药品生产技术《维生素C的生产》

生产案例二维生素C发酵

维生素C在国外，1938年开始工业化生产，主要用作保健品及食品添加剂。

一般采用采用莱氏化学法。生产流程图如下：

在国内，开始工业化生产有30多年历史,主要作为药用。采用自行开发的发酵法，分为发酵,提取,转化三个步骤。

1、发酵过程：

2、提取过程：

3、转化过程：

莱氏法的优点是生产工艺成熟，总收率能到达60%〔对D-山梨醇计〕，优级品率为100%，但生产中为使其它羟基不受影响，需用丙酮保护，使反响步骤增多，连续操作有困难，且原料丙酮用量大，苯毒性大，劳动保护强度大，并污染环境。由于存在上述问题，莱氏法工艺已逐步被两步发酵法所取代。

两步发酵法也是以葡萄糖为原料，经高压催化氢化、两步微生物〔黑醋菌、假单孢杆菌和氧化葡萄糖酸杆菌的混合菌株〕氧化，酸〔或碱〕转化等工序制得维生素C。这种方法系将莱氏法中的丙酮保护和化学氧化及脱保护等三步改成一步混合菌株生物氧化。因为生物氧化具有特异的选择性，利用适宜的菌将碳上羟基氧化，可以省去保护和脱保护两步反响。

此法的最大特点是革除了大量的有机溶剂，改善了劳动条件和环境保护问题，近年来又去掉了动力搅拌，大大地节约了能源。我国已全部采用两步发酵法工艺，淘汰了莱氏法工艺。

第一节L-山梨糖的制备

一、菌种制备

黑醋菌是一种小短杆菌，属革兰氏阴性菌〔G-〕，生长温度为30~36℃，最适温度为30~33℃。

培养方法：将黑醋菌保存于斜面培养基中，每月传代一次，保存于0~5℃冰箱内。菌种从斜面培养基移入三角瓶种液培养基中，在30~33℃振荡培养48h，合并入血清瓶内，糖量在100mg/ml

以上，镜检菌体正常，无杂菌，可接入生产。

二、发酵液制备

种子培养分为一、二级种子罐培养，都以质量浓度为16%~2021D-山梨醇投料，并以玉米浆、酵母膏、泡敌、碳酸钙、复合维生素B、磷酸盐、硫酸盐等为培养基，在pH5.4~5.6下于12021温30min灭菌，待罐温冷却至30~34℃，用微孔法接种。在此温度下，通入无菌空气〔1VVM〕，并维持罐压0.03~0.05MPa 进行一、二级种子培养。当一级种子罐产糖量大于50mg/ml〔发酵率达40%以上〕，二级种子罐产糖量大于70mg/ml〔发酵率在50%以上〕，菌体正常，即可移种。

三、发酵罐发酵

以2021右D-山梨醇为投料浓度，另以玉米浆、尿素为培养基，在pH5.4~5.6，灭菌消毒冷却后，按接种量为10%接入二级种子培养液。在31~34℃，通入无菌空气〔0.7VVM〕，维持罐压0.03~0.05Mpa等条件下进行培养。当发酵率在95%以上，温度略高〔31~33℃〕、pH在7.2左右，糖量不再上升时即为发酵的终点。

四、发酵液处理

将发酵液过滤除去菌体，然后控制真空度在0.05MPa以上，温度在60℃以下，将滤液减压浓缩结晶即得L-山梨糖。

第二节2-酮基-L-古龙酸的制备

一、菌种制备

将保存于冷冻管的假单孢杆菌和氧化葡萄糖酸杆菌菌种活化，别离及混合培养后移入三角瓶种液培养基中，在29~33℃振荡培养24h，产酸量在6~9mg/ml，pH值降至7以下，菌形正常无杂菌，再移入血清瓶中，即可接入生产。

二、发酵液制备

先在一级种子培养罐内参加经过灭菌后的辅料〔玉米浆、尿素及无机盐〕和醪液〔折纯含山梨糖1%〕，控制温度为29~30℃，发酵初期温度较低，通入无菌空气维持罐压为0.05MPa，pH6.7~7.0，至产酸量达合格浓度，且不再增加时，接入二级种子罐培养，条件控制同前。作为伴生菌的芽孢杆菌开始形成芽孢时，产酸菌株开始产生2-酮基-L-古龙酸，直到完全形成芽孢和出现游离芽孢时，产酸量达顶峰〔5mg/ml以上〕为二级种子培养终点。

三、发酵罐发酵

供发酵罐用的培养基经灭菌冷却后，参加至山梨糖的发酵液内，接入第二步发酵菌种的二级种子培养液，在温度30℃，通入无菌空气下进行发酵，为保证产酸正常进行，往往定期滴加灭菌的碳酸钠溶液调pH值，使保持7.0左右。当温度略高〔31~33℃〕，pH 在7.2左右、二次检测酸量不再增加，残糖量0.5mg/ml以下，即为发酵终点，得含古龙酸钠的发酵液。此时游离芽孢及残存芽孢杆菌菌体已逐步自溶成碎片，用显微镜观察已无法区分两种细菌的差异，整个产酸反响到此也就结束了。所以，根据芽孢的形成时间来控制发酵是一种有效的方法。在整个

发酵期间，保持一定数量的氧化葡萄糖酸杆菌〔产酸菌〕是发酵的关键。

整个发酵过程可分为产酸前期、产酸中期和产酸后期。产酸前期主要是菌体适应环境进行生长的阶段。该阶段产酸量很少，为了提高发酵收率应尽可能缩短产酸前期。产酸前期长短与底物浓度、接种量、初始pH及溶氧浓度等有关。产酸中期是菌体大量积累产物的时期。产酸中期的时间主要决定于产酸前期菌体的生长的好坏和中期的溶氧浓度控制，也与pH值等有关。因此适宜的操作条件可获得较大的产酸速率和较长的发酵中期，从而可提高发酵收率。产酸后期，菌体活性下降，产酸速率变小，同时局部酸发生分解，引起酸浓度下降。生产上由于要求发酵液中残糖浓度小于0.5mg/ml，不可能提前终止发酵，所以在此期间应采取措施，设法延长菌体活性，使之继续产酸。

影响发酵产率的因素主要有以下几点：

(1)山梨糖初始浓度在一定的温度〔30℃〕、压力〔表压0.05Mpa〕和pH〔6.7~7.0〕和溶液氧浓度〔10% ~60%〕下存在一个极限浓度，此极限浓度为80mg/ml。当山梨醇浓度大于该浓度时，将抑制菌体生长，表现为产酸前期长，产酸速率变小，使发酵产率下降。从生产角度考虑，希望得到尽可能高的酸浓度，也即要求山梨糖初始浓度越高越好。因此，较适宜的初始浓度为80mg/ml左右。在产酸中期，菌体生长正常时，高浓度的山梨糖对发酵收率影响不大。因此，在发酵过程中滴加山梨糖或一次补

加山梨糖均能提高发酵液中产物浓度。

(2)溶氧浓度在发酵过程中，溶氧不但是菌体生长所必需的条件，而且又是反响物之一。在菌体生长阶段，高溶氧能使菌体很好地生长，而在中期，那么应控制一定的溶氧浓度以限制菌体的过渡生长，防止过早衰老，从而延长菌体的生产期。中期溶氧浓度越高，产酸速率越大，但产酸中期越短，这对整个发酵过程是不利的。因此，生产上一般前期处于高的溶氧状态；中期溶氧以3.5~6.0mg/ml为宜；后期耗氧减少，大多数情况下溶氧浓度会上升。

(3)pH值发酵过程中如pH降至6.4是不利的，如能通过连续的调节使pH维持于6.7~7.9间对发酵是有利的。.

四、2-酮基-L-古龙酸的提取

2-酮基-L-古龙酸是将2-酮基-L-古龙酸钠用离子交换法经过两次交换，去掉其中Na+而得。一次、二次交换中均采用732阳离子交换树脂。

(1)工艺过程

a.一次交换将发酵液冷却后用盐酸酸化，调至菌体蛋白等电点，使菌体蛋白沉淀。静置数小时后去掉菌体蛋白，将酸化上清液以2~3m3/h的流速压入一次阳离子交换柱进行离子交换。当回流到pH3.5时，开始收集交换液，控制流出液的pH值，以防树脂饱和，发酵液交换完后，用纯水洗柱，至流出液古龙酸含量低于1mg/ml以下为止。当流出液到达一定pH值时，那么更换树