生物安全管理体系文件

实验室生物安全管理制度目的：确保实验人员生物安全，环境不受污染，样品质量不受影响特制定该管理制度。

一、人员准入条件1、实验室人员、辅助人员和外来人员必须具备相应的专业技能、受过相关的实验室生物安全培训、了解实验室潜在的生物危害和特殊要求，经负责人审批后方可进入相应的实验室工作。

2、未成年人、孕妇和有免疫缺陷的人员不得进入实验室，处于易受感染状态或感染后果严重的额人员也不得进入实验室。

3、实验室人员必须在身体状况良好、穿戴好防护服（白大衣）的情况下，方能进入实验室的污染区域工作。

但当身体出现较大的开放性损伤、处于较重的疾病感染状态或呈重度疲劳状态时不得进入。

4、外来参观人员需经科室负责人同意并在相关人员陪同下方可进入实验室。

二、生物安全日常管理：(一)生物安全行为规范1．进入实验室前要摘除首饰，修剪指甲，以免刺破手套。

长发应束在脑后，禁止在实验室内穿露脚趾的鞋。

不得佩戴有可能被卷入机器或可随人传染性物质的饰物。

2．在实验室里工作时，要始终穿着实验服，实验室外禁止穿防护服（白大衣）。

大白衣应定期清洗、更换，清洗时应使用具有杀菌消毒的洗液或其他相应方法。

3、操作感染性物质、腐蚀性或毒性物质时须在通风橱中进行，并佩戴相关的安全防护用品，如安全镜、面罩或护目镜。

皮肤受损时应以防水敷料覆盖。

4、当有必要保护眼睛和面部以防实验对象喷溅、或紫外线辐射时，必须要配戴护目镜，面罩（带护目镜的面罩）或其它防护用品。

5、实验室工作区不允许吃、喝、化妆和操作隐形眼镜，禁止在实验室工作区内的任何地方贮存人用食品及饮料。

6、实验室防护服不应和日常服饰放在同一柜子。

个人物品、服装和化妆品不应放在有规定禁放的和可能发生污染的区域。

7、不得涉及呼吸道传播疾病样品室，要佩戴符合要求的防护口罩。

(二)操作准则1、所有样本、培养物均可能有传染性，操作时均应带手套。

在认为手套已被污染时应脱掉手套，马上洗净双手，再换一双新手套。

2、当实验过程可能涉及到直接或意外接触到血液、有传染性的材料或被感染的动物时，必须要戴上合适的手套，脱手套后必须洗手。

在实际或可能接触了血液、体液或其他污染材料后，即使戴有手套也应立即洗手。

3、不得用戴手套的手触摸自己的眼、鼻子或其他暴露的黏膜或皮肤。

不得带手套离开实验室或在实验室来回走动。

4、严格禁止用嘴操作实验器材，包括吸液、吹酒精灯等。

实验材料禁止放入嘴里。

禁止舔标签。

5、尽量用塑料制品代替玻璃制品，不使用破裂或有缺口的玻璃器具。

破损的玻璃不能直接用手直接操作，必须用机械方法清除，如刷子、夹子、镊子等。

破裂的玻璃器具和比例碎片应丢弃在有专门标记的、单独的，不易刺破的容器里。

6、所有的实验步骤都应尽可能使气溶胶或气雾的形成控制在最小程度。

任何使形成气溶胶的危险性上升的操作都必须在生物安全柜里进行。

有害气溶胶不得直接排放。

7、应尽可能减少使用利器和尽量使用替代品。

包括针头、玻璃、一次性手术刀在内的利器，应在使用后立即放在耐扎容器中。

尖利物容器应在内容物达到三分之二前置换。

8、所有溅出事件、意外事故和明显或潜在的暴露于感染性材料，都必须向实验室负责人报告。

此类事故的书面材料应存档。

9、所有弃置的实验室生物样本、培养物和被污染的废弃物应被假定有传染性，在从实验室中取走之前，应以安全方式处理和处置，使其达到生物学安全。

10、实验室应保持整洁、干净，当潜在的危险物溅出或一天的工作结束后，所有操作台面、离心机、加样枪、试管架必须擦拭、消毒。

11、每日工作完毕，最后一个离开实验室的人员需关好水、电、门、窗。

(三)监督与检查1、涉及病原体的科室负责人要经常对各项实验的生物安全性进行检查和监督。

2、各实验项目主管人员要定期对所开展的实验工作进行监督与检查，及时发现并报告安全隐患事件。

三、常见实验室废弃品处理实验室废弃品按物理类型而言可分为固体废弃品、液体废弃品及气体废弃品，就危害类型而验分为化学毒性废品和病原性废品，由于废弃物品具有潜在的致病性、伤害性，如不妥善处理会造成很大的人身危害、环境污染和社会危害。

根据《国家危险废物品名录》、《医疗废物管理条例》、卫生部和国家环境保护总局制定的《医疗废物分类目录》有关规定的要求，对实验室废弃物进行分类，主要包括感染性废弃物、病理性废弃物、损伤性废弃物、化学性和放射性废弃物等。

四、支持文件1.《中华人民共和国传染病防治法》2.《病原微生物实验室生物安全管理条例》3.《实验室生物安全通用要求》(改变9489-2004)4.《微生物和生物医学实验室生物安全通用准则》（WS233-2003）5.《实验室生物安全守则》（WHO,第三版，2004年）6.《病原微生物实验室生物安全》（生物安全培训卫生部规划教材，第2版）7.《医疗废弃物管理条例》8.《实验室生物安全》病毒制备质量管理体系目录原始病毒的扩增大量病毒制备的灭菌操作病毒制备程序痘苗病毒的收获和纯化腺病毒的收获和纯化病毒滴度测定病毒质控细菌污染及检测支原体污染及检测基因检测病毒活性检测体外细胞杀伤复制能力检测原始病毒的扩增---病毒种子制备一般原始病毒的扩增用优质（无污染-须通过细菌和支原体检测）CV1 / JH293细胞，每种原始病毒的扩增需要在一个细胞融合度≧80%（细胞处于对数生长期，活性好，感染效率高）的T175培养瓶中进行：1.细胞计数：①培养箱中取出细胞，镜下观察，将状态良好，融合度≧80%的细胞移至超净工作台。

②去除细胞培养瓶中的旧培养基。

③PBS冲洗：从无细胞一侧加入适量（约10ml）PBS冲洗细胞后弃上清，酌情反复1~2次，以达到彻底洗掉培养基中的血清成份。

④消化细胞：加入1ml 0.25%胰酶消化液，使之铺满细胞表面，放入培养箱（37℃）作用数分钟后，把培养瓶放置显微镜下观察，发现细胞回缩变圆，细胞间隙增大；或肉眼观察，见到瓶底出现细针孔间隙倾斜瓶子出现流沙样现象即可终止消化。

⑤终止消化：轻拍培养瓶使细胞自瓶壁脱落，从无细胞面侧加入适量完全培养基（含血清的DMEM）终止消化，并用移液管吸吹数次以打散细胞团块，混合均匀，使之成为单细胞混合液。

⑥计数板准备：用酒精清洁计数板及专用盖玻片，然后用绸布轻轻拭干。

⑦加样：用移液管轻轻吹打细胞悬液，取少许细胞悬液（可酌情稀释），在计数板上盖玻片一侧靠虹吸现象加入微量（约10ul）细胞悬液，使之充满玻璃槽，不可产生气泡，不可溢出外侧亦不可溢入对侧玻璃槽。

如产生上述情况需对计数板冲洗拭干重新加样。

⑧计数：静置片刻，使细胞沉降到计数板上，不再随液体漂移，将细胞计数板放置于显微镜的载物台上夹稳，先在低倍镜下找到计数区后，再转换高倍镜观察并计数。

由于活细胞的遮光率和液体的折光率相近，观察时应减弱光照的强度。

⑨计数时计数区是由16个中方格组成，按对角线方位，数左上、左下、右上、右下的4个大方格的细胞数，为了保证计数的准确性，避免重复计数和漏记，在计数时，对沉降在格线上的细胞的统计应有统一的规定计数原则：计上不计下，计左不计右！如细胞位于大方格的双线上，计数时则数上线不数下线，数左线不数右线，以减少误差。

即位于本格上线和左线上的细胞计入本格，本格的下线和右线上的细胞按规定计入相应的格中。

按下式计算：细胞悬液细胞数/ml＝4个大格细胞总数/4×10 000 ×稀释倍数2.感染种子：取平行对照培养优质融合度≧80%的细胞，弃旧培养基并加入含病毒种子的30mL 感染培养基（DMEM+10% FBS+1pfu/cell），轻轻晃动培养瓶，使病毒在培养基中充分混匀。

3. 收集种子：标记病毒种类和培养日期，在37o C，5% CO2条件下培养。

定时（24h/48h/60h/72h)检查CPE(细胞变圆变亮脱壁，漂浮)，待≧80%细胞出现CPE，即可收集。

将含病毒细胞悬液加入50mL离心管中，标记病毒种类和日期，冻存于-80℃备用，并测定病毒滴度，以备感染病毒使用。

大量病毒制备的灭菌准备工作1.用过的500mL离心瓶泡入酸液中，过夜，冲洗干净，烤干，高温灭菌。

2.准备足量T175培养瓶必须泡入酸液中，过夜，用水充分冲洗，干燥，灭菌包布包被灭菌。

3.培养细胞所用的移液管，离心管必须泡入酸液中，过夜，用冲洗干净，干燥，灭菌包布包被灭菌。

4.离心管泡入酸液中，过夜后再处理，针头直接灭菌，在移除针头钱，确保离心管实在一个大烧杯上，这样漏液不会污染操作台。

5.研磨器泡入酸液中，过夜，用水充分冲洗，干燥，灭菌包布包被灭菌。

6.Beckman 超高速离心机及特制转子和离心管准备。

7.V型槽，96孔板，排枪准备。

病毒制备程序一．细胞准备：1.建立细胞种子库：复苏细胞（CV1用于痘苗病毒病毒；JH293用于腺病毒病毒）分别于与第3/5/7/14天取上清两份，一份用于支原体检测，另一份加至培养基中放于培养箱中定时镜下观测，用于细菌检测，保证细胞质量。

待细胞生长细胞融合度≧80%消化传代扩增并冻存足量细胞种子于液氮中，冻存管上须准确标记所冻细胞名字，代数，冻存人以及冻存日期等相关信息。

（慢冻速溶）2.细胞扩增培养：①当1瓶T175培养瓶中细胞生长融合度≧80%时，将培养瓶中培养基吸出，各加入1ml胰酶消化，37℃，2-3分钟；加入适量（5ml）完全培养基终止消化，全部转移至50ML离心管中，总量为6ml。

分别抽取2ml此混合液加入含18ml完全培养基（含10%血清）的T175培养瓶中共三瓶继续培养（1传3），原瓶继续培养待下一次传代。

②继而同上方法扩增至12瓶T175培养瓶培养（1传4）细胞生长融合度≧80%时同上方法扩增至36瓶为一批（1传3），其中1瓶T175培养瓶中细胞作为平行对照，放入37℃ CO2孵育箱中培养48-72小时。

平行对照培养瓶同时放入孵育箱，直至融合度≧80%。

二．病毒感染：①观察平行对照培养瓶中细胞生长率≧80%时，准备进行病毒感染；同时也观察其它所有细胞，对比细胞增殖速度是否一致。

②取平行对照瓶细胞计数，并计算需要感染病毒量（1pfu/cell)。

③-80℃冰箱中取出测定过病毒滴度的病毒种子，按计算好的病毒量配制1080ml（30ml /瓶×36瓶）含2%血清的DMEM培养基。

放入37℃二氧化碳孵育箱中培养48-72小时，或直到≥90%细胞都出现CPE。

痘苗病毒的收获和纯化三．病毒收获：1)从37℃二氧化碳孵育箱中取出达到收获标准的36瓶T175培养瓶，轻轻晃动培养瓶，少量贴壁细胞即刻脱落。

而后移至超净工作台用移液管轻轻吹打未脱落细胞，并将含病毒混合液分装（收集）到灭菌的500ml离心瓶中。

2)移至高速离心机中配平，3500rpm，15min，4℃离心。

3)弃上清，移液管取10ml冷PBS加至离心瓶中重悬混匀，将液体转入50ml 离心管中。