葡聚糖凝胶离子交换剂
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1．葡聚糖凝胶
葡聚糖凝胶（Sephadex）具有良好的 化学稳定性，是目前生化产品制备中最 常用的凝胶。
G类葡聚糖凝胶（Sephadex-G）的最基本骨架是 葡聚糖，它是一种以右旋葡萄糖为残基的多糖， 分子间主要是α-1,6- 糖苷键（约占 95% ），分 枝为l，3-糖苷键（约占5%），以1-氯-2，3-环 氧丙烷（见右式）Cl－CH2－CH－CH2为交联剂将
－、凝胶层析的基本原理
凝胶层析的原理
l 分子大小不同混合物上柱； 2 洗脱开始，小分子扩散进人凝胶 颗粒内，大分子被排阻于颗粒之外；3 大小分子分开： 4大分子行程 较短，已洗脱出层析柱，小分子尚在进行中
凝胶是一类多孔性高分子聚合物，每 个颗粒犹如一个筛子。当样品溶液通过 凝胶柱时，相对分子质量较大的物质由 于直径大于凝胶网孔而只能沿着凝胶颗 粒间的孔隙，随着溶剂流动，因此流程 较短，向前移动速度快而首先流出层析 柱；反之，相对分子质量较小的物质由 于直径小于凝胶网孔，可自由地进出凝 胶颗粒的网孔，在向下移动过程中，它 们从凝胶内扩散到胶粒孔隙后再进入另
Vi 简称内水体积，可由 g· Wr 求得（g 为干 凝胶质量，单位为g，Wr为凝胶吸水量，以mL ／g表示）。Vi也可以从洗脱一种完全不受凝 胶微孔排阻的小分子溶质（如重铬酸钾）的 洗脱体积Ve计算，即
Ve＝Vo＋Vi
对某物质在凝胶柱内洗脱体积Ve、Vo和 Vi之间的关系可用下式表示： Ve＝Vo＋Kd.Vi
凝胶层析法
思考题（课前设疑）
1.层析分离技术包括哪些技术？分别叙 述凝胶层析、离子交换层析、亲和层析、 高压液相层析、疏水层析、聚焦层析的 分离纯化原理。 2.一般在粗品制备阶段和精品纯化阶段 分别应采用哪些层析分离技术？
3.膜分离技术的原理是什么？它同一般
的透析方法相比有何特点？
4.凝胶层析的应用范围有那几方面？
凝胶层析的定义：
凝胶是一种具有多孔、网状结构的分子筛。 利用这种凝胶分子筛对大小、形状不同的分 子进行层析分离，称凝胶层析 。
凝胶层析的应用范围：
凝胶层析法适用于分离和提纯蛋白质、酶、 多肽、激素、多糖、核酸类等物质。分子大小 彼此相差25%的样品，只要通过单一凝胶床就可 以完全将它们分开。利用凝胶的分子筛特性， 可对这些物质的溶液进行脱盐、浓缩、去热源 和脱色。 凝胶层析的优点 凝胶层析具有设备简单、操作方便、分离 迅速及不影响分子生物学活性等优点。目前已 被广泛应用于各种生化产品的分离和纯化。
式中Ve为脱体积，它包括自加入样品时算 起，到组分最大浓度出现时所流出的体积。 Kd为每个溶质分子在流动相和固定相之间的 一个特定的分配系数，它只与被分离物质分 子大小和凝胶颗粒内孔隙大小分布有关。Kd 可通过实验由Ve、Vo和Vi求得。
Ve＝Vo＋Kd.Vi
可改写为：
（Ve-Vo） Kd=－－－－ Vi
5.凝胶层析有何优缺点？
6.常用凝胶分那几类？分别叙述它们各 自的应用范围及特点。 7.在实验中应如何选择凝胶与预处理？
8.细粒凝胶柱流速慢，洗脱峰越窄，分辨 率高，适用于什么产品多分离或分析？粗 粒凝胶柱流速高，但洗脱峰平坦，分辨率 低，适用于产品制备那个阶段的分离？
9.什么是“类分离”和“分级分离 ”？
一凝胶颗粒，如此不断地进入与逸出，使 流量增长，移动速率慢而最后流出层析柱。 而中等大小的分子，它们也能在凝胶颗粒 内外分布，部分进入颗粒，从而在大分子 物质与小分子物质之间被洗脱。这样，经 过层析柱，使混合物中的各物质按其分子 大小不同而被分离。
Vt=Vo+Vi+Vg
Vt=π R2h
V。简称为外水体积，Vo等于被完全排阻 的大分子的洗脱体积。可以用一个已知相对 分子质量远超过凝胶排阻极限的有色分子， 如常用的蓝色葡聚糖 -2000 溶液通过柱床， 即可测出柱床的外水体积Vo。
3 ．分离条件缓和。凝胶骨架亲水，分 离过程又不涉及化学键的变化，所以对 分离物的活性没有不良影响。 4 ．应用广泛。适用于各种生化物质，如 肽类、激素、蛋白质、多糖、核酸的分离 纯化、脱盐、浓缩以及分析测定等。分离 的分子量范围也很宽，如Sephadex G类为 102～105d；Sepharose类为105～108d。
10.在凝胶层析中要想得到好的层析结果 应注意那些问题和采取那些措施？ 11.凝胶用过后，有那几种保存方法？ 12.葡聚糖凝胶离子交换剂，葡聚糖凝胶 和离子交换剂有何异同及特点？
凝胶层析（gel chromatography）常出 现多种名称 ：
如凝胶过滤、分子筛层析、排阻层析、凝 胶渗透层析等。
5．分辨率不高，分离操作较慢。由于凝 胶层析是以物质分子量的不同作为分离 依据的，分子量的差异仅表现在流速的 差异上，所以分离时流速必须严格把握。 因而分离操作一般较慢。而且对于分子 量相差不多的物质难以达到很好的分离。 此外，凝胶层析要求样品粘度不宜太高。 凝胶颗粒有时还有非特异吸附现象 。
三、常用凝胶的结构和性质 凝胶层析法常用的凝胶有天然凝胶 （如琼脂粉凝胶）和人工合成凝胶（如 葡聚糖凝胶和聚丙烯酰胺凝胶）。
不同型号葡聚糖凝胶柱床参数 型号 G-10
G-Hale Waihona Puke Baidu5 G-25 G-50 G-75 G-100 G-200
Vt 2
3 5 10 13 17 30
V0 0.8
1.1 2 4 5 6 9
Vi 1
1.5 2.5 5 7 10 20
二、凝胶层析的特点
1．凝胶层析操作简便，所需设备简单。 有时只要有一根层析柱便可进行工作。 分离介质—凝胶完全不需要像离子交换 剂那样复杂的再生过程便可重复使用。 2．分离效果较好，重复性高。最突出 的是样品回收率高，接近100％。
当Kd＝0时，Ve=Vo，说明这种溶质相对分子 质量大，完全不能进入凝胶颗粒微孔内，被 排阻于凝胶颗粒之外而最先洗脱下来；
当Kd＝1时，即Ve小分子 ＝Vo＋KdVi，说明这 种溶质的相对分子质量小，完全向凝胶颗粒 内扩散，在洗脱过程中将最后流出柱外。
但实际上，约有1/5的内水因溶剂化作用 而呈水合状态，妨碍小分子的自由扩散。故 实际上Ve小分子 ＝Vo＋0.8Vi；当0＜Kd＜l时， 意味着溶质分子只有部分向凝胶颗粒内扩散， Kd愈大，进入凝胶颗粒内的程度愈大；Kd＝ 0.5时，其洗脱体积Ve＝Vo十0.5Vi。
葡聚糖凝胶（Sephadex）具有良好的 化学稳定性，是目前生化产品制备中最 常用的凝胶。
G类葡聚糖凝胶（Sephadex-G）的最基本骨架是 葡聚糖，它是一种以右旋葡萄糖为残基的多糖， 分子间主要是α-1,6- 糖苷键（约占 95% ），分 枝为l，3-糖苷键（约占5%），以1-氯-2，3-环 氧丙烷（见右式）Cl－CH2－CH－CH2为交联剂将
－、凝胶层析的基本原理
凝胶层析的原理
l 分子大小不同混合物上柱； 2 洗脱开始，小分子扩散进人凝胶 颗粒内，大分子被排阻于颗粒之外；3 大小分子分开： 4大分子行程 较短，已洗脱出层析柱，小分子尚在进行中
凝胶是一类多孔性高分子聚合物，每 个颗粒犹如一个筛子。当样品溶液通过 凝胶柱时，相对分子质量较大的物质由 于直径大于凝胶网孔而只能沿着凝胶颗 粒间的孔隙，随着溶剂流动，因此流程 较短，向前移动速度快而首先流出层析 柱；反之，相对分子质量较小的物质由 于直径小于凝胶网孔，可自由地进出凝 胶颗粒的网孔，在向下移动过程中，它 们从凝胶内扩散到胶粒孔隙后再进入另
Vi 简称内水体积，可由 g· Wr 求得（g 为干 凝胶质量，单位为g，Wr为凝胶吸水量，以mL ／g表示）。Vi也可以从洗脱一种完全不受凝 胶微孔排阻的小分子溶质（如重铬酸钾）的 洗脱体积Ve计算，即
Ve＝Vo＋Vi
对某物质在凝胶柱内洗脱体积Ve、Vo和 Vi之间的关系可用下式表示： Ve＝Vo＋Kd.Vi
凝胶层析法
思考题（课前设疑）
1.层析分离技术包括哪些技术？分别叙 述凝胶层析、离子交换层析、亲和层析、 高压液相层析、疏水层析、聚焦层析的 分离纯化原理。 2.一般在粗品制备阶段和精品纯化阶段 分别应采用哪些层析分离技术？
3.膜分离技术的原理是什么？它同一般
的透析方法相比有何特点？
4.凝胶层析的应用范围有那几方面？
凝胶层析的定义：
凝胶是一种具有多孔、网状结构的分子筛。 利用这种凝胶分子筛对大小、形状不同的分 子进行层析分离，称凝胶层析 。
凝胶层析的应用范围：
凝胶层析法适用于分离和提纯蛋白质、酶、 多肽、激素、多糖、核酸类等物质。分子大小 彼此相差25%的样品，只要通过单一凝胶床就可 以完全将它们分开。利用凝胶的分子筛特性， 可对这些物质的溶液进行脱盐、浓缩、去热源 和脱色。 凝胶层析的优点 凝胶层析具有设备简单、操作方便、分离 迅速及不影响分子生物学活性等优点。目前已 被广泛应用于各种生化产品的分离和纯化。
式中Ve为脱体积，它包括自加入样品时算 起，到组分最大浓度出现时所流出的体积。 Kd为每个溶质分子在流动相和固定相之间的 一个特定的分配系数，它只与被分离物质分 子大小和凝胶颗粒内孔隙大小分布有关。Kd 可通过实验由Ve、Vo和Vi求得。
Ve＝Vo＋Kd.Vi
可改写为：
（Ve-Vo） Kd=－－－－ Vi
5.凝胶层析有何优缺点？
6.常用凝胶分那几类？分别叙述它们各 自的应用范围及特点。 7.在实验中应如何选择凝胶与预处理？
8.细粒凝胶柱流速慢，洗脱峰越窄，分辨 率高，适用于什么产品多分离或分析？粗 粒凝胶柱流速高，但洗脱峰平坦，分辨率 低，适用于产品制备那个阶段的分离？
9.什么是“类分离”和“分级分离 ”？
一凝胶颗粒，如此不断地进入与逸出，使 流量增长，移动速率慢而最后流出层析柱。 而中等大小的分子，它们也能在凝胶颗粒 内外分布，部分进入颗粒，从而在大分子 物质与小分子物质之间被洗脱。这样，经 过层析柱，使混合物中的各物质按其分子 大小不同而被分离。
Vt=Vo+Vi+Vg
Vt=π R2h
V。简称为外水体积，Vo等于被完全排阻 的大分子的洗脱体积。可以用一个已知相对 分子质量远超过凝胶排阻极限的有色分子， 如常用的蓝色葡聚糖 -2000 溶液通过柱床， 即可测出柱床的外水体积Vo。
3 ．分离条件缓和。凝胶骨架亲水，分 离过程又不涉及化学键的变化，所以对 分离物的活性没有不良影响。 4 ．应用广泛。适用于各种生化物质，如 肽类、激素、蛋白质、多糖、核酸的分离 纯化、脱盐、浓缩以及分析测定等。分离 的分子量范围也很宽，如Sephadex G类为 102～105d；Sepharose类为105～108d。
10.在凝胶层析中要想得到好的层析结果 应注意那些问题和采取那些措施？ 11.凝胶用过后，有那几种保存方法？ 12.葡聚糖凝胶离子交换剂，葡聚糖凝胶 和离子交换剂有何异同及特点？
凝胶层析（gel chromatography）常出 现多种名称 ：
如凝胶过滤、分子筛层析、排阻层析、凝 胶渗透层析等。
5．分辨率不高，分离操作较慢。由于凝 胶层析是以物质分子量的不同作为分离 依据的，分子量的差异仅表现在流速的 差异上，所以分离时流速必须严格把握。 因而分离操作一般较慢。而且对于分子 量相差不多的物质难以达到很好的分离。 此外，凝胶层析要求样品粘度不宜太高。 凝胶颗粒有时还有非特异吸附现象 。
三、常用凝胶的结构和性质 凝胶层析法常用的凝胶有天然凝胶 （如琼脂粉凝胶）和人工合成凝胶（如 葡聚糖凝胶和聚丙烯酰胺凝胶）。
不同型号葡聚糖凝胶柱床参数 型号 G-10
G-Hale Waihona Puke Baidu5 G-25 G-50 G-75 G-100 G-200
Vt 2
3 5 10 13 17 30
V0 0.8
1.1 2 4 5 6 9
Vi 1
1.5 2.5 5 7 10 20
二、凝胶层析的特点
1．凝胶层析操作简便，所需设备简单。 有时只要有一根层析柱便可进行工作。 分离介质—凝胶完全不需要像离子交换 剂那样复杂的再生过程便可重复使用。 2．分离效果较好，重复性高。最突出 的是样品回收率高，接近100％。
当Kd＝0时，Ve=Vo，说明这种溶质相对分子 质量大，完全不能进入凝胶颗粒微孔内，被 排阻于凝胶颗粒之外而最先洗脱下来；
当Kd＝1时，即Ve小分子 ＝Vo＋KdVi，说明这 种溶质的相对分子质量小，完全向凝胶颗粒 内扩散，在洗脱过程中将最后流出柱外。
但实际上，约有1/5的内水因溶剂化作用 而呈水合状态，妨碍小分子的自由扩散。故 实际上Ve小分子 ＝Vo＋0.8Vi；当0＜Kd＜l时， 意味着溶质分子只有部分向凝胶颗粒内扩散， Kd愈大，进入凝胶颗粒内的程度愈大；Kd＝ 0.5时，其洗脱体积Ve＝Vo十0.5Vi。