葡聚糖凝胶 Sephadex LH20 使用说明及使用心得

用洗脱剂将凝胶摇匀，直立柱身，让其自然沉降，此时要防止气泡留 在其中。至少半小时打开开关，流出几个柱体种的洗脱剂，目的是使其膨 胀在正确比例的洗脱剂中。 （3） 样品处理：用尽量少的洗脱剂溶解样品，常压过滤。 （4） 湿法上柱。这也是要有技巧的步骤。 （5） 洗脱：控制流速，一般 1drop/s 以下，可参见厂家的一些参数;必要 时更改极性（很多时一个极性就可以将样品洗脱完毕）。再生以备下次使 用。
2 .像水这种高沸点的溶剂是很难蒸干的,,办法是有的,先看看旋转薄
膜的几个要素: 真空度, 冷凝液, 蒸发温度. 1) 真空度决定于水泵的效率和系统的密闭性.一般的国产水泵就能满
足日常的需要(包括蒸水),但一定注意的是水泵的循环水一定要开,如果不 开循环水,水泵中的水很快就会变得很热,将极大地减少水泵的效率,且会 将抽出的溶剂挥散出来,很不好!国产的旋转薄膜配的垫圈很烂,全不耐氯 仿等有机溶剂,当用国产的旋转薄膜蒸过氯仿等有机溶剂,垫圈就废了.所 以要多预备几个垫圈.
问：那上样体积与柱体积最小的比是多少？我用 100 克的填料，如果 样品不好溶，那一次最多能上多少毫升的样呢？
1 在分离过程中遇到要分离的样品量很大,而柱层填料相对较少的情 况是很多的.一般解决的途径有两条: 1） 将样品一次全上柱,这样分离效果一定不会好,但我们的侧略是将样品 交叠的部分再上一遍或几遍,这叫反复 xxxx 柱层，好处是工作量小（对比 下面就知道了），在前后较纯的馏分，如果目标组分量足够，可就乐去吧。 2 ） 将样品分几次分别分离，这样每次分离的效果一定比将样品一次全上 柱的分离效果好，但这样有一个很大的弊病，就是每次柱层的条件不可能 保持完全一至，这样几次柱层分离的馏分间的重现性就存在很大问题，再 将几个分开上的柱层馏分合并的过程中，合的太粗，就如同 将样品一次全 上柱的合并结果，只是工作量增大了。如果心中不甘，你中有我我中有你 的馏分，我也不知怎么合并了。
2 "我用甲醇洗脱,而且仍然和没上柱之前差不多",说明你的样品组分 之间分子大小差别不大,所以 Sephadex LH20 的凝胶过滤作用不起作用了, 如果你还用 Sephadex LH20 分离,那你应该利用他反相分配的作用,即先用 低浓度的甲醇/水,逐渐提高甲醇比例,最后才用甲醇洗脱。
1 XX 提到用少量的甲醇/水-甲醇洗脱，但洗出的流份比较难处理,是指 甲醇水难蒸干吗?其实这根本不应成为问题。XX 请想一想,做植化的,哪有遇 不到甲醇水的时候, ODS 柱层用甲醇水洗脱, Sephadex LH20 柱层用甲醇水 洗脱,D101 用乙醇水洗脱, HP20 用甲醇水洗脱, 高效液相最常用的是反相, 流动相还是甲醇水,可见甲醇水是植化同志最亲密的朋友! 所以蒸不干也 要蒸,想想办法吗!
2 100g 填料已不少了，样品如果实在太多，就只好分开上柱了. 3 一般 Sephadex LH20 上样体积具体也没有明确的规定，在柱床体积 的 1／10 吧。
问：分得效果不是很好，上了有 8 毫升的样，我用甲醇洗脱，结果用 约一个保留体积就洗完了，东西不仅越分越少，而且仍然和没上柱之前差 不多，很让人困惑，郁闷。
样品的溶解最好与洗脱的起使浓度相同，但有时（其实是多数情况下）， 都办不到。对 Sephadex LH20 上样样品的要求是：
1 样品一定要溶解（Sephadex LH20 很贵，要保护填料，我看植化的同 志对好填料看得都很重，职业问题，哈哈哈；同时，避免样品不溶解造成 的脱尾）
2 溶解样品的体积尽可能小（色谱分离理论的基本要求，减小原始谱带 宽度）
流动相的常用溶剂为：水 甲醇 丙酮 乙酸乙酯 二氯甲烷
上述溶剂的极性依次降低，对带有极性的被分离物而言，保留值和分离度 依次递增；同理选用的凝胶柱高可依次降低，流速可以增大（或上样量可 以增加，树脂体积在低极性溶剂中明显收缩）。
溶剂的溶解性，极性，沸点，毒性都是要考虑到的。 二氯甲烷通常对被分离物质间的极性和碱性差异比较小时采用。甲醇通 常对带环状（包括苯环）物质分离采用，葡聚糖凝胶对环状物质有强烈吸 附。 LH-20 同时具备亲水和亲脂双重性质，且被分离物质的极性在分离过程 中起着重要作用。
4. 葡聚糖凝胶 LH-20 的步骤。 （1） 选择条件：
梯度洗脱在葡聚糖凝胶 LH-20 使用中并不象在正相柱层析中那么 重要。首先你的样品须要能溶解在尽量少量的洗脱剂中。极性大的 用甲醇水系统;极性小者一般用不含水的系统。我们实验室常用正己 烷二氯甲烷甲醇系统，用了很多年，效果较好。 （2） 饱和层析柱：
使用方法：将干粉浸泡于 60—70％乙醇中过夜（充分搅拌），洗去可 能存在的残留物，抽干然后湿态不间隙装柱，绝对不能出现凝胶断层（否 则要重新装柱），动态用一倍柱体积的 60—70％乙醇淋洗，再用水洗净乙 醇即根据自己选用洗脱液平衡层析柱至少两个柱体积直到基线变得平稳为
止，如改变溶剂应该注意凝胶在新溶剂中的溶胀性质，并根据性质确定柱 高.如使用相同的溶剂，在以后的层析中柱平衡可以省略。
2) 冷凝液一般使用水,如果配一台冷阱,使用半量的水配比上办量的 汽车冷冻液, 效果棒极了
3) 提高蒸发温度当然可以提高蒸发的效率,但可能发生物质的变化, 国产旋转薄膜,水泵,用水冷,当然就只好提高蒸发温度了。我用东京理化的 旋转薄膜,1/2 汽车冷冻液冷凝,隔膜泵,蒸水不到 45 度,很爽!
3 向要蒸的水溶液中加甲醇,使甲醇占到 30%,蒸出速度将大大提高! Sephadex LH20 柱子被弄脏了，大多数情况下是由于样品没滤, 将柱头堵住, 或由于样品的死吸附(一般很少发生),使柱子的柱头部分污染,一般的处理 是将被污染的柱头部分的填料弃去,具体做法很简单,只将被污染的柱头部 分的填料用玻棒轻轻搅起,倒掉即可,
问：在不同的溶剂中的吸涨程度是不是不同? 那进行梯度洗脱会不会有影响.还有是不是样品的溶解是不是要与洗脱的 起使浓度相同? 如何确定样品在最佳配比的容液中溶呢? 还有分到什么程度是用 Sephadex LH20 比较好?
解答如下: 1 "在不同的溶剂中的吸涨程度是不是不同?那进行梯度洗脱会不会有影 响."
Sephadex LH-20 适合用于有机溶剂分离嗜脂性分子，天然产物在有机 溶剂中的纯化。可以非常经济的大规模制备各种天然产物，尤其在中药有 效成分提取中作为大孔吸附树脂解析物的纯化。
结合凝胶过滤﹑分配色谱及吸附层析于一身，能分离结构相近的分子。 因此使用中要考略几种色谱的作用机制。
最高载量可达 250mg 样品/ml 凝胶﹑极少需要再生﹑使用得当，分离效 果可保持不变。上样量视被分离物的结构性能的差异而定：差异大，则大； 差异小，则小。凝胶过滤的上样量一般为 5－7％的床体积，我们建议初次 上样量控制在 1－2％的床体积，视分离情况可以逐步增加；柱高的选择也 与分离要求相关――难分物质要有一定柱高和流速控制；流动相可参考 TLC 的条件，正确的流动相可以提高分离度并缩短分离时间。
1. 葡聚糖凝胶 LH-20 的原理。
葡聚糖凝胶 LH-20 的分离原理主要有两方面：以凝胶过滤作用为主， 兼具反相分配的作用（在反相溶剂中）。因为凝胶过滤作用，所以大分子 的化合物保留弱，先被洗脱下来，小分子的化合物保留强，最后出柱。
如果使用反相溶剂洗脱， Sephadex LH-20 对化合物ห้องสมุดไป่ตู้起反相分配的 作用，所以极性大的化合物保留弱，先被洗脱下来，极性小的化合物保留 强，后出柱。
如果使用正相溶剂洗脱，这主要靠凝胶过滤作用来分离。
2. 葡聚糖凝胶 LH-20 洗脱溶剂。
葡聚糖凝胶 LH-20 洗脱溶剂分为两类：反相和正相两种。 用得最多的是反相溶剂洗脱，以甲醇－－水系统最为常见，先用水，逐 渐增加甲醇比例，最后用 100％甲醇冲柱。 正相系统以氯仿－－甲醇最为常见，先用 50％氯仿－－甲醇，逐渐增 加甲醇比例，最后用 100％甲醇冲柱。
Sephadex LH20 使用心得谈：
分离的技巧，最后说说我的使用心得 （1） 流速不可太快，切切不可新急，所谓欲速则不达。 （2）柱子尽可能长， Sephadex LH20 柱长的增加将极大地改善分离，所 不要吝惜填料，宁可将填料全装在一根大柱子中，不要将填料装成几根小 柱。所谓集中优势兵力，打击敌人。 （3） 馏分一定要接的细，可 1／10，或 1／20 个保留体积接成一馏分。 （4） 洗脱体积一般为 2-3 个保留体积，对特殊保留强的化合物，可洗脱 5 个保留体积。 （5）鞣质成分死吸附严重，如不在乎填料者，可用 Sephadex LH20 分鞣质。 （6）Sephadex LH20 对黄酮类成分的分离效果极佳，方法很成型，有大量 文献参考。 （7）填料反复使用，每次用完，一般可用甲醇将柱子洗干净，然后用下一 次分离的起步溶剂将甲醇替换出来，待用
葡聚糖凝胶 Sephadex LH-20 使用说明
Sephadex G 型葡聚糖凝胶只适合在水中使用，Sephadex G-25 羟丙化 后就是 Sephadex LH-20。此君既有分子筛作用，在由极性与非极性溶剂组 成的溶剂中还有反相层析效果。虽然价位很高，但由性能颇佳，可再生利 用，所以倍受钦睐。此外上柱样品损失很少，对处理小样品较好，这也是 我们实验室常用的原因之一。
了 1g 干态的,Sephadex LH20 对不同溶剂中的保留体积： water 2.1ml MeOH 1.9ml EtOH 1.8ml CHCl3 1.6ml n-BuOH 1.6ml 丙酮 0.8ml 乙酸乙酯 0.4ml 甲苯 0.2ml
2 "还有是不是样品的溶解是不是要与洗脱的起使浓度相同?如何确定样品 在最佳配比的容液中溶呢?"
3 样品的溶解最好与洗脱的起使浓度相同（若样品的溶解溶剂比洗脱的 起使浓度洗脱能力强，则会人为增加洗脱起使溶剂的洗脱能力；同时若样 品的溶解溶剂与洗脱的起始溶剂差别很大，样品可能因为溶解性的问题而 析出。）
以上三点是上样的基本要求，有时很难求全，只有根据具体的实际来决 定了。一般我的做法是满足 1，2 点，尽量满足第三点，“如果样品极性大， 这选用反相溶剂洗脱（甲醇－－水），样品用最少体积的甲醇－－水（尽 可能甲醇少一些）溶解”，请注意我的陈述“尽可能”，
当然有影响,Sephadex LH20 在不同的溶剂中的吸涨程度是不同的(任何 填料都是这样,只是 Sephadex LH20 很明显),一般在丙酮，乙酸乙酯 中收 缩很厉害,所以一般不用丙酮，乙酸乙酯 作溶剂,如果前后使用的两种洗脱 溶剂对 Sephadex LH20 的吸涨程度相差很大,还会产生大量气泡.以下列举
不要着急,实验是一点一点做出来的,刚开始总是困难的.首先我要说 的是 Sephadex LH20 不是万能的,你的样品不一定适于用它分离,
1 "结果用约一个保留体积就洗完了",这很正常,这也是 Sephadex LH20 这种填料的特点:"洗脱体积一般为 2-3 个保留体积，对特殊保留强的化合 物，可洗脱 5 个保留体积",
3. 样品的处理和洗脱溶剂的选择。
如果样品极性大，选用反相溶剂洗脱（甲醇－－水），样品用最少体积 的甲醇－－水（尽可能甲醇少一些）溶解，过滤后，湿法上样（必须要进 行过滤！否则把 Sephadex LH-20 堵塞，就必须将 Sephadex LH-20 的柱头 部分弃去，造成不必要的浪费）。
如果样品极性小，这选用正相溶剂洗脱（氯仿－－甲醇），样品用最少 体积的氯仿－－甲醇溶解，过滤后，湿法上样。
3 "还有分到什么程度是用 Sephadex LH20 比较好?"
如果实验室 Sephadex LH20 很珍贵，分道较纯再用， 如果实验室 Sephadex LH20 很普及，只要满足使用的注意事项，较粗的样品可直接使用 Sephadex LH20 分离。日本的师兄都是用 Sephadex LH20 粗分，人家有钱， 所以不在乎。如果硅胶比 Sephadex LH20 还贵，你一定先用 Sephadex LH20 粗分，再用硅胶吧。有很多问题根本不是学术本身的问题，人也不可能在 真空中搞科研。哈哈，跑题了。