药品生产技术《维生素C的生产》
生产案例二维生素C发酵
维生素C在国外，1938年开始工业化生产，主要用作保健品及食品添加剂。
一般采用采用莱氏化学法。生产流程图如下：
在国内，开始工业化生产有30多年历史,主要作为药用。采用自行开发的发酵法，分为发酵,提取,转化三个步骤。
1、发酵过程：
2、提取过程：
3、转化过程：
莱氏法的优点是生产工艺成熟，总收率能到达60%〔对D-山梨醇计〕，优级品率为100%，但生产中为使其它羟基不受影响，需用丙酮保护，使反响步骤增多，连续操作有困难，且原料丙酮用量大，苯毒性大，劳动保护强度大，并污染环境。由于存在上述问题，莱氏法工艺已逐步被两步发酵法所取代。
两步发酵法也是以葡萄糖为原料，经高压催化氢化、两步微生物〔黑醋菌、假单孢杆菌和氧化葡萄糖酸杆菌的混合菌株〕氧化，酸〔或碱〕转化等工序制得维生素C。这种方法系将莱氏法中的丙酮保护和化学氧化及脱保护等三步改成一步混合菌株生物氧化。因为生物氧化具有特异的选择性，利用适宜的菌将碳上羟基氧化，可以省去保护和脱保护两步反响。
此法的最大特点是革除了大量的有机溶剂，改善了劳动条件和环境保护问题，近年来又去掉了动力搅拌，大大地节约了能源。我国已全部采用两步发酵法工艺，淘汰了莱氏法工艺。
第一节L-山梨糖的制备
一、菌种制备
黑醋菌是一种小短杆菌，属革兰氏阴性菌〔G-〕，生长温度为30~36℃，最适温度为30~33℃。
培养方法：将黑醋菌保存于斜面培养基中，每月传代一次，保存于0~5℃冰箱内。菌种从斜面培养基移入三角瓶种液培养基中，在30~33℃振荡培养48h，合并入血清瓶内，糖量在100mg/ml
以上，镜检菌体正常，无杂菌，可接入生产。
二、发酵液制备
种子培养分为一、二级种子罐培养，都以质量浓度为16%~2021D-山梨醇投料，并以玉米浆、酵母膏、泡敌、碳酸钙、复合维生素B、磷酸盐、硫酸盐等为培养基，在pH5.4~5.6下于12021温30min灭菌，待罐温冷却至30~34℃，用微孔法接种。在此温度下，通入无菌空气〔1VVM〕，并维持罐压0.03~0.05MPa 进行一、二级种子培养。当一级种子罐产糖量大于50mg/ml〔发酵率达40%以上〕，二级种子罐产糖量大于70mg/ml〔发酵率在50%以上〕，菌体正常，即可移种。
三、发酵罐发酵
以2021右D-山梨醇为投料浓度，另以玉米浆、尿素为培养基，在pH5.4~5.6，灭菌消毒冷却后，按接种量为10%接入二级种子培养液。在31~34℃，通入无菌空气〔0.7VVM〕，维持罐压0.03~0.05Mpa等条件下进行培养。当发酵率在95%以上，温度略高〔31~33℃〕、pH在7.2左右，糖量不再上升时即为发酵的终点。
四、发酵液处理
将发酵液过滤除去菌体，然后控制真空度在0.05MPa以上，温度在60℃以下，将滤液减压浓缩结晶即得L-山梨糖。
第二节2-酮基-L-古龙酸的制备
一、菌种制备
将保存于冷冻管的假单孢杆菌和氧化葡萄糖酸杆菌菌种活化，别离及混合培养后移入三角瓶种液培养基中，在29~33℃振荡培养24h，产酸量在6~9mg/ml，pH值降至7以下，菌形正常无杂菌，再移入血清瓶中，即可接入生产。
二、发酵液制备
先在一级种子培养罐内参加经过灭菌后的辅料〔玉米浆、尿素及无机盐〕和醪液〔折纯含山梨糖1%〕，控制温度为29~30℃，发酵初期温度较低，通入无菌空气维持罐压为0.05MPa，pH6.7~7.0，至产酸量达合格浓度，且不再增加时，接入二级种子罐培养，条件控制同前。作为伴生菌的芽孢杆菌开始形成芽孢时，产酸菌株开始产生2-酮基-L-古龙酸，直到完全形成芽孢和出现游离芽孢时，产酸量达顶峰〔5mg/ml以上〕为二级种子培养终点。
三、发酵罐发酵
供发酵罐用的培养基经灭菌冷却后，参加至山梨糖的发酵液内，接入第二步发酵菌种的二级种子培养液，在温度30℃，通入无菌空气下进行发酵，为保证产酸正常进行，往往定期滴加灭菌的碳酸钠溶液调pH值，使保持7.0左右。当温度略高〔31~33℃〕，pH 在7.2左右、二次检测酸量不再增加，残糖量0.5mg/ml以下，即为发酵终点，得含古龙酸钠的发酵液。此时游离芽孢及残存芽孢杆菌菌体已逐步自溶成碎片，用显微镜观察已无法区分两种细菌的差异，整个产酸反响到此也就结束了。所以，根据芽孢的形成时间来控制发酵是一种有效的方法。在整个
发酵期间，保持一定数量的氧化葡萄糖酸杆菌〔产酸菌〕是发酵的关键。
整个发酵过程可分为产酸前期、产酸中期和产酸后期。产酸前期主要是菌体适应环境进行生长的阶段。该阶段产酸量很少，为了提高发酵收率应尽可能缩短产酸前期。产酸前期长短与底物浓度、接种量、初始pH及溶氧浓度等有关。产酸中期是菌体大量积累产物的时期。产酸中期的时间主要决定于产酸前期菌体的生长的好坏和中期的溶氧浓度控制，也与pH值等有关。因此适宜的操作条件可获得较大的产酸速率和较长的发酵中期，从而可提高发酵收率。产酸后期，菌体活性下降，产酸速率变小，同时局部酸发生分解，引起酸浓度下降。生产上由于要求发酵液中残糖浓度小于0.5mg/ml，不可能提前终止发酵，所以在此期间应采取措施，设法延长菌体活性，使之继续产酸。
影响发酵产率的因素主要有以下几点：
(1)山梨糖初始浓度在一定的温度〔30℃〕、压力〔表压0.05Mpa〕和pH〔6.7~7.0〕和溶液氧浓度〔10% ~60%〕下存在一个极限浓度，此极限浓度为80mg/ml。当山梨醇浓度大于该浓度时，将抑制菌体生长，表现为产酸前期长，产酸速率变小，使发酵产率下降。从生产角度考虑，希望得到尽可能高的酸浓度，也即要求山梨糖初始浓度越高越好。因此，较适宜的初始浓度为80mg/ml左右。在产酸中期，菌体生长正常时，高浓度的山梨糖对发酵收率影响不大。因此，在发酵过程中滴加山梨糖或一次补
加山梨糖均能提高发酵液中产物浓度。
(2)溶氧浓度在发酵过程中，溶氧不但是菌体生长所必需的条件，而且又是反响物之一。在菌体生长阶段，高溶氧能使菌体很好地生长，而在中期，那么应控制一定的溶氧浓度以限制菌体的过渡生长，防止过早衰老，从而延长菌体的生产期。中期溶氧浓度越高，产酸速率越大，但产酸中期越短，这对整个发酵过程是不利的。因此，生产上一般前期处于高的溶氧状态；中期溶氧以3.5~6.0mg/ml为宜；后期耗氧减少，大多数情况下溶氧浓度会上升。
(3)pH值发酵过程中如pH降至6.4是不利的，如能通过连续的调节使pH维持于6.7~7.9间对发酵是有利的。.
四、2-酮基-L-古龙酸的提取
2-酮基-L-古龙酸是将2-酮基-L-古龙酸钠用离子交换法经过两次交换，去掉其中Na+而得。一次、二次交换中均采用732阳离子交换树脂。
(1)工艺过程
a.一次交换将发酵液冷却后用盐酸酸化，调至菌体蛋白等电点，使菌体蛋白沉淀。静置数小时后去掉菌体蛋白，将酸化上清液以2~3m3/h的流速压入一次阳离子交换柱进行离子交换。当回流到pH3.5时，开始收集交换液，控制流出液的pH值，以防树脂饱和，发酵液交换完后，用纯水洗柱，至流出液古龙酸含量低于1mg/ml以下为止。当流出液到达一定pH值时，那么更换树
脂进行交换，原树脂进行再生处理。
b.加热过滤将经过一次交换后的流出液和洗液合并，在加热罐内调pH至蛋白质等电点，然后加热至70℃左右，加0.3%左右的活性炭，升温至90~95℃后再保温10~15min，使菌体蛋白凝结。停搅拌，快速冷却，高速离心过滤得清液。
c.二次交换将酸性上清液打入二次交换柱进行离子交换，至流出液的pH1.5时，开始收集交换液，控制流出液pH1.5~1.7，交换完毕，洗柱至流出液古龙酸含量在1mg/ml以下为止。假设pH>1.7时，需更换交换柱。
d.减压浓缩结晶先将二次交换液进行一级真空浓缩，温度45℃，至浓缩液的相对密度达1.2左右，即可出料。接着，又在同样条件下进行二级浓缩，然后参加少量乙醇，冷却结晶，甩滤并用冰乙醇洗涤，得2-酮基-L-古龙酸。
如果以后工序使用碱转化，那么需将2-酮基-L-古龙酸进行真空枯燥，以除去局部水分。
(2)考前须知及“三废处理〞
a.调好等电点是凝聚菌体蛋白的重要因素。
b.树脂再生的好坏直接影响2-酮基-L-古龙酸的提取。标准为进出酸差小于1%、无Cl-。
c.浓缩时，温度控制在45℃左右较好，以防止跑料和碳化。
d.结晶母液可再浓缩和结晶甩滤，加以回收以提高收率；废盐酸回收后可再用于第一次交换。
第三节粗品维C的制备
由2-酮基-L-古龙酸〔简称古龙酸〕转化成维C的方法目前已从酸转化开展到碱转化、酶转化，使维C生产工艺日趋完善。
一、酸转化
①反响原理见莱氏法生产粗维C酸转化的反响原理。
②工艺过程配料比为2-酮基-L-古龙酸：38%盐酸：丙酮=1：
0.4〔W/ W〕：0.3〔W/ W〕。
先将丙酮及一半古龙酸参加转化罐搅拌，再参加盐酸和余下的古龙酸。待罐夹层满水后开蒸汽阀，缓慢升温至30~38℃关汽，自然升温至52~54℃，保温约5h，反响到达高潮，结晶析出，罐内温度稍有上升，最高可达59℃，严格控制温度不能超过60℃。反响过程中为防止泡沫过多引起冒罐，可在投料时参加一定量的泡敌作消泡剂。剧烈反响期后，维持温度在50~52℃，至总保温时间为2021开冷却水降温1h，参加适量乙醇，冷却至-2℃，放料。甩滤0.5h后用冰乙醇洗涤，甩干，再洗涤，甩干3h左右，枯燥后得粗维C。
③影响因素盐酸浓度低，转化不完全；浓度过高，那么分解生成许多杂质，使反响物色深，一般盐酸浓度为38%。转化反响中需参加一定量丙酮，以溶解反响中生成的糠醛，防止其聚合，保持物料中有一定浓度的糠醛，从而防止抗坏血酸的进一步分解生成更多的糠醛。
二、碱转化
(1)反响原理 先将古龙酸与甲醇进行酯化反响，再用碳酸氢钠将2-酮基-L-古龙酸甲酯转化成钠盐，最后用硫酸酸化得粗维C 。反响过程如下：
2-酮基-L-古龙酸甲酯
维生素C 钠盐
粗维生素C
(2)工艺过程
a.酯化 将甲醇、浓硫酸和枯燥的古龙酸参加罐内，搅拌并加热，使温度为66~68℃，反响4h 左右即为酯化终点。然后冷却，参加碳酸氢钠，再升温至66℃左右，回流10h 后即为转化终点。再冷却至0℃，离心别离，取出维生素C 钠盐，母液回收。
b.酸化 将维C 钠盐和一次母液干品、甲醇参加罐内，搅拌，用硫酸调至反响液pH 为2..2~2.4，并在40℃左右保温1.5h ，然 OH H CH 2OH H H HO C C C C HO COOH O + CH 3OH 浓[酯化]H 2SO 4
66~68℃
[转化]
33OH H 2OH
H H HO C
C C C HO COOCH 3
O C O C C C C CH 2OH HO HO NaO H H C
O
C
C C
C CH 2OH
HO HO HO H H
O
后冷却，离心别离，弃去硫酸钠。滤液加少量活性炭，冷却压滤，然后真空减压浓缩，蒸出甲醇，浓缩液冷却结晶，离心别离得粗维C 。回收母液成干品，继续投料套用。
〔3〕改良后的转化工艺 碳酸氢钠转化有许多缺乏之处。由于使用NaHCO 3后，带入大量钠离子，直接影响了维生素C 的质量。转化后母液中产生大量的硫酸钠，严重影响母液套用及成品质量，且生产劳动强度大。瑞士1984年推出的维生素C 碱转化新工艺有效地防止了碳酸氢钠转化的缺乏。新工艺采用有机胺与2-酮基-L-古龙酸甲酯成盐，通过有机溶剂提取，裂解、游离成维生素C 。
①反响原理
式中X —15~30碳直链叔胺；16~25碳支链仲胺；12~24碳支链伯胺
②工艺过程 首先将2-酮基-L-古龙酸甲酯参加甲醇中，搅拌，升温，回流溶解。在惰性气体中滴加胺，回流、搅拌、浓缩，用蒸馏水溶解油状物。有机溶媒提取、别离，有机层用硫酸钠枯燥后，回收套用；水层经浓缩、结晶得维生素C 晶体。
③碱转化新工艺的主要特点是克服了目前碱转化的缺点，提OH H
CH 2OH H
H HO C C C C HO
COOH
O
+ CH 3OH 24OH H CH 2OH H H HO C C C C HO COOCH 3O C O C C C C CH 2OH HO HO HO H H O C O C C C C CH 2OH HO HO XO H H O 胺
高了产品的质量，转化收率有所提高，有机溶媒回收套用率高，反响温度要求不高，大量使用液体投料，对自动控制千吨维生素C的生产创造了有利条件。其缺乏之处是2-酮基-L-古龙酸甲酯与胺反响需在惰性气体保护下进行，如氮气、氩气等。
在本工艺中，维生素C胺盐的游离有独特之处。按常规需参加酸或碱中和才能使胺游离，而本工艺采用了有机溶媒的液-液提取方法。当然，也可用温浸的方法，即加热有机溶媒，以到达游离的目的。
除此之外，日本于80年代推出了酸转化新工艺。日本盐野义制药株式会社对发酵后的酸转化做了改良。主要工艺是将2-酮基-L-古龙酸钠盐参加到乙醇与丙酮的混合液中，在室温下搅拌，并向混合液中通入氯气，于600C左右反响，析出氯化钠固体，滤去，并用丙酮和乙醇混合液洗净，合并滤液，参加惰性溶剂，经保温、搅拌、冷却、析晶，得维生素C精品。本工艺的主要特点是析晶纯度较高，反响温度低，工艺时间缩短，减少了维生素C精制过程中的水溶解，因而防止了导致维生素C不稳定因素，提高了产品质量，收率也较高，溶媒经分馏后可重新使用。新的酸转化工艺采用的惰性溶媒有氯甲烷、氯乙烷、甲苯、氯仿等。
第四节粗维C的精制
一、工艺过程
配料比为粗维C ：蒸馏水：活性炭：晶种=1：1.1：0.58：0.00023(重量比)。将粗维C 真空枯燥，加蒸馏水搅拌溶解后，参加活性炭，搅拌5~10min ，压滤。滤液至结晶罐，向罐中加50L 左右的乙醇，搅拌后降温，加晶种使其结晶。将晶体离心甩滤，用冰乙醇洗涤，再甩滤，至枯燥器中枯燥，即得精制维生素C 。
二、考前须知
(1)结晶时，结晶罐中最高温度不得高于45℃，最低不得低于-4℃，不能在高温下加晶种；
(2)回转枯燥要严格控制循环水温和时间，夏天循环水温高，可用冷凝器降温；
(3)压滤时遇停电，应立即关空压阀保压。
(4) 生产中维生素C 收率的计算
理论值〔%〕= 生成量理论维山梨醇投料量
C D -⨯分子量维山梨醇分子量C D -⨯100
实际值〔%〕=发酵收率〔%〕⨯提取收率〔%〕⨯转化收率〔%〕⨯精制收率〔%〕
维C 转化生成率〔%〕=
投料用量收得量维KGA C -2⨯分子量维分子量C KGA -2⨯100