NGAL基因在原发性肝癌中的表达及其功能分析

第５１卷　第１期２０１２年２月复旦学报（自然科学版）Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｆｕｄａｎ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ（Ｎａｔｕｒａｌ　Ｓｃｉｅｎｃｅ）Ｖｏｌ．５１Ｎｏ．１Ｆｅｂ．２０１２ 文章编号：０４２７－７１０４（２０１２）０１－００９１－０８收稿日期：２０１１－０６－１９基金项目：国家重点基础研究发展计划（“９７３”计划）（２００４ＣＢ５１８６０５），国家高技术研究发展计划（“８６３”计划）（２００６ＡＡ０２０５０１），国家重大科技专项基金（２００８ＺＸ１０００２－０２０），上海市科学技术委员会基金（０３ｄｚ１４０８６），国家自然科学基金项目（３００２４００１，３０７７１１８８）资助项目作者简介：李林国（１９８２—），女，硕士研究生；侯永敏，男，博士，通讯联系人，Ｅ－ｍａｉｌ：ｙｏｎｇｍｈ１＠ｙａｈｏｏ．ｃｏｍ．ｃｎ．ＮＧＡＬ基因在原发性肝癌中的表达及其功能分析李林国，周　同，侯永敏（复旦大学遗传工程国家重点实验室，上海２００４３３）摘　要：ＮＧＡＬ基因是Ｌｉｐｏｃａｌｉｎ家族成员，与ＭＭＰ９的功能密切相关，在乳腺癌、食管癌等多种恶性肿瘤中异常表达，为了研究其在原发性肝癌中的表达及功能，通过荧光实时定量ＰＣＲ法检测了ＮＧＡＬ基因在２３对肝癌组织标本中的表达情况．结果显示：在１２例肝癌组织中ＮＧＡＬ显著上调表达，占总样本数的５２．１７％（Ｐ＜０．０５），提示了ＮＧＡＬ基因的表达水平可能与肝癌的发生发展过程有关．通过构建绿色荧光蛋白融合表达载体，用脂质体法转化肝癌细胞株ＳＭＭＣ－７７２１进行瞬时表达．细胞周期实验显示ＮＧＡＬ的表达可促使ＳＭＣＣ－７７２１细胞从Ｇ１期向Ｓ期转化，转化ＮＧＡＬ的细胞中Ｓ期细胞显著增多（Ｐ＜０．０５），提示其可能具有促进肝癌细胞生长的功能；细胞凋亡实验发现ＮＧＡＬ的表达可显著抑制低血清诱导下的细胞凋亡率（Ｐ＜０．０５），提示其可能参与抑制肝癌细胞的凋亡．关键词：原发性肝细胞癌；ＮＧＡＬ；荧光实时定量ＰＣＲ；细胞周期；细胞凋亡中图分类号：Ｑ　７５６ 文献标志码：Ａ中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白（ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌ　ｇｅｌａｔｉｎａｓｅ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ　ｌｉｐｏｃａｌｉｎ，ＮＧＡＬ），也称为Ｌｉｐｏｃａｌｉｎ－２（脂质运载蛋白－２），是１９９３年在研究人中性粒细胞中的ＭＭＰ９（ｍａｔｒｉｘ　ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅｓ　９，９２ｋｕ）时新发现的一种２５ｋｕ的新蛋白，同源分析发现，ＮＧＡＬ与小鼠癌基因产物２４ｐ３蛋白的同源性很高，是Ｌｉｐｏｃａｌｉｎ家族的新成员［１］．Ｌｉｐｏｃａｌｉｎ家族由一系列的细胞外小分子组成，它们具有结合疏水性小分子的功能，并将小分子运输到特定的细胞膜受体上，发挥其作为运载体的功能，参与细胞生理稳态的调节［２］．ＮＧＡＬ与ＭＭＰ９的功能密切相关，它能抑制ＭＭＰ９在体内的降解，从而起到促进肿瘤的浸润与转移功能．近年来人们在ＮＧＡＬ基因与人类肿瘤之间的相互关系方面的研究取得了一定的进展．ＮＧＡＬ基因定位于染色体９ｑ３４上，是单拷贝基因，全长５　８６９ｂｐ，其中包括１　６９５ｂｐ的５′端非转录区，１７８ｂｐ的３′端非转录区及由７个外显子和６个内含子构成的３　６９６ｂｐ的原初转录区（ｐｒｉｍａｒｙｔｒａｎｓｃｒｉｂｅｄ　ｒｅｇｉｏｎ）［３］．Ｂｕｎｄｇａａｒｄ等在１９９４年克隆了ＮＧＡＬ的ｃＤＮＡ全序列，它含有６３ｂｐ的５′端非翻译区和５９１ｂｐ的编码区，共编码１９７个氨基酸，其中包括１９个氨基酸的前导序列和１７８个氨基酸残基的成熟肽段［４］．ＮＧＡＬ基因与小鼠的２４ｐ３基因ｃＤＮＡ全序列具有７１．３％的一致性，且外显子以及内含子连接处的位点具有高度保守性．同源比对提示，ＮＧＡＬ和２４ｐ３可能具有相近的功能［５－６］．ＮＧＡＬ蛋白由一条肽链构成，具有典型的β２折叠桶状结构．肽链由Ｎ端的３１０螺旋，Ｃ端的α螺旋和中间的８段反平行式β折叠构成的β折叠桶组成．ＮＧＡＬ蛋白β折叠桶封闭端的有游离的巯基Ｃ８７，这使得ＮＧＡＬ可与一些蛋白质分子，如ＭＭＰ－９，形成分子间二硫键，并以此来调节这些蛋白的功能或活性．ＮＧＡＬ蛋白在多种肿瘤中都上调表达，不同个体及不同部位的肿瘤ＮＧＡＬ蛋白的表达并不完全相同．有研究发现ＮＧＡＬ蛋白在乳腺癌中可能通过保护ＭＭＰ－９不被降解从而保持其活性，促进血管新生及肿瘤生长作用［７］．研究也发现ＮＧＡＬ蛋白在食道上皮癌的恶性转化中起着重要作用，它可能是一个癌基因或者癌促基因［８］，Ｌｉ等研究发现ＮＧＡＬ可能通过调节ＭＭＰ－９和ＭＭＰ－２的活性在肿瘤细胞的浸润中发挥作用［９］．Ｋｕｂｂｅｎ等发现ＮＧＡＬ／ＭＭＰ－９复合物与胃癌的预后显著相关［１０］．研究同样发现ＮＧＡＬ在卵巢癌［１１］、食道鳞状细胞癌［１２］等癌组织中异常表达．大多数结肠腺癌ＮＧＡＬ强阳性，肿瘤周围的腺瘤样增生也呈阳性，与周围的正常黏膜明显不同，而用Ｎｏｒｔｈｅｒｎ　ｂｌｏｔ检查发现结肠癌和肝癌组织中ＮＧＡＬｍＲＮＡ的水平升高［１３］．Ｐａｔｉｌ等通过ＤＮＡ芯片的方法发现了ＮＧＡＬ、ＧＰＣ３和ＤＫＫ１等在肝癌中高表达［１４］．ＮＧＡＬ基因在乳腺癌、食管癌、肝癌等多种恶性肿瘤中异常表达，且与癌症的进展、转移、预后等密切相关，提示ＮＧＡＬ可能在恶性肿瘤的早期诊断、判断预后等方面存在潜在的应用价值．原发性肝癌（ｐｒｉｍａｒｙ　ｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒ　ｃａｒｃｉｎｏｍａ，ＨＣＣ）是最常见的恶性肿瘤之一，它发病隐匿，早诊困难，易转移，预后差，在我国其死亡率居第三位．因此，探索具有临床诊断应用价值的肝癌生物分子标记，研究肝癌的发生发展机制具有重要意义．然而人们对ＮＧＡＬ基因在肝癌中研究还很少，仅有Ｐａｔｉｌ等［１４］利用ＤＮＡ芯片技术检测肝癌中的基因表达情况时发现ＮＧＡＬ是其中一个高表达基因，且未对其进行深入研究．所以本论文欲采用荧光实时定量ＰＣＲ法检测ＮＧＡＬ基因在肝癌及癌旁组织中的表达情况，以探索其在肝癌的早期诊断、判断预后等方面存在潜在的应用价值．同时克隆ＮＧＡＬ基因的全长ｃＤＮＡ序列，构建一系列真核生物表达载体，通过体外细胞实验研究其对细胞周期、细胞凋亡等方面的影响，初步探索其在肝癌发生发展中的作用，为肝癌的早期诊断和早期治疗提供理论依据．１　材料和方法１．１　材料５３例原发性ＨＣＣ肝癌与癌旁肝脏组织样品来自复旦大学附属中山医院（所有诊断均经病理切片证实），每例样品由癌组织和癌旁组织配对组成．组织离体后３０ｍｉｎ内取材，在液氮中快速冷冻１ｍｉｎ，－７０℃保存备用．本研究采用人肝癌细胞株ＳＭＭＣ－７７２１（由本实验室保存）．采用ＤＭＥＭ（ＧＩＢＣＯ，ＵＳＡ）培养基（含１０％ＦＢＳ），于３７℃，５％ＣＯ２细胞培养箱中培养．大肠杆菌ＤＨ５α由本实验室保存；实验中所用到的质粒ｐＥＧＦＰ－Ｃ１为本实验室保存．１．２　方法１．２．１　实时荧光定量ＰＣＲ采用ＴＲＩｚｏｌ试剂（上海生工生物工程有限公司）提取肝癌及癌旁组织标本总ＲＮＡ，所提取的总ＲＮＡ取２μＬ进行电泳检测，同时用紫外分光光度计ＦＳ－３１２（上海复生公司）检测Ａ２６０／Ａ２８０比值和浓度．逆转录反应：在０．５ｍＬ离心管中加入总ＲＮＡ　２μｇ，随机引物（ｈｅｘａｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ　ｍｉｘｔｕｒｅ）０．０２μｇ，用ＲＮａｓｅ－ｆｒｅｅ水补至反应总体积为１０μＬ；７０℃温浴５ｍｉｎ，冰浴２ｍｉｎ．随后加入１０μＬ反应缓冲液（５×ＲＴ缓冲液４μＬ，１０ｍｍｏｌ／Ｌ　ｄＮＴＰ混合物１μＬ，２００ｕｎｉｔｓ　Ｍ－ＭｕＬＶ　ＲＴａｓｅ　１μＬ，ＲＮａｓｅ－ｆｒｅｅ水４μＬ），离心数秒混匀；４２℃温浴６０ｍｉｎ；７０℃处理１５ｍｉｎ终止反应，－２０℃储存备用．按照ＳＹＢＲ＠Ｇｒｅｅｎ　Ｒｅａｌｔｉｍｅ　ＰＣＲ　Ｍａｓｔｅｒ　Ｍｉｘ试剂盒（ＴｏＹｏＢｏ）的实验方法在Ｂｉｏ－Ｒａｄ荧光实时定量ＰＣＲ仪上进行反应．引物设计参照ＧｅｎＢａｎｋ中的基因序列，采用Ｐｒｉｍｅｒ　Ｐｒｅｍｉｅｒ　５．０软件设计，由生工生物工程（上海）有限公司合成，引物序列见表１．每个反应均设３个平行管，总反应体系为２０μＬ，包含２×ＳＹＢＲ　Ｇｒｅｅｎ　ＰＣＲ　Ｍａｓｔｅｒ　Ｍｉｘ　１０μＬ，上、下游引物（１０μｍｏｌ／Ｌ）各１μＬ，模板１μＬ．反应条件为：初始变性９４℃，２ｍｉｎ，然后９５℃，１５ｓ，５８℃，２０ｓ，７２℃，２０ｓ，循环４５次．表１　实验中所用引物列表Ｔａｂ．１　Ｔｈｅ　ｐｒｉｍｅｒｓ　ｕｓｅｄ　ｉｎ　ｔｈｉｓ　ｐａｐｅｒ基因引物类型引　物ＮＧＡＬ　Ｒｅａｌ－ＴｉｍｅＲＴ－ＰＣＲ基因引物ＮＧＡＬｒｔＦ：５′－ＡＡＴＧＴＣＡＣＣＴＣＣＧＴＣＣＴＧＴＴＴＡ－３′，ＮＧＡＬｒｔＲ：５′－ＡＧＣＴＣＣＴＴＧＧＴＴＣＴＣＣＣＧＴＡ－３′；２９复旦学报（自然科学版）　第５１卷（续表）基因引物类型引　物ＧＡＰＤＨ　Ｒｅａｌ－ＴｉｍｅＲＴ－ＰＣＲ内参引物ＧＡＰＤＨ－ＲＴ－Ｆ：５′－ＧＡＡＧＧＴＧＡＡＧＧＴＣＧＧＡＧＴＣ－３′，ＧＡＰＤＨ－ＲＴ－Ｒ：５′－ＧＡＡＧＡＴＧＧＴＧＡＴＧＧＧＡＴＴＴＣ－３′；ＮＧＡＬ基因克隆引物ｈＮＧＡＬｃｌｏｎｅＦ：５′－ＣＡＣＣＡＣＡＧＣＧＣＣＴＧＣＴＴＣＣＴＣ－３′，ｈＮＧＡＬｃｌｏｎｅＲ：５′－ＧＧＧＴＣＴＣＣＣＡＧＣＴＣＣＣＴＣＡＡＴＧ－３′；ＮＧＡＬ载体构建引物ＮＧＡＬＥｃｏＲＩＦ１：５′－ＣＣＧＧＡＡＴＴＣＴＡＴＧＣＣＣＣＴＡＧＧＴＣＴＣＣＴＧＴＧ－３′，（下划线为ＥｃｏＲ　Ｉ位点）ＮＧＡＬＫｐｎＩＲ２：５′－ＧＧＧＧＴＡＣＣＴＣＡＧＣＣＧＴＣＧＡＴＡＣＡＣＴＧＧＴＣＧ－３′；（下划线为ＫｐｎＩ位点）１．２．２　数据分析根据荧光实时定量ＰＣＲ中Ｃｔ值（每个反应管内的荧光信号到达设定的阈值时所经历的循环数）和样本起始拷贝数的对应关系，利用Ｃｔ值就可以计算ＮＧＡＬ基因和和内参基因ＧＡＰＤＨ的表达量的比值，具体方法采用Ｌｉｖａｋ和Ｓｃｈｍｉｔｔｇｅｎ根据数学推导得出的比较阈值法，ＮＧＡＬ基因肝癌和癌旁肝组织表达水平的差异倍数被定义为２－ΔΔＣｔ，其中ΔΔＣｔ＝［ＣｔＮＧＡＬ（肝癌组织）－ＣｔＧＡＰＤＨ（肝癌组织）］－［ＣｔＮＧＡＬ（癌旁组织）－ＣｔＧＡＰＤＨ（癌旁组织）］．采用配对“ｔ”检验方法检验各组间ＮＧＡＬ表达差异，Ｐ值小于０．０５被认为两者之间的相关性有意义，小于０．０１被认为两者的相关性有显著意义．数据的统计分析采用ＳＰＳＳ　１５．０ｆｏｒ　Ｗｉｎｄｏｗｓ软件包进行．１．２．３　转ＮＧＡＬ基因ＳＭＭＣ－７７２１细胞株的建立以人正常肝组织ｃＤＮＡ文库为模板，用引物ｈＮＧＡＬｃｌｏｎｅＦ和ｈＮＧＡＬｃｌｏｎｅＲ通过ＬＡ　Ｔａｑ酶，以６２℃的退火温度进行扩增，将得到的目标片段，连接入ｐＭＤ１８－Ｔ载体，命名为ｐＭＤ１８Ｔ－ＮＧＡＬ．以该载体为模板，用引物ＮＧＡＬＥｃｏＲＩＦ１和ＮＧＡＬＫｐｎＩＲ２通过ＬＡ　Ｔａｑ酶进行扩增以在基因两端添加酶切位点，回收大小为６１４ｂｐ的片段，用ＥｃｏＲⅠ和ＫｐｎⅠ进行双酶切，回收酶切后的片段，连接至用同样的酶酶切的ｐＥＧＦＰ－Ｃ１载体片段中，转化大肠杆菌ＤＨ５α，用含卡那霉素的ＬＢ平板进行筛选，测序正确的阳性克隆命名为ｐＥＧＦＰ－ＮＧＡＬ．采用脂质介导法将ｐＥＧＦＰ－ＮＧＡＬ载体转染肝癌细胞株ＳＭＭＣ－７７２１，通过ＲＴ－ＰＣＲ法验证ＮＧＡＬ基因在ＳＭＭＣ－７７２１细胞株内过量表达．１．２．４　细胞周期分析构建了ｐＥＧＦＰ－ＮＧＡＬ真核表达载体，并通过脂质体Ｌｉｐｔｏ　２０００将载体导入细胞株内，观察ＮＧＡＬ基因对肝癌细胞株的细胞周期的影响．我们将ｐＥＧＦＰ－ＮＧＡＬ载体和ｐＥＧＦＰ－Ｃ１空载体平行转染ＳＭＣＣ－７７２１细胞株（ｎ＝３），进行细胞周期实验．制备单细胞悬液，计数．接种６０ｍｍ培养皿，每皿２×１０５～３×１０５个细胞，分别转染质粒ｐＥＧＦＰ－ＮＧＡＬ和ｐＥＧＦＰ－Ｃ１空载体．质粒用量为每皿２．５μｇ．孵育４ｄ．再经胰酶消化、ＰＢＳ液洗涤，－２０℃预冷的７０％乙醇１ｍＬ固定２ｈ，ＰＢＳ洗涤后加入５０μｇ／ｍＬ的碘化丙啶液（ＰＩ）１ｍＬ染色１５ｍｉｎ．７４μｍ尼龙网筛过滤，流式细胞仪（ＢＤ　Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）计量分析样品，统计分析采用“ｔ”检验．１．２．５　细胞凋亡检测制备单细胞悬液，计数．接种６０ｍｍ培养皿，每皿２×１０５～３×１０５个细胞，分别转染质粒ｐＥＧＦＰ－ＮＧＡＬ和ｐＥＧＦＰ－Ｃ１空载体．质粒用量为每皿２．５μｇ．孵育１ｄ后．换液后加入１％ＦＢＳ的低血清ＤＭＥＭ培养基，继续培养２４～７２ｈ，再经胰酶消化、ＰＢＳ液洗涤，－２０℃预冷的７０％乙醇１ｍＬ固定２ｈ，ＰＢＳ洗涤后加入５０ｇ／ｍＬ的碘化丙啶液（ＰＩ）１ｍＬ染色１５ｍｉｎ．７４μｍ尼龙网筛过滤，流式细胞仪计量分析样品，统计分析采用“ｔ”检验．２　结果与分析２．１　ＮＧＡＬ在肝癌和癌旁肝组织中的表达情况我们通过荧光实时定量ＰＣＲ技术检测发现５３对肝癌样品中ＮＧＡＬ基因的表达情况，表２所列为ＮＧＡＬ基因在５３对肝癌样品中表达的ΔΔＣｔ值．根据上文中提到的数据分析方法，可知２－ΔΔＣｔ值就是各３９　第１期李林国等：ＮＧＡＬ基因在原发性肝癌中的表达及其功能分析个样本间基因表达量的倍数关系，以ΔΔＣｔ值＞１表示下调；－１≤ΔΔＣｔ值≤１表示表达无显著变化；ΔΔＣｔ值＜－１表示上调．因为整个样本的收集时间较长，考虑到某些样本可能已经发生降解，对实验结果可能造成一些影响．当使用发生降解的ＲＮＡ样本进行Ｒｅａｌｔｉｍｅ　ＲＴ－ＰＣＲ实验时，内参基因ＧＡＰＤＨ达到同样的检测丰度需要的循环反应数更多，表现为Ｃｔ值增大，所以在本文中我们以癌旁组织中内参基因ＧＡＰＤＨ的Ｃｔ值小于２０作为合格ＲＮＡ样本的筛选标准．故我们选取其中２３对肝癌样本进行分析，发现ＮＧＡＬ上调表达的为１２例，无显著变化的为８例，下调表达的为３例，因此ＮＧＡＬ在５２．１７％的肝癌组织中上调表达，且差异具有统计学意义（Ｐ＝０．０３５＜０．０５）．结果表明在原发性肝癌中ＮＧＡＬ较高的表达水平具有普遍性，提示了ＮＧＡＬ基因的表达水平可能与肝癌的发生发展过程有密切的相关性．表２　ＮＧＡＬ基因Ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ　ＲＴ－ＰＣＲ结果Ｔａｂ．２　Ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ　ＲＴ－ＰＣＲ　ｒｅｓｕｌｔｓ　ｏｆ　ＮＧＡＬ　ｇｅｎｅ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ 注：ΔΔＣｔ值＞１表示下调；－１≤ΔΔＣｔ值≤１表示表达无显著变化；ΔΔＣｔ值＜－１表示上调．２．２　ＮＧＡＬ基因的亚细胞定位研究用引物ｈＮＧＡＬｃｌｏｎｅＦ和ｈＮＧＡＬｃｌｏｎｅＲ克隆得到ＮＧＡＬ基因，并用ＮＧＡＬ基因构建载体ｐＥＧＦＰ－ＮＧＡＬ，并经测序验证其与预期序列完全一致．将构建好的重组子ｐＥＧＦＰ－ＮＧＡＬ转染ＳＭＣＣ－７７２１细胞．４８ｈ后Ｏｌｉｍｐｕｓ荧光显微镜下观察蛋白的亚细胞定位，分别使用４８８ｎｍ和４０５ｎｍ的激发光照射ＧＦＰ和ＤＡＰＩ染色的细胞核（图１）．显微镜下检测ＮＧＡＬ－ＧＦＰ在胞内的各部分也均有表达，且分布均匀，验证了ＮＧＡＬ是一种分泌蛋白，可存在于细胞内的各部分中．４９复旦学报（自然科学版）　第５１卷图１　ｐＥＧＦＰ－ＮＧＡＬ转染ＳＭＣＣ－７７２１细胞荧光显微镜观察结果（标尺＝５μｍ）Ｆｉｇ．１　Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ　ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ　ｏｂｓｅｒｖａｔｉｏｎ　ｒｅｓｕｌｔｓ　ｏｆ　ＳＭＣＣ－７７２１ｔｒａｎｓｆｅｒｒｅｄ（ｗｉｔｈ　ｐＥＧＦＰ－ＮＧＡＬ　Ｂａｒ＝５μｍ）Ａ．白光下细胞的形态；Ｂ．ＮＧＡＬ－ＧＦＰ在ＳＭＭＣ－７７２１细胞中的表达；Ｃ．细胞核ＤＡＰＩ染色；Ｄ．Ｂ、Ｃ的图像重叠２．３　ＮＧＡＬ基因过表达对肝癌细胞周期和细胞凋亡的影响以肝癌细胞株ＳＭＭＣ－７７２１为体外模型，研究过表达ＮＧＡＬ基因对ＳＭＭＣ－７７２１细胞周期和细胞凋亡的影响．按方法中所述，构建了ｐＥＧＦＰ－ＮＧＡＬ真核表达载体，并通过脂质体ｌｉｐｔｏ　２０００将载体导入细胞株内，为研究ＮＧＡＬ基因对肝癌细胞株的细胞周期的影响，我们将ｐＥＧＦＰ－ＮＧＡＬ载体和ｐＥＧＦＰ－Ｃ１空载体平行转染ＳＭＣＣ－７７２１细胞株（ｎ＝２），进行细胞周期实验．结果表明：转入ｐＥＧＦＰ－ＮＧＡＬ的细胞相比转入空载体的细胞进入Ｇ１，Ｓ，Ｇ２／Ｍ期的数量各不相同，且进入Ｓ期的细胞显著性增多（Ｐ＜０．０５）（图２）．为研究ＮＧＡＬ基因对肝癌细胞株的细胞凋亡的影响，我们将ｐＥＧＦＰ－ＮＧＡＬ载体和ｐＥＧＦＰ－Ｃ１空载体平行转染ＳＭＣＣ－７７２１细胞株（ｎ＝３），并用１％ＦＢＳ低血清诱导细胞凋亡，检测ｐＥＧＦＰ－ＮＧＡＬ对细胞凋亡的影响．结果表明：转染ｐＥＧＦＰ－ＮＧＡＬ载体能显著抑制低血清诱导的ＳＭＣＣ－７７２１肝癌细胞株的凋亡水平，Ｐ＝０．００３　３（图３）．３　讨　论ＮＧＡＬ蛋白在多种肿瘤组织中都上调表达，不同个体及不同部位的肿瘤ＮＧＡＬ蛋白的表达并不完全相同．研究表明ＮＧＡＬ蛋白分布于乳腺癌细胞系和乳腺癌组织中的胞浆内，呈颗粒状．肿瘤细胞周围的良性导管内也有弱阳性的分泌性ＮＧＡＬ蛋白存在．人乳腺癌组织中ＮＧＡＬ表达与乳腺癌的雌、孕激素受体水平和细胞增殖状态有关，ＮＧＡＬ蛋白阳性的肿瘤细胞其ｍＲＮＡ的表达水平是周围正常乳腺组织的２．８倍．在人的乳腺癌组织中用免疫组化法研究却未发现ＮＧＡＬ蛋白表达与ＨＥＲ－２／ｎｅｕ活化之间有关联，也未发现ＮＧＡＬ蛋白与乳腺癌的总体生存率相关［１５］．有研究发现ＮＧＡＬ蛋白在乳腺癌中可能通过保护ＭＭＰ－９不被降解从而增强其活性，促进血管新生及肿瘤生长来起作用［７］．研究发现在ＨＰＶ　Ｅ６Ｅ７癌基因转化基础上由ＴＰＡ促成的食管癌细胞系中，ＮＧＡＬ　ｍＲＮＡ的表达是明显升高的［１６］．同时ＮＧＡＬ蛋白在膀胱癌［１７］、肺癌、卵巢癌、前列腺癌等多种癌症中异常表达．目前对ＮＧＡＬ基因的功能研究还不充分，现在的研究显示ＮＧＡＬ蛋白与肿瘤的关系主要表现在以５９　第１期李林国等：ＮＧＡＬ基因在原发性肝癌中的表达及其功能分析下方面，ＮＧＡＬ蛋白可与ＭＭＰ９蛋白结合，形成ＭＭＰ９／ＮＧＡＬ复合物，并能保护ＭＭＰ９的不被降解，从而维持ＭＭＰ９的酶活性［１８］．ＮＧＡＬ蛋白能运载铁离子到细胞膜，从而激活或者抑制铁应答基因［１９］．体外实验证明ＮＧＡＬ蛋白通过增强细胞的铁吸收能力促进上皮细胞与间充质细胞之间的转化［２０］．ＮＧＡＬ蛋白可以通过自分泌的方式负调控红细胞的生成，过量的ＮＧＡＬ蛋白可以抑制红细胞前体细胞的分化及诱导其凋亡．ＮＧＡＬ蛋白通过二硫键与ＭＭＰ２９，即明胶酶Ｂ结合，调节ＭＭＰ２９的功能．ＭＭＰ２９一般以前酶的形式（Ｐｒｏ２ＭＭＰ２９）贮存于细胞内，当分泌到细胞外并切去Ｎ２端的一段序列后，才表现生物活性．ＮＧＡＬ蛋白可以结合ＭＭＰ的Ｎ２端胱氨酸开关，促进Ｐｒｏ２ＭＭＰ的活化．ＮＧＡＬ蛋白具有抵消金属基质蛋白酶２１的组织抑制剂（ｔｉｓｓｕｅ　ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ　ｏｆ　ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ２１，ＴＩＭＰ２１）对ＭＭＰ２９活性抑制的作用．因为ＭＭＰ２９在降解基底膜的Ⅳ型胶原和基质成分中起重要作用，因此推测ＮＧＡＬ可能在肿瘤的浸润和转移中发挥作用［１０］．ＮＧＡＬ蛋白能抑制Ｈ２Ｏ２导致的细胞凋亡，提示它可能具有缓解细胞在氧化应激条件下所受的损伤［２１］．ＮＧＡＬ在甲状腺癌细胞ＦＲＯ中高表达，消减表达ＮＧＡＬ的ＦＲＯ细胞在软琼脂上的生长能力及克隆形成率能力显著减弱，由此认为ＮＧＡＬ蛋白有助于甲状腺癌细胞的生存［２２］．对ＮＧＡＬ蛋白的功能研究提示其可能是一个癌基因或者促癌基因，在肿瘤的发生发展过程中发挥作用．本论文探索了ＮＧＡＬ在肝癌及其癌旁组织中的表达情况，发现ＮＧＡＬ基因在肝癌组织中高表达，由于样本量较少，未能统计分析其与肝癌的临床分期及预后等相关性．然而Ｓｕｎ等研究发现ＮＧＡＬ的在结直癌中的高表达并与肿瘤的分期及复发具有相关性，ＮＧＡＬ的表达水平可作为独立的预后因子判断结直肠癌的生存率［２３］．Ｋｉｍ等研究发现ＮＧＡＬ在肝癌组织中显著高表达，相对于癌旁组织，并且发现其通过阻隔ＪＮＫ和ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ信号传导通路抑制肝癌细胞的增殖和侵润，关于其机制的研究尚未完全清楚［２４］．Ｍａｒｔí等发现结肠癌肝转移术后患者中血清ＮＧＡＬ水平与临床预后及评分具有相关性，提示其可能作为结肠癌肝转移患者预后的潜在生物标记［２５］．Ｐａｔｉｌ等利用基因芯片的办法检测了７０３个基因，发现ＮＧＡＬ，ＧＰＣ３等分泌性蛋白的基因显著高表达，预示他们可能是具有前景的肝癌诊断标记［１４］．我们下一步实验将收集更多的临床肝癌样本及更详细的临床资料，进一步研究ＮＧＡＬ基因表达与肝癌临床分型分期及预后的相关性，探索其作为肝癌临床检测生物标记的可能性．本论文探索了ＮＧＡＬ基因转染肝癌细胞株ＳＭＣＣ－７７２１对其细胞周期及凋亡的影响，发现ＮＧＡＬ的表达可促使ＳＭＣＣ－７７２１细胞从Ｇ１期向Ｓ期转化，转化ＮＧＡＬ的细胞中Ｓ期细胞显著增多（Ｐ＜０．０５），提示其可能具有促进肝癌细胞生长的功能；细胞凋亡实验发现ＮＧＡＬ的表达可显著抑制低血清诱导下的细胞凋亡率（Ｐ＜０．０５），提示其可能参与抑制肝癌细胞的凋亡．Ｗｅｉｓｋｉｒｃｈｅｎ等研究发现ＮＧＡＬ的表达与肝脏的损伤具有相关性，并且导致炎症相关反应，白介素１β通过ＮＦ－κＢ活化可诱导ＮＧＡＬ在肝癌细胞株ＨｅｐＧ２中高表达［２６］．Ｒｏｕｄｋｅｎａｒ等发现当用Ｘ射线或者过氧化氢处理肝癌细胞株ＨｅｐＧ２时，ＮＧＡＬ可以被氧化应激诱导高显著高表达，当加入二甲亚砜或者半胱胺等抗氧化剂时，高表达的ＮＧＡＬ可以被抵消［２７］．研究表明ＮＧＡＬ基因的表达与肝脏的损伤及炎症反应相关，但是ＮＧＡＬ基因在肝癌中的作用机制还不明确．本论文探索了其对肝癌细胞株的细胞周期、细胞凋亡的影响，为进一步研究其机制打下了基础．本论文中细胞周期及凋亡试验中所使用的肝癌细胞株ＳＭＣＣ－７７２１，需研究细胞株本身ＮＧＡＬ的表达情况，对该细胞株的背景进行深入的了解．可对该细胞株进行ＮＧＡＬ基因的敲减实验，通过ＲＮＡｉ等方法抑制ＮＧＡＬ基因的表达，观察其对肝癌细胞株的细胞周期及细胞凋亡的影响．另外，还可以进一步研究ＮＧＡＬ基因起作用的细胞信号传导通路，进一步探索其在肝癌发生发展中的作用机制．ＮＧＡＬ基因在乳腺癌、食管癌、胰腺癌、结肠癌、肝癌等多种恶性肿瘤中异常表达，且与癌症的进展、转移、预后等密切相关．作为一种分泌蛋白，可能在恶性肿瘤的早期诊断、判断预后等方面存在潜在的应用价值，其在恶性肿瘤演进中的机制和意义还有待进一步深入研究．参考文献：［１］　Ｋｊｅｌｄｓｅｎ　Ｌ，Ｊｏｈｎｓｅｎ　Ａ　Ｈ，Ｓｅｎｇｅｌ　Ｈ，ｅｔ　ａｌ．Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｐｒｉｍａｒｙ　ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ　ｏｆ　ＮＧＡＬ，ａ　ｎｏｖｅｌ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ａｓｓｏｃｉａｔｅｄｗｉｔｈ　ｈｕｍａｎ　ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌ　ｇｅｌａｔｉｎａｓｅ［Ｊ］．Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９９３，２６８（１４）：１０４２５．［２］　Ｆｌｏｗｅｒ　Ｄ　Ｒ．Ｔｈｅ　ｌｉｐｏｃａｌｉｎ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｆａｍｉｌｙ：ａ　ｒｏｌｅ　ｉｎ　ｃｅｌｌ　ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ［Ｊ］．ＦＥＢＳ　ｌｅｔｔｅｒｓ，１９９４，３５４（１）：６９复旦学报（自然科学版）　第５１卷７－１１．［３］　Ｃｏｗｌａｎｄ　Ｊ　Ｂ，Ｂｏｒｒｅｇａａｒｄ　Ｎ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｐａｔｔｅｒｎ　ｏｆ　ｔｉｓｓｕｅ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｇｅｎｅ　ｆｏｒｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌ　ｇｅｌａｔｉｎａｓｅ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ　ｌｉｐｏｃａｌｉｎ　ｆｒｏｍ　ｈｕｍａｎｓ［Ｊ］．Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，１９９７，４５（１）：１７－２３．［４］　Ｂｕｎｄｇａａｒｄ　Ｊ　Ｒ，Ｓｅｎｇｅｌｏｖ　Ｈ，Ｂｏｒｒｅｇａａｒｄ　Ｎ，ｅｔ　ａｌ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ｃｌｏｎｉｎｇ　ａｎｄ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ　ａ　ｃＤＮＡ　ｅｎｃｏｄｉｎｇＮＧＡＬ：ａ　ｌｉｐｏｃａｌｉｎ　ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ　ｉｎ　ｈｕｍａｎ　ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌｓ［Ｊ］．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ　ａｎｄ　Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ　ＲｅｓｅａｒｃｈＣｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ，１９９４，２０２（３）：１４６８－１４７５．［５］　Ｋｊｅｌｄｓｅｎ　Ｌ，Ｃｏｗｌａｎｄ　Ｊ　Ｂ，Ｂｏｒｒｅｇａａｒｄ　Ｎ．Ｈｕｍａｎ　ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌ　ｇｅｌａｔｉｎａｓｅ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ　ｌｉｐｏｃａｌｉｎ　ａｎｄｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ　ｐｒｏｔｅｉｎｓ　ｉｎ　ｒａｔ　ａｎｄ　ｍｏｕｓｅ［Ｊ］．Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ　ｅｔ　Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ　Ａｃｔａ（ＢＢＡ）－Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ　ａｎｄＭｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，２０００，１４８２（１－２）：２７２－２８３．［６］　熊华淇，许丽艳．ＮＧＡＬ基因的功能及其在人正常和肿瘤组织中的表达［Ｊ］．国外医学：生理病理科学与临床分册，２００２，２２（００１）：１２－１４．［７］　Ｆｅｒｎáｎｄｅｚ　Ｃ　Ａ，Ｙａｎ　Ｌ，Ｌｏｕｉｓ　Ｇ，ｅｔ　ａｌ．Ｔｈｅ　ｍａｔｒｉｘ　ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ－９／ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌ　ｇｅｌａｔｉｎａｓｅ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄｌｉｐｏｃａｌｉｎ　ｃｏｍｐｌｅｘ　ｐｌａｙｓ　ａ　ｒｏｌｅ　ｉｎ　ｂｒｅａｓｔ　ｔｕｍｏｒ　ｇｒｏｗｔｈ　ａｎｄ　ｉｓ　ｐｒｅｓｅｎｔ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｕｒｉｎｅ　ｏｆ　ｂｒｅａｓｔ　ｃａｎｃｅｒ　ｐａｔｉｅｎｔｓ［Ｊ］．Ｃｌｉｎ　Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ，２００５，１１（１５）：５３９０．［８］　许丽艳，李恩民．ＮＧＡＬ基因在永生化食管上皮细胞恶性转化中过表达的研究［Ｊ］．生物化学与生物物理进展，２００１，２８（００６）：８３９－８４３．［９］　Ｌｉ　Ｅ　Ｍ，Ｘｕ　Ｌ　Ｙ，Ｃａｉ　Ｗ　Ｊ，ｅｔ　ａｌ．Ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ　ｏｆ　ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌ　ｇｅｌａｔｉｎａｓｅ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ　ｌｉｐｏｃａｌｉｎ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｅｓｏｐｈａｇｅａｌｃａｒｃｉｎｏｍａ　ｃｅｌｌ　ｌｉｎｅ　ＳＨＥＥＣ［Ｊ］．Ａｃｔａ　Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ　ｅｔ　Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ　Ｓｉｎｉｃａ，２００３，３５（３）：２４７．［１０］　Ｋｕｂｂｅｎ　Ｆ　Ｊ　Ｇ　Ｍ，Ｓｉｅｒ　Ｃ　Ｆ　Ｍ，Ｈａｗｉｎｋｅｌｓ　Ｌ　Ｊ　Ａ　Ｃ，ｅｔ　ａｌ．Ｃｌｉｎｉｃａｌ　ｅｖｉｄｅｎｃｅ　ｆｏｒ　ａ　ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ　ｒｏｌｅ　ｏｆｌｉｐｏｃａｌｉｎ－２ａｇａｉｎｓｔ　ＭＭＰ－９ａｕｔｏｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｔｈｅ　ｉｍｐａｃｔ　ｆｏｒ　ｇａｓｔｒｉｃ　ｃａｎｃｅｒ［Ｊ］．Ｅｕｒ　Ｊ　Ｃａｎｃｅｒ，２００７，４３（１２）：１８６９－１８７６．［１１］　Ｌｉｍ　Ｒ，Ａｈｍｅｄ　Ｎ，Ｂｏｒｒｅｇａａｒｄ　Ｎ，ｅｔ　ａｌ．Ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌ　ｇｅｌａｔｉｎａｓｅ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ　ｌｉｐｏｃａｌｉｎ（ＮＧＡＬ）ａｎ　ｅａｒｌｙ－ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ　ｂｉｏｍａｒｋｅｒ　ｆｏｒ　ｏｖａｒｉａｎ　ｃａｎｃｅｒ：ＮＧＡＬ　ｉｓ　ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ　ｗｉｔｈ　ｅｐｉｄｅｒｍａｌ　ｇｒｏｗｔｈ　ｆａｃｔｏｒ－ｉｎｄｕｃｅｄｅｐｉｔｈｅｌｉｏ－ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ　ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ［Ｊ］．Ｉｎｔ　Ｊ　Ｃａｎｃｅｒ，２００７，１２０（１１）：２４２６－２４３４．［１２］　Ｚｈａｎｇ　Ｈ，Ｘｕ　Ｌ，Ｘｉａｏ　Ｄ，ｅｔ　ａｌ．Ｕｐｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌ　ｇｅｌａｔｉｎａｓｅ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ　ｌｉｐｏｃａｌｉｎ　ｉｎ　ｏｅｓｏｐｈａｇｅａｌｓｑｕａｍｏｕｓ　ｃｅｌｌ　ｃａｒｃｉｎｏｍａ：ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ　ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ　ｗｉｔｈ　ｃｅｌｌ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｔｕｍｏｕｒ　ｉｎｖａｓｉｏｎ［Ｊ］．Ｊｏｕｒｎａｌｏｆ　Ｃｌｉｎｉｃａｌ　Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ，２００７，６０（５）：５５５．［１３］　Ｃｈａｋｒａｂｏｒｔｙ　Ｓ．Ｎｇａｌ／Ｌｉｐｏｃａｌｉｎ－２ｉｓ　ａ　ｍａｒｋｅｒ　ｏｆ　ｅａｒｌｙ　ｄｙｓｐｌａｓｔｉｃ　ｃｈａｎｇｅｓ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｐａｎｃｒｅａｓ　ａｎｄ　ａ　ｐｏｓｓｉｂｌｅｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ　ｍａｒｋｅｒ　ｉｎ　ｐａｎｃｒｅａｔｉｔｉｓ　ａｎｄ／ｏｒ　ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ　ａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａ［Ｊ］．Ｃａｎｃｅｒ　Ｂｉｏｍａｒｋｅｒｓ，２００８，４（３）：１３２－１３２．［１４］　Ｐａｔｉｌ　Ｍ　Ａ，Ｃｈｕａ　Ｍ　Ｓ，Ｐａｎ　Ｋ　Ｈ，ｅｔ　ａｌ．Ａｎ　ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ　ｄａｔａ　ａｎａｌｙｓｉｓ　ａｐｐｒｏａｃｈ　ｔｏ　ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚｅ　ｇｅｎｅｓ　ｈｉｇｈｌｙｅｘｐｒｅｓｓｅｄ　ｉｎ　ｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒ　ｃａｒｃｉｎｏｍａ［Ｊ］．Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，２００５，２４（２３）：３７３７－３７４７．［１５］　Ｓｔｏｅｓｚ　Ｓ　Ｐ，Ｆｒｉｅｄｌ　Ａ，Ｈａａｇ　Ｊ　Ｄ，ｅｔ　ａｌ．Ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｏｕｓ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｌｉｐｏｃａｌｉｎ　ＮＧＡＬ　ｉｎ　ｐｒｉｍａｒｙ　ｂｒｅａｓｔｃａｎｃｅｒｓ［Ｊ］．Ｉｎｔ　Ｊ　Ｃａｎｃｅｒ，１９９８，７９（６）：５６５－５７２．［１６］　Ｍａｒｕ　Ｄ　Ｍ．Ｌｏｓｓ　ｏｆ　ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌ　ｇｅｌａｔｉｎａｓｅ　ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ　ｌｉｐｏｃａｌｉｎ（ＮＧＡＬ）ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｉｎ　ｅｓｏｐｈａｇｅａｌａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａ（ＥＡＣ）ｉｓ　ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ　ｗｉｔｈ　ｈｉｇｈｅｒ　ｐａｔｈｏｌｏｇｉｃ　ｓｔａｇｅ　ａｎｄ　ｐｏｏｒ　ｓｕｒｖｉｖａｌ［Ｃ］∥９８ｔｈ　ＡｎｎｕａｌＭｅｅｔｉｎｇ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｕｎｉｔｅｄ－Ｓｔａｔｅｓ－ａｎｄ－Ｃａｎａｄｉａｎ－Ａｃａｄｅｍｙ－ｏｆ－Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ，Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ：２００９．［１７］　Ｄｏｋｕｎ　Ｏ　Ｙ，Ｆｌｏｒｌ　Ａ　Ｒ，Ｓｅｉｆｅｒｔ　Ｈ－Ｈ，ｅｔ　ａｌ．Ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ　ｏｆ　ＳＮＣＧ，Ｓ１００Ａ４，Ｓ１００Ａ９ａｎｄ　ＬＣＮ２ｇｅｎｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ａｎｄ　ＤＮＡ　ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ　ｉｎ　ｂｌａｄｄｅｒ　ｃａｎｃｅｒ［Ｊ］．Ｉｎｔ　Ｊ　Ｃａｎｃｅｒ，２００８，１２３（１２）：２７９８－２８０７．［１８］　Ｙａｎ　Ｌ，Ｂｏｒｒｅｇａａｒｄ　Ｎ，Ｋｊｅｌｄｓｅｎ　Ｌ，ｅｔ　ａｌ．Ｔｈｅ　ｈｉｇｈ　ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ｗｅｉｇｈｔ　ｕｒｉｎａｒｙ　ｍａｔｒｉｘ　ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ（ＭＭＰ）ａｃｔｉｖｉｔｙ　ｉｓ　ａ　ｃｏｍｐｌｅｘ　ｏｆ　ｇｅｌａｔｉｎａｓｅ　Ｂ／ＭＭＰ－９ａｎｄ　ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌ　ｇｅｌａｔｉｎａｓｅ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ　ｌｉｐｏｃａｌｉｎ（ＮＧＡＬ）．Ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ　ｏｆ　ＭＭＰ－９ａｃｔｉｖｉｔｙ　ｂｙ　ＮＧＡＬ［Ｊ］．Ｊ　Ｂｉｏｌ　Ｃｈｅｍ，２００１，２７６（４０）：３７２５８－３７２６５．［１９］　Ｙａｎｇ　Ｊ，Ｇｏｅｔｚ　Ｄ，Ｌｉ　ＪＹ，ｅｔ　ａｌ．Ａｎ　ｉｒｏｎ　ｄｅｌｉｖｅｒｙ　ｐａｔｈｗａｙ　ｍｅｄｉａｔｅｄ　ｂｙ　ａ　ｌｉｐｏｃａｌｉｎ［Ｊ］．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ｃｅｌｌ，２００２，１０（５）：１０４５－１０５６．［２０］　Ｇｗｉｒａ　Ｊ　Ａ，Ｗｅｉ　Ｆ，Ｉｓｈｉｂｅ　Ｓ，ｅｔ　ａｌ．Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ　ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌ　ｇｅｌａｔｉｎａｓｅ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ　ｌｉｐｏｃａｌｉｎ　ｒｅｇｕｌａｔｅｓｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ　ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｓｉｓ　ｉｎ　ｖｉｔｒｏ［Ｊ］．Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２００５，２８０（９）：７８７５．［２１］　Ｒｏｕｄｋｅｎａｒ　Ｍ　Ｈ，Ｈａｌａｂｉａｎ　Ｒ，Ｇｈａｓｅｍｉｐｏｕｒ　Ｚ，ｅｔ　ａｌ．Ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌ　ｇｅｌａｔｉｎａｓｅ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ　ｌｉｐｏｃａｌｉｎ　ａｃｔｓ　ａｓ　ａｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ　ｆａｃｔｏｒ　ａｇａｉｎｓｔ　Ｈ２Ｏ２ｔｏｘｉｃｉｔｙ［Ｊ］．Ａｒｃｈｉｖｅｓ　ｏｆ　Ｍｅｄｉｃａｌ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２００８，３９（６）：５６０－５６６．７９　第１期李林国等：ＮＧＡＬ基因在原发性肝癌中的表达及其功能分析［２２］　Ｉａｎｎｅｔｔｉ　Ａ，Ｐａｃｉｆｉｃｏ　Ｆ，Ａｃｑｕａｖｉｖａ　Ｒ，ｅｔ　ａｌ．Ｔｈｅ　ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌ　ｇｅｌａｔｉｎａｓｅ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ　ｌｉｐｏｃａｌｉｎ（ＮＧＡＬ），ａ　ＮＦ－ｋａｐｐａＢ－ｒｅｇｕｌａｔｅｄ　ｇｅｎｅ，ｉｓ　ａ　ｓｕｒｖｉｖａｌ　ｆａｃｔｏｒ　ｆｏｒ　ｔｈｙｒｏｉｄ　ｎｅｏｐｌａｓｔｉｃ　ｃｅｌｌｓ［Ｊ］．Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ　Ｓｃｉ　ＵＳＡ，２００８，１０５（３７）：１４０５８－１４０６３．［２３］　Ｓｕｎ　Ｙ，Ｙｏｋｏｉ　Ｋ，Ｌｉ　Ｈ，ｅｔ　ａｌ．ＮＧＡＬ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｉｓ　ｅｌｅｖａｔｅｄ　ｉｎ　ｂｏｔｈ　ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ　ａｄｅｎｏｍａ－ｃａｒｃｉｎｏｍａ　ｓｅｑｕｅｎｃｅａｎｄ　ｃａｎｃｅｒ　ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ　ａｎｄ　ｅｎｈａｎｃｅｓ　ｔｕｍｏｒｉｇｅｎｅｓｉｓ　ｉｎ　ｘｅｎｏｇｒａｆｔ　ｍｏｕｓｅ　ｍｏｄｅｌｓ［Ｊ］．Ｃｌｉｎ　Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ，２０１１，１７（１３）：４３３１－４３４０．［２４］　Ｌｅｅ　ＥＫ，Ｋｉｍ　Ｈ　Ｊ，Ｌｅｅ　Ｋ　Ｊ，ｅｔ　ａｌ．Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｉｎｖａｓｉｏｎ　ｏｆ　ｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒ　ｃａｒｃｉｎｏｍａｃｅｌｌｓ　ｂｙ　ｌｉｐｏｃａｌｉｎ　２ｔｈｒｏｕｇｈ　ｂｌｏｃｋａｄｅ　ｏｆ　ＪＮＫ　ａｎｄ　ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ　ｓｉｇｎａｌｉｎｇ［Ｊ］．Ｉｎｔ　Ｊ　Ｏｎｃｏｌ，２０１１，３８（２）：３２５－３３０．［２５］　ＭａｒｔíＪ，Ｆｕｓｔｅｒ　Ｊ，Ｈｏｔｔｅｒ　Ｇ，ｅｔ　ａｌ．Ｓｅｒｕｍ　ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌ　ｇｅｌａｔｉｎａｓｅ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ　ｌｉｐｏｃａｌｉｎ　ｉｎ　ｐａｔｉｅｎｔｓ　ｗｉｔｈｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ　ｌｉｖｅｒ　ｍｅｔａｓｔａｓｅｓ：ｐｒｅｌｉｍｉｎａｒｙ　ｒｅｓｕｌｔｓ　ｏｆ　ａｎ　ｅｘｐｌｏｒａｔｏｒｙ　ｐｒｏｓｐｅｃｔｉｖｅ　ｓｔｕｄｙ［Ｊ］．Ｉｎｔ　Ｊ　ＢｉｏｌＭａｒｋｅｒｓ，２０１０，２５（１）：２１－２６．［２６］　Ｂｏｒｋｈａｍ－Ｋａｍｐｈｏｒｓｔ　Ｅ，Ｄｒｅｗｓ　Ｆ，Ｗｅｉｓｋｉｒｃｈｅｎ　Ｒ，ｅｔ　ａｌ．Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ｌｉｐｏｃａｌｉｎ－２ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｉｎ　ａｃｕｔｅ　ａｎｄｃｈｒｏｎｉｃ　ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ　ｌｉｖｅｒ　ｉｎｊｕｒｙ　ｍｏｄｅｒａｔｅｄ　ｂｙ　ｐｒｏ－ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ　ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ　ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ－１βｔｈｒｏｕｇｈ　ｎｕｃｌｅａｒｆａｃｔｏｒ－κＢ　ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ［Ｊ］．Ｌｉｖｅｒ　Ｉｎｔ，２０１１，３１（５）：６５６－６６５．［２７］　Ｒｏｕｄｋｅｎａｒ　Ｍ　Ｈ，Ｋｕｗａｈａｒａ　Ｙ，Ｂａｂａ　Ｔ，ｅｔ　ａｌ．Ｏｘｉｄａｔｉｖｅ　ｓｔｒｅｓｓ　ｉｎｄｕｃｅｄ　ｌｉｐｏｃａｌｉｎ　２ｇｅｎｅ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ：ａｄｄｒｅｓｓｉｎｇ　ｉｔｓ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｕｎｄｅｒ　ｔｈｅ　ｈａｒｍｆｕｌ　ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ［Ｊ］．Ｊ　Ｒａｄｉａｔ　Ｒｅｓ（Ｔｏｋｙｏ），２００７，４８（１）：３９－４４．Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ａｎｄ　Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ　Ａｎａｌｙｓｉｓ　ｏｆ　ＮＧＡＬ　Ｇｅｎｅ　ｉｎＨｕｍａｎ　Ｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒ　ＣａｒｃｉｎｏｍａＬＩ　Ｌｉｎ－ｇｕｏ，ＺＨＯＵ　Ｔｏｎｇ，ＨＯＵ　Ｙｏｎｇ－ｍｉｎ（Ｓｔａｔｅ　Ｋｅｙ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　ｏｆ　Ｇｅｎｅｔｉｃ　Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｆｕｄａｎ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｓｈａｎｇｈａｉ　２００４３３，Ｃｈｉｎａ）Ａｂｓｔｒａｃｔ：ＮＧＡＬ（ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌ　ｇｅｌａｔｉｎａｓｅ　ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ　ｌｉｐｏｃａｌｉｎ）ｇｅｎｅ　ｉｓ　ａ　ｎｅｗ　ｍｅｍｂｅｒ　ｏｆ　Ｌｉｐｏｃａｌｉｎ　ｆａｍｉｌｙ，ａｎｄ　ｉｓｃｌｏｓｅｌｙ　ｒｅｌａｔｅｄ　ｔｏ　ｔｈｅ　ｆｕｎｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ＭＭＰ－９．ＮＧＡＬ　ｉｓ　ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ　ａｂｎｏｒｍａｌｌｙ　ｉｎ　ｓｅｖｅｒａｌ　ｃａｒｃｉｎｏｍａｓ，ｓｕｃｈ　ａｓ　ｂｒｅａｓｔｃａｎｃｅｒ　ａｎｄ　ｅｓｏｐｈａｇｅａｌ　ｃａｒｉｎｏｍａｓ．Ｔｏ　ｕｎｄｅｒｓｔａｎｄ　ｔｈｅ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ａｎｄ　ｆｕｎｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ＮＧＡＬ　ｇｅｎｅ　ｉｎ　Ｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒｃａｒｃｉｎｏｍａｓ（ＨＣＣ），ｔｈｅ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｌｅｖｅｌ　ｏｆ　ＮＧＡＬ　ｉｎ　２３ｐａｉｒｓ　ｏｆ　ＨＣＣ　ｔｉｓｓｕｅｓ　ｗａｓ　ｍｅａｓｕｒｅｄ　ｖｉａ　Ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ　ＲＴ－ＰＣＲｍｅｔｈｏｄ．Ｔｈｅ　ｒｅｓｕｌｔｓ　ｉｎｄｉｃａｔｅｄ　ｔｈａｔ　ＮＧＡＬ　ｗａｓ　ｈｉｇｈｌｙ　ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ　ｉｎ　１２ＨＣＣ　ｔｉｓｓｕｅｓ，ａｃｃｏｕｎｔｉｎｇ　ｆｏｒ　５２．１７％ｏｆ　ｔｈｅｔｏｔａｌ　ｓａｍｐｌｅｓ．Ｃｅｌｌ　ｃｙｃｌｅ　ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ　ｓｈｏｗｅｄ　ｔｈａｔ　ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ　ＮＧＡＬ　ｉｎ　ＳＭＣＣ－７７２１ｉｓ　ａｂｌｅ　ｔｏ　ｐｒｏｍｏｔｅ　ｔｈｅｃｅｌｌ　ｆｒｏｍ　Ｇ１ｔｏ　Ｓ　ｐｈａｓｅ，ａｎｄ　ｔｈｅ　Ｓ　ｐｈａｓｅ　ｉｓ　ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ　ｉｎｃｒｅａｓｅｄ（Ｐ＜０．０５），ｗｈｉｃｈ　ｓｕｇｇｅｓｔｅｄ　ｔｈａｔ　ＮＧＡＬ　ｍａｙ　ｐｌａｙａ　ｒｏｌｅ　ｉｎ　ｈｅｐａｔｏｍａ　ｃａｒｃｉｎｏｍａ　ｃｅｌｌ　ｇｒｏｗｔｈ．Ａｌｓｏ，Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ　ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ　ｓｈｏｗｅｄ　ｔｈａｔ　ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ　ＮＧＡＬ　ｈａｄｔｈｅ　ａｎｔｉ－ａｐｏｐｔｏｓｉｓ　ｅｆｆｅｃｔ　ｉｎ　ＳＭＣＣ－７７２１ｕｎｄｅｒ　ｓｅｒｕｍ　ｓｔａｒｖａｔｉｏｎ（Ｐ＜０．０５）．Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：ＨＣＣ；ＮＧＡＬ；ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ　Ｒｅａｌ－Ｔｉｍｅ　ＲＴ－ＰＣＲ；ｃｅｌｌ　ｃｙｃｌｅ；ａｐｏｐｔｏｓｉｓ８９复旦学报（自然科学版）　第５１卷。