剂法测定蛋白质含量的原理及其 实验操作技术。
掌握制作标准曲线的要领和通过标准曲线求样品 溶液中待测定物质含量的方法 。
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注意事项1
Folin-酚试剂在酸性条件下较稳定，而碱性硫酸 铜试剂是在碱性条件下与蛋白质作用生成碱性的 铜-蛋白质溶液。 故当Folin-酚试剂加到碱性的铜-蛋白质溶 液中后，必须立即混匀（加一管混匀一管），使 还原反应发生在磷钼酸-磷钨酸试剂被破坏之前。
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绘制标准曲线-1
以A500值为纵坐标，牛血清白蛋白标准液浓度为横坐标， 用铅笔绘制标准曲线。
吸光度A
0.6 0.4 .
.
.
0.2 . 40 80 120 160 蛋白质浓度C（μg/ml）
（要写图题）
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绘制标准曲线-2
根据所描点的分布情况，作直线或光滑连续的曲 线，该线表示实验点的平均变动情况，因此该线 不需全部通过各点，但应尽量使未经过线上的实 验点均匀分布在曲线或直线两侧。