各种葡聚糖凝胶的分离范围及用途
葡聚糖凝胶 Sephadex LH20 使用说明及使用心得
问：分得效果不是很好，上了有 8 毫升的样，我用甲醇洗脱，结果用 约一个保留体积就洗完了，东西不仅越分越少，而且仍然和没上柱之前差 不多，很让人困惑，郁闷。
了 1g 干态的,Sephadex LH20 对不同溶剂中的保留体积： water 2.1ml MeOH 1.9ml EtOH 1.8ml CHCl3 1.6ml n-BuOH 1.6ml 丙酮 0.8ml 乙酸乙酯 0.4ml 甲苯 0.2ml
2 "还有是不是样品的溶解是不是要与洗脱的起使浓度相同?如何确定样品 在最佳配比的容液中溶呢?"
不要着急,实验是一点一点做出来的,刚开始总是困难的.首先我要说 的是 Sephadex LH20 不是万能的,你的样品不一定适于用它分离,
1 "结果用约一个保留体积就洗完了",这很正常,这也是 Sephadex LH20 这种填料的特点:"洗脱体积一般为 2-3 个保留体积，对特殊保留强的化合 物，可洗脱 5 个保留体积",
3. 样品的处理和洗脱溶剂的选择。
如果样品极性大，选用反相溶剂洗脱（甲醇－－水），样品用最少体积 的甲醇－－水（尽可能甲醇少一些）溶解，过滤后，湿法上样（必须要进 行过滤！否则把 Sephadex LH-20 堵塞，就必须将 Sephadex LH-20 的柱头 部分弃去，造成不必要的浪费）。
如果样品极性小，这选用正相溶剂洗脱（氯仿－－甲醇），样品用最少 体积的氯仿－－甲醇溶解，过滤后，湿法上样。
当然有影响,Sephadex LH20 在不同的溶剂中的吸涨程度是不同的(任何 填料都是这样,只是 Sephadex LH20 很明显),一般在丙酮，乙酸乙酯 中收 缩很厉害,所以一般不用丙酮，乙酸乙酯 作溶剂,如果前后使用的两种洗脱 溶剂对 Sephadex LH20 的吸涨程度相差很大,还会产生大量气泡.以下列举
sephadex知识剖析
【操作步骤】
（1）A-50经酸碱处理，平衡至中性后，浸泡于0.1mol/L， pH7.4 PB中，置4℃冰箱储存备用。 （2）装柱：同DE52。 （3）平衡：松开出水口螺旋夹，以PB平衡，控制流速为 15滴/min，• 待洗脱液与流出液之pH值达到一致时，停止 平衡。 （4）加样、洗脱、收集与浓缩：基本上同DE52，以 0.1mol/L PB洗脱。 用过的DEAE-Sephadex A-50可用0.5mol/L Na2HPO4洗 脱回收。洗至流出液中无蛋白（OD280nm<0.04）后再用 蒸馏水洗至中性，加入0.02％叠氮钠于4℃保存备用。
Sephadex系统知识
葡聚糖凝胶、琼脂糖凝胶系列是当今生物大 分子分离、提取、纯化的重要分离材料， 按性能分包括 凝胶过滤、 离子交换、 疏水层析、 亲和层析，
主要用于蛋白质、核酸、多肽、多糖、酶的脱盐 与分离纯化中。 葡聚糖凝胶为葡聚糖和环氧氯丙烷交联而成的 珠状产品，化学性能稳定，在潮湿、中型ph、高 压120度，灭菌30min情况下，不影响色谱性能， 适用于柱色谱操作。用于蛋白质脱盐及不同分子 量蛋白在凝胶分离范围内的分离纯化，可在酶、 多糖、核酸和其它生物大分子的纯化中广泛应用。
葡聚糖凝胶LH
用途：分离水不溶物质。 葡聚糖凝胶LH-20/Sephadex LH-20 分离中 等大小生物分子，球蛋白分离范围100～ 4000 葡聚糖凝胶LH-60/Sephadex LH-60 分离 100～20000
葡聚糖凝胶C阳离子交换剂，吸附碱 性蛋白：
羧甲基葡聚糖凝胶C-25/CM葡聚糖凝胶C-25/CM Sephades C-25 应用：MW＞20000；载量4-5mmol/g 羧甲基葡聚凝胶C-50/CM葡聚糖凝胶C-50/CM Sephades C-50 应用：中等大小生物分子（30－200KD）；载量45mmol/g SP葡聚糖凝胶C-25/SP Sephades C-25 应用：MW>200 KD；载量：2.0-2.6mmol/g SP葡聚糖凝胶C-50/SP Sephades C-50 应用：中等大小 生物分子（30－200KD）；载量：2.0-2.6mmol/g
葡聚糖凝胶层析
凝胶类型:葡聚糖凝胶(Sephadex)和琼 脂糖凝胶(Sepharose). 葡聚糖凝胶:直链的葡聚糖分子和交联剂 3—氯1,2—环氧丙烷交联而成.
葡聚糖凝胶G—25作为固定相载体,来分离 蓝色葡聚糖—2000和溴酚蓝.蓝色葡聚 糖—2000分子量接近2×106, 而溴酚蓝分 子量为670,二者分子量相差较大,前者完 全排阻,而后者则可完全进入凝胶颗粒网 孔内,二者通过层析柱的时间不同而分开.
3.加样品:打开螺旋夹使柱面上的洗脱液流出, 直至床面与液面刚好平齐为止,关闭下端出口. 取溴酚蓝及蓝色葡聚糖—2000混合液0.3毫升,小 心地加于凝胶表面上,切勿搅动层析柱床表面. 打开下端出口,使样品溶液进入凝胶内,并开始 收集流出液.当样品溶液恰好流至与凝胶表面平 齐时,关闭下端出口.用少量洗脱液清洗层析柱 加样区,共洗涤三次,每次清洗液应完全进入凝 胶柱内后,再进行下一次洗涤.最后在凝胶表面 上加入洗脱液,保持高度为3—4cm.
葡聚糖凝胶层析
实验目的
【实验目的】 实验目的】 1.掌握葡聚糖凝胶的特性及凝胶层析的原理.
2.学习葡聚糖凝胶层析的基本操作技术.
葡聚糖凝胶层析原理
凝胶过滤层析也称分子筛层析,排阻层析. 是利用具有网状结构的凝胶的分子筛作用, 根据被分离物质的分子大小不同来进行分 离
凝胶层析: 凝胶层析:
实验材料
1.实验器材:层析柱(1×20cm)附有一小 实验器材: 实验器材 段乳胶管及螺旋夹;洗脱液瓶(带下口的 三角瓶,250m1);试管及试管架;量筒 10m1;721型分光光度计 2.实验试剂 实验试剂
(1)Tris—醋酸缓冲液(pH7.0): (2)溴酚蓝与葡聚糖—2000 混合样品. (3)葡聚糖凝胶G-25 (Sephadex-G-25)
凝胶的种类及性质
凝胶的种类及性质（一）交联葡聚糖凝胶（Sephadex）⑴SephadexG交联葡聚糖的商品名为Sephndex，不同规格型号的葡聚糖用英文字母G表示，G后面的阿拉伯数为凝胶得水值的10倍。
例如，G-25为每克凝胶膨胀时吸水2.5克，同样G-200克每克千胶吸水20克。
交联葡聚糖凝胶的种类有G-10，G-15，G-25，G-50，G-75，G-100，G-150，和G-200。
因此，“G”反映，凝胶的交联程度，膨胀程度及分部范围。
⑵SephadexLH-20，是─Sephadex G-25的羧丙基衍生物，能溶于水及亲脂溶剂，用于分离不溶于水的物质。
（二）琼脂糖凝胶：商品名很多，常见的有，Sepharose（瑞典，pharmacia），Bio-Gel-A（美国Bio-Rad）等。
琼脂糖凝胶是依靠糖链之间的次级链如氢键来维持网状结构，网状结构的疏密依靠琼脂糖的浓度。
一般情况下，它的结构是稳定的，可以在许多条件下使用（如水，pH4-9范围内的盐溶液）。
琼脂糖凝胶在40℃以上开始融化，也不能高压消毒，可用化学灭菌活处理。
（三）聚丙烯酰胺凝胶：是一种人工合成凝胶，是以丙烯酰胺为单位，由甲叉双丙烯酰胺交联成的，经干燥粉碎或加工成形制成粒状，控制交联剂的用量可制成各种型号的凝胶。
交联剂越多，孔隙越小。
聚丙烯酰胺凝胶的商品为生物胶－P（Bio-GelP），由美国Bio-Rod厂生产，型号很多，从P-2至P-300共10种，P后面的数字再乘1000就相当于该凝胶的排阻限度。
（四）聚苯乙烯凝胶商品为Styrogel，具有大网孔结构，可用于分离分子量1600到40，000，000的生物大分子，适用于有机多聚物，分子量测定和脂溶性天然物的分级，凝胶机械强度好，洗脱剂可用甲基亚砜。
三、实验技术（一）层析柱层析柱是凝胶层析技术中的主体，一般用玻璃管或有机玻璃管。
层析柱的直径大小不影响分离度，样品用量大，可加大柱的直径，一般制备用凝胶柱，直径大于2厘米，但在加样时应将样品均匀分布于凝胶柱床面上。
葡聚糖凝胶操作方法
【实验目的】1.掌握葡聚糖凝胶的特性及凝胶层析的原理。
2．学习葡聚糖凝胶层析的基本操作技术。
【实验原理】凝胶层析又称分子排阻层析或凝胶过滤，是以被分离物质的分子量差异为基础的一种层析分离技术，这一技术为纯化蛋白质等生物大分子提供了一种非常温和的分离方法。
层析的固定相载体是凝胶颗粒，目前应用较广的是：具有各种孔径范围的葡聚糖凝胶（Sephadex）和琼脂糖凝胶（Sepharose）。
葡聚糖凝胶是由直链的葡聚糖分子和交联剂3—氯1，2—环氧丙烷交联而成的具有多孔网状结构的高分子化合物。
凝胶颗粒中网孔的大小可通过调节葡聚糖和交联剂的比例来控制，交联度越大，网孔结构越紧密；交联度越小，网孔结构就越疏松，网孔的大小决定了被分离物质能够自由出入凝胶内部的分子量范围。
可分离的分子量范围从几百到几十万不等。
葡聚糖凝胶层析，是使待分离物质通过葡聚糖凝胶层析柱，各个组分由于分子量不相同，在凝胶柱上受到的阻滞作用不同，而在层析柱中以不同的速度移动。
分子量大于允许进入凝胶网孔范围的物质完全被凝胶排阻，不能进入凝胶颗粒内部，阻滞作用小，随着溶剂在凝胶颗粒之间流动，因此流程短，而先流出层析柱；分子量小的物质可完全进入凝胶颗粒的网孔内，阻滞作用大，流程延长，而最后从层析柱中流出。
若被分离物的分子量介于完全排阻和完全进入网孔物质的分子量之间，则在两者之间从柱中流出，由此就可以达到分离目的。
本实验以葡聚糖凝胶G—25作为固定相载体，来分离蓝色葡聚糖—2000和溴酚蓝。
蓝色葡聚糖—2000分子量接近2×106，而溴酚蓝分子量为670，二者分子量相差较大，前者完全排阻，而后者则可完全进入凝胶颗粒网孔内，二者通过层析柱的时间不同而分开。
【实验材料】1.实验器材层析柱(1×20cm)附有一小段乳胶管及螺旋夹；洗脱液瓶(带下口的三角瓶，250m1)；试管及试管架；量筒10m1；721型分光光度计2.实验试剂(1) Tris—醋酸缓冲液(pH7.0):取0.0lmol/L Tris溶液(含0.1mol/L KCl)900ml，用浓醋酸调pH至7.0，加蒸馏水至1000m1。
葡聚糖分离范围
凝胶过滤填料的分离范围表SephadexG-10葡聚糖凝胶G-10 分离范围<700 适用于脱盐、肽与其它小分子的分离Sephadex G-15 葡聚糖凝胶G-15 分离范围<1500 适用于脱盐、肽与其它小分子的分离Sephadex G-15 葡聚糖凝胶G-15 分离范围<1500 适用于脱盐、肽与其它小分子的分离Sepharose 6B 琼脂糖凝胶6B 分离范围：1000-5000，适用于脱盐、肽与其它小分子的分离ConA-Sepharose ConA琼脂糖凝胶分离范围：1000-5000，适用于脱盐、肽与其它小分子的分离Sephadex G-25 Medium 葡聚糖凝胶G-25 中分离范围1000-5000 适用于脱盐、肽与其它小分子的分离Sephadex G-25 Medium 葡聚糖凝胶G-25 中分离范围1000-5000 适用于脱盐、肽与其它小分子的分离Sephadex G-25 Fine 葡聚糖凝胶G-25 细分离范围1000-5000 适用于脱盐、肽与其它小分子的分离Sephadex G-25 Fine 葡聚糖凝胶G-25 细分离范围1000-5000 适用于脱盐、肽与其它小分子的分离SephadexG-50 Medium 葡聚糖凝胶G-50 中分离范围1500-30000Sephadex G-50 Medium 葡聚糖凝胶G-50 中分离范围1500-30000Sephadex G-75 葡聚糖凝胶G-75 分离范围3000-80000 Sephadex G-75 葡聚糖凝胶G-75 分离范围3000-80000 DEAE Sepharose FF DEAE琼脂糖凝胶FF 分离范围：3000-80,000Sephadex G-100 葡聚糖凝胶G-100 分离范围4000-150000Sephadex G-100 葡聚糖凝胶G-100 分离范围4000-150000Sephadex G-150 葡聚糖凝胶G-150 分离范围5000-300000DEAE Sepharose CI-6B 琼脂糖凝胶CI-6B 分离范围：5000-300,000Sephadex G-150 葡聚糖凝胶G-150 分离范围5000-300000Sephadex G-200 葡聚糖凝胶G-200 分离范围5000-600000Sephadex G-200 葡聚糖凝胶G-200 分离范围5000-600000Sephadex G-200 葡聚糖凝胶G-200 分离范围5000-600000DEAE Sephadex A-25 DEAE葡聚糖凝胶A-25 颗粒大小：40-120μm 分离大小：小蛋白及巨大分子DEAE Sephadex A-25 DEAE葡聚糖凝胶A-25 颗粒大小：40-120μm 分离大小：小蛋白及巨大分子DEAE Sephades A-50 DEAE DEAE葡聚糖凝胶A-50 颗粒大小：40-120μm，分离范围：小蛋白及巨大分子做纯化的人可能经常接触到sephadex，BIO-Gel，sephacryl s-,sepharos e BIo-Gel等几种填料，有时会混淆在一起，看到一个贴子较好的介绍了这些填料的区别，希望对大家有用。
凝胶的种类及性质
凝胶的种类及性质（一）交联葡聚糖凝胶（Sephadex）⑴Sephadex G交联葡聚糖的商品名为Sephndex，不同规格型号的葡聚糖用英文字母G表示，G后面的阿拉伯数为凝胶得水值的10倍。
例如，G-25为每克凝胶膨胀时吸水2.5克，同样G-200克每克千胶吸水20克。
交联葡聚糖凝胶的种类有G-10，G-15，G-25，G-50，G-75，G-100，G-150，和G-200。
因此，“G”反映，凝胶的交联程度，膨胀程度及分部范围。
⑵Sephadex LH-20，是─Sephadex G-25的羧丙基衍生物，能溶于水及亲脂溶剂，用于分离不溶于水的物质。
（二）琼脂糖凝胶：商品名很多，常见的有，Sepharose（瑞典，pharmacia ），Bio-Gel-A（美国Bio-Rad）等。
琼脂糖凝胶是依靠糖链之间的次级链如氢键来维持网状结构，网状结构的疏密依靠琼脂糖的浓度。
一般情况下，它的结构是稳定的，可以在许多条件下使用（如水，pH4-9范围内的盐溶液）。
琼脂糖凝胶在40℃以上开始融化，也不能高压消毒，可用化学灭菌活处理。
（三）聚丙烯酰胺凝胶：是一种人工合成凝胶，是以丙烯酰胺为单位，由甲叉双丙烯酰胺交联成的，经干燥粉碎或加工成形制成粒状，控制交联剂的用量可制成各种型号的凝胶。
交联剂越多，孔隙越小。
聚丙烯酰胺凝胶的商品为生物胶－P （Bio-Gel P），由美国Bio-Rod厂生产，型号很多，从P-2至P-300共10种，P 后面的数字再乘1000就相当于该凝胶的排阻限度。
（四）聚苯乙烯凝胶商品为Styrogel ，具有大网孔结构，可用于分离分子量1600到40，000，000的生物大分子，适用于有机多聚物，分子量测定和脂溶性天然物的分级，凝胶机械强度好，洗脱剂可用甲基亚砜。
三、实验技术（一）层析柱层析柱是凝胶层析技术中的主体，一般用玻璃管或有机玻璃管。
层析柱的直径大小不影响分离度，样品用量大，可加大柱的直径，一般制备用凝胶柱，直径大于2厘米，但在加样时应将样品均匀分布于凝胶柱床面上。
凝胶的种类及性质
凝胶的种类及性质（一）交联葡聚糖凝胶（Sephadex）⑴Sephadex G交联葡聚糖的商品名为Sephndex，不同规格型号的葡聚糖用英文字母G表示，G后面的阿拉伯数为凝胶得水值的10倍。
例如，G-25为每克凝胶膨胀时吸水2.5克，同样G-200克每克千胶吸水20克。
交联葡聚糖凝胶的种类有G-10，G-15，G-25，G-50，G-75，G-100，G-150，和G-200。
因此，“G”反映，凝胶的交联程度，膨胀程度及分部范围。
⑵Sephadex LH-20，是─Sephadex G-25的羧丙基衍生物，能溶于水及亲脂溶剂，用于分离不溶于水的物质。
（二）琼脂糖凝胶：商品名很多，常见的有，Sepharose（瑞典，pharmacia ），Bio-Gel-A（美国Bio-Rad）等。
琼脂糖凝胶是依靠糖链之间的次级链如氢键来维持网状结构，网状结构的疏密依靠琼脂糖的浓度。
一般情况下，它的结构是稳定的，可以在许多条件下使用（如水，pH4-9范围内的盐溶液）。
琼脂糖凝胶在40℃以上开始融化，也不能高压消毒，可用化学灭菌活处理。
（三）聚丙烯酰胺凝胶：是一种人工合成凝胶，是以丙烯酰胺为单位，由甲叉双丙烯酰胺交联成的，经干燥粉碎或加工成形制成粒状，控制交联剂的用量可制成各种型号的凝胶。
交联剂越多，孔隙越小。
聚丙烯酰胺凝胶的商品为生物胶－P （Bio-Gel P），由美国Bio-Rod厂生产，型号很多，从P-2至P-300共10种，P 后面的数字再乘1000就相当于该凝胶的排阻限度。
（四）聚苯乙烯凝胶商品为Styrogel ，具有大网孔结构，可用于分离分子量1600到40，000，000的生物大分子，适用于有机多聚物，分子量测定和脂溶性天然物的分级，凝胶机械强度好，洗脱剂可用甲基亚砜。
三、实验技术（一）层析柱层析柱是凝胶层析技术中的主体，一般用玻璃管或有机玻璃管。
层析柱的直径大小不影响分离度，样品用量大，可加大柱的直径，一般制备用凝胶柱，直径大于2厘米，但在加样时应将样品均匀分布于凝胶柱床面上。
凝胶的种类及性质
凝胶的种类及性质（一）交联葡聚糖凝胶（Sephadex）⑴Sephadex G交联葡聚糖的商品名为Sephndex，不同规格型号的葡聚糖用英文字母G表示，G后面的阿拉伯数为凝胶得水值的10倍。
例如，G-25为每克凝胶膨胀时吸水克，同样G-200克每克千胶吸水20克。
交联葡聚糖凝胶的种类有G-10，G-15，G-25，G-50，G-75，G-100，G-150，和G-200。
因此，“G”反映，凝胶的交联程度，膨胀程度及分部范围。
⑵Sephadex LH-20，是─Sephadex G-25的羧丙基衍生物，能溶于水及亲脂溶剂，用于分离不溶于水的物质。
（二）琼脂糖凝胶：商品名很多，常见的有，Sepharose（瑞典，pharmacia ），Bio-Gel-A（美国Bio-Rad）等。
琼脂糖凝胶是依靠糖链之间的次级链如氢键来维持网状结构，网状结构的疏密依靠琼脂糖的浓度。
一般情况下，它的结构是稳定的，可以在许多条件下使用（如水，pH4-9范围内的盐溶液）。
琼脂糖凝胶在40℃以上开始融化，也不能高压消毒，可用化学灭菌活处理。
（三）聚丙烯酰胺凝胶：是一种人工合成凝胶，是以丙烯酰胺为单位，由甲叉双丙烯酰胺交联成的，经干燥粉碎或加工成形制成粒状，控制交联剂的用量可制成各种型号的凝胶。
交联剂越多，孔隙越小。
聚丙烯酰胺凝胶的商品为生物胶－P （Bio-Gel P），由美国Bio-Rod厂生产，型号很多，从P-2至P-300共10种，P 后面的数字再乘1000就相当于该凝胶的排阻限度。
（四）聚苯乙烯凝胶商品为Styrogel ，具有大网孔结构，可用于分离分子量1600到40，000，000的生物大分子，适用于有机多聚物，分子量测定和脂溶性天然物的分级，凝胶机械强度好，洗脱剂可用甲基亚砜。
三、实验技术（一）层析柱层析柱是凝胶层析技术中的主体，一般用玻璃管或有机玻璃管。
层析柱的直径大小不影响分离度，样品用量大，可加大柱的直径，一般制备用凝胶柱，直径大于2厘米，但在加样时应将样品均匀分布于凝胶柱床面上。
凝胶的种类及性质
凝胶的种类及性质（一）交联葡聚糖凝胶（Sephadex）⑴Sephadex G交联葡聚糖的商品名为Sephndex，不同规格型号的葡聚糖用英文字母G表示，G后面的阿拉伯数为凝胶得水值的10倍。
例如，G-25为每克凝胶膨胀时吸水2.5克，同样G-200克每克千胶吸水20克。
交联葡聚糖凝胶的种类有G-10，G-15，G-25，G-50，G-75，G-100，G-150，和G-200。
因此，“G”反映，凝胶的交联程度，膨胀程度及分部范围。
⑵Sephadex LH-20，是─Sephadex G-25的羧丙基衍生物，能溶于水及亲脂溶剂，用于分离不溶于水的物质。
（二）琼脂糖凝胶：商品名很多，常见的有，Sepharose（瑞典，pharmacia ），Bio-Gel-A（美国Bio-Rad）等。
琼脂糖凝胶是依靠糖链之间的次级链如氢键来维持网状结构，网状结构的疏密依靠琼脂糖的浓度。
一般情况下，它的结构是稳定的，可以在许多条件下使用（如水，pH4-9范围内的盐溶液）。
琼脂糖凝胶在40℃以上开始融化，也不能高压消毒，可用化学灭菌活处理。
（三）聚丙烯酰胺凝胶：是一种人工合成凝胶，是以丙烯酰胺为单位，由甲叉双丙烯酰胺交联成的，经干燥粉碎或加工成形制成粒状，控制交联剂的用量可制成各种型号的凝胶。
交联剂越多，孔隙越小。
聚丙烯酰胺凝胶的商品为生物胶－P （Bio-Gel P），由美国Bio-Rod厂生产，型号很多，从P-2至P-300共10种，P 后面的数字再乘1000就相当于该凝胶的排阻限度。
（四）聚苯乙烯凝胶商品为Styrogel ，具有大网孔结构，可用于分离分子量1600到40，000，000的生物大分子，适用于有机多聚物，分子量测定和脂溶性天然物的分级，凝胶机械强度好，洗脱剂可用甲基亚砜。
三、实验技术（一）层析柱层析柱是凝胶层析技术中的主体，一般用玻璃管或有机玻璃管。
层析柱的直径大小不影响分离度，样品用量大，可加大柱的直径，一般制备用凝胶柱，直径大于2厘米，但在加样时应将样品均匀分布于凝胶柱床面上。
葡聚糖凝胶柱层析
THANKS FOR WATCHING
感谢您的观看
外。
亲水性
葡聚糖凝胶是一种亲水性凝胶，在 水中能够膨胀并保持稳定的结构。
分子筛作用
由于凝胶的网孔大小不同，不同大 小的分子在通过凝胶柱时的路径和 速度也不同，从而实现分子的分离。
柱层析分离原理
吸附与解吸
样品中的各组分在葡聚糖凝胶上 的吸附能力不同，通过选择合适 的洗脱液，可以实现各组分的分
离。
分子筛效应
4. 上样
5. 洗脱与收集
将待分离样品溶解在少量洗脱液中，沿柱 内壁缓慢加入，避免冲击凝胶表面。
开启恒流泵，以恒定流速进行洗脱，同时 用收集器按一定时间或体积收集流出液。
6. 检测与记录
7. 结果分析
对收集到的流出液进行适当稀释后，利用 紫外可见分光光度计或酶标仪等检测目标 物质的含量，并记录数据。
优点
分辨率高，操作简便，重 复性好，对样品的适用范 围广。
缺点
对于某些非水溶性物质或 极端条件下的分离效果不 佳，且分离过程中可能存 在吸附损失。
02 实验材料与方法
主要试剂与仪器
主要试剂
葡聚糖凝胶（如Sephadex G-25 、G-50、G-100等）、洗脱液（ 一般为缓冲液或盐水）、待分离 样品。
基本原理 • 实验材料与方法 • 葡聚糖凝胶柱层析在生物大分子分离中应
用 • 葡聚糖凝胶柱层析在药物分析中应用 • 葡聚糖凝胶柱层析在环境科学中应用 • 实验结果分析与讨论
01 葡聚糖凝胶柱层析基本原 理
葡聚糖凝胶结构与性质
三维网状结构
葡聚糖凝胶具有三维的交联网状 结构，这种结构允许小分子进入 凝胶内部，而大分子则被排除在
环境污染物检测与去除
实验三葡聚糖凝胶柱层析
25~75
平均90 平均90 60~200 45~165 45~165 60~200
3~11
2~12 2~12 4~9 4~9 4~9
0.2
0.1 0.1 0.004 0.008 0.02 0.005
20~39
300 250 10 11.5 14 15
45~165
45~165
蛋白、多糖
蛋白、多糖
3~13 3~13
分析分离时：Vsample=1-4%Vbed； 制备分离时：Vsample=25-30%VbeБайду номын сангаас. 分 离 体 积 (Vsep): 相 邻 两 组 分 Ve 之 差 ， 用 于衡量相邻两组分的分离效果。
Vsep=Ve1-Ve2 ，
当Vsample<Vsep时，则相邻两组分可完全分离。 相对粘度：样品液粘度与洗脱液粘度的比值。 分离效果只与相对粘度有关，一般来说， 相对粘度不得超过1.5―2。 今天的上样量（0.2ml）约为1%柱床体积。
实验三、葡聚糖凝胶柱层析
1、目的与要求：
1.1、学习凝胶(Gel)层析法的基本原理； 1.2、掌握葡聚糖凝胶（Sephadex）柱层 析的操作技术。
2、凝胶层析法的原理：
凝胶层析是一种液相层析，机理是分子筛 效应。当洗脱开始以后，小分子可进入凝 胶颗粒内部，流程长，流动慢；大分子不 能进入凝胶颗粒内部，流程短，流动快。 这样就可使大小不同的分子分开。
颗粒大 小μm
24~44 24~44 24~44 20~40 20~40 25~75 25~75 25~75
特性/应用
肽类、寡糖、小蛋白等 重组蛋白、细胞色素 单抗、大蛋白 蛋白、肽类、多糖、核酸 蛋白、肽类、寡糖、多糖 肽类、小蛋白 蛋白，如清蛋白 蛋白、抗体 多糖、具延伸结构的大分 子如蛋白多糖、脂质体 巨大分子 巨大分子如重组乙型肝炎表 面抗原 蛋白、大分子复合物、病毒、 不对称分子如核酸和多糖 （蛋白多糖） 蛋白、多糖 蛋白、多糖 蛋白、大分子复合物、病毒 、不对称分子如核酸和多糖 （蛋白多糖）
各种葡聚糖凝胶的分离范围与用途
各种葡聚糖凝胶的分离范围与用途：SephadexG-10葡聚糖凝胶G-10 分离范围<700 适用于脱盐、肽与其它小分子的分离Sephadex G-15葡聚糖凝胶G-15 分离范围<1500 适用于脱盐、肽与其它小分子的分离Sephadex G-15 葡聚糖凝胶G-15 分离范围<1500 适用于脱盐、肽与其它小分子的分离Sepharose 6B 琼脂糖凝胶6B 分离范围：1000-5000，适用于脱盐、肽与其它小分子的分离ConA-Sepharose ConA琼脂糖凝胶分离范围：1000-5000，适用于脱盐、肽与其它小分子的分离Sephadex G-25 Medium 葡聚糖凝胶G-25 中分离范围1000-5000 适用于脱盐、肽与其它小分子的分离Sephadex G-25 Medium 葡聚糖凝胶G-25 中分离范围1000-5000 适用于脱盐、肽与其它小分子的分离Sephadex G-25 Fine 葡聚糖凝胶G-25 细分离范围1000-5000 适用于脱盐、肽与其它小分子的分离Sephadex G-25 Fine 葡聚糖凝胶G-25 细分离范围1000-5000 适用于脱盐、肽与其它小分子的分离SephadexG-50 Medium 葡聚糖凝胶G-50 中分离范围1500-30000Sephadex G-50 Medium 葡聚糖凝胶G-50 中分离范围1500-30000Sephadex G-75 葡聚糖凝胶G-75 分离范围3000-80000Sephadex G-75 葡聚糖凝胶G-75 分离范围3000-80000DEAE Sepharose FF DEAE琼脂糖凝胶FF 分离范围：3000-80,000Sephadex G-100 葡聚糖凝胶G-100 分离范围4000-150000Sephadex G-100 葡聚糖凝胶G-100 分离范围4000-150000Sephadex G-150 葡聚糖凝胶G-150 分离范围5000-300000DEAE Sepharose CI-6B 琼脂糖凝胶CI-6B 分离范围：5000-300,000Sephadex G-150 葡聚糖凝胶G-150 分离范围5000-300000Sephadex G-200 葡聚糖凝胶G-200 分离范围5000-600000Sephadex G-200 葡聚糖凝胶G-200 分离范围5000-600000Sephadex G-200 葡聚糖凝胶G-200 分离范围5000-600000DEAE Sephadex A-25 DEAE葡聚糖凝胶A-25 颗粒大小：40-120μm分离大小：小蛋白及巨大分子DEAE Sephadex A-25 DEAE葡聚糖凝胶A-25 颗粒大小：40-120μm分离大小：小蛋白及巨大分子DEAE Sephades A-50 DEAE DEAE葡聚糖凝胶A-50 颗粒大小：40-120μm，分离范围：小蛋白及巨大分子。
葡聚糖凝胶柱使用及注意事项(包含各种溶剂的溶胀系数)
葡聚糖凝胶柱使用及注意事项1 Sephadex G型葡聚糖凝胶只适合在水中使用，Sephadex G-25羟丙化后就是Sephadex LH-20。
其既有分子筛作用，在由极性与非极性溶剂组成的溶剂中还有反相层析效果。
虽然价位很高，但由于性能颇佳，可再生利用，所以倍受亲睐。
此外上柱样品损失很少，对处理小样品较好，这也是我们实验室常用的原因之一。
2 Sephadex LH20 的原理。
Sephadex LH20的分离原理主要有两方面：以凝胶过滤作用为主，兼具反相分配的作用（在反相溶剂中）。
因为凝胶过滤作用，所以大分子的化合物保留弱，先被洗脱下来，小分子的化合物保留强，最后出柱。
如果使用反相溶剂洗脱，Sephadex LH20对化合物还起反相分配的作用，所以极性大的化合物保留弱，先被洗脱下来，极性小的化合物保留强，后出柱。
如果使用正相溶剂洗脱，这主要靠凝胶过滤作用来分离。
3 Sephadex LH20 洗脱溶剂。
看完第2点后，就应该清楚Sephadex LH20 洗脱溶剂因分为两类：反相和正相两种。
用得最多的是反相溶剂洗脱，以甲醇－－水系统最为常见，先用水，逐渐增加甲醇比例，最后用100％甲醇冲柱。
正相系统以氯仿－－甲醇最为常见，先用50％氯仿－－甲醇，逐渐增加甲醇比例，最后用100％甲醇冲柱。
4 Sephadex LH20 样品的处理和洗脱溶剂的选择。
如果样品极性大，这选用反相溶剂洗脱（甲醇－－水），样品用最少体积的甲醇－－水（尽可能甲醇少一些）溶解，过滤后，湿法上样（一定要滤喔！要是把Sephadex LH20 堵啦，就得将Sephadex LH20 的柱头部分弃去，很心痛呀）。
如果样品极性小，这选用正相溶剂洗脱（氯仿－－甲醇），样品用最少体积的氯仿－－甲醇溶解，过滤后，湿法上样。
5 Sephadex LH-20的步骤。
(1) 选择条件：梯度洗脱在Sephadex使用中并不象在正相柱层析中那么重要。
sephadex g-10葡聚糖凝胶 孔径
1. 概述Sephadex G-10 是一种常用的葡聚糖凝胶，具有广泛的应用范围。
在生物化学、分子生物学等领域中，它被广泛用于分离和纯化生物大分子，例如蛋白质、核酸等。
而Sepahdex G-10的孔径大小则是影响其分离和纯化效果的重要因素之一。
2. Sephadex G-10的基本介绍2.1 Sephadex G-10是一种由交联葡聚糖制成的凝胶，属于凝胶过滤层析介质的一种。
它以其较大的孔径而闻名，这使得它在许多生物大分子的分离过程中具有重要的应用价值。
2.2 Sephadex G-10的结构具有高度规则的孔隙结构，能够可靠地分离分子，并且不易受到外界因素的影响。
2.3 在分子生物学和生物化学的实验中，Sephadex G-10经常被作为一种理想的分离介质，用于分离蛋白质、核酸等大分子物质。
3. Sephadex G-10的孔径大小3.1 Sephadex G-10的孔径大小通常为10微米左右。
这种中等大小的孔径使得它能够有效地分离分子，但也相对于有一定的分辨能力，不会因为孔径过大而导致分离效果不理想。
3.2 对于一些较大的生物大分子，例如大分子蛋白质、核酸等，Sephadex G-10的孔径大小能够保证其能够顺利地通过凝胶中的孔隙，实现有效的分离和纯化。
4. Sephadex G-10的孔径大小对分离效果的影响4.1 由于Sephadex G-10的孔径大小适中，它能够较好地区分不同大小的分子。
对于较小的分子而言，它们能够更容易地穿过Sephadex G-10的孔隙，实现快速的分离。
4.2 对于较大的生物大分子，Sephadex G-10的孔径大小也能够保证其能够通过凝胶的孔隙，实现高效的分离。
这就体现了SephadexG-10的孔径大小对于分离效果的积极影响。
5. 结语Sephadex G-10作为一种常用的葡聚糖凝胶，在分离和纯化生物大分子的过程中具有重要的应用价值。
其孔径大小的适宜性，使得它能够有效地区分不同大小的分子，实现高效的分离和纯化。
实验五葡聚糖凝胶柱层析分离纯化蛋白质
得到较好的分离效果？
Thank You!
装柱时需保持柱体垂直于水平面，不可随意 晃动层析柱，以保持凝胶柱表面平整。
加样时移液器垂直伸入柱内，接近液面处集 中滴加，动作要轻柔，不要将床面冲起。 实验过程中需密切注意保持层析柱中的凝胶 始终处于蒸馏水中，防止蒸馏水排空。
吸附层析(absorption chromatography)
低分子量蛋白、多肽的分离
3,000~70,000 中低分子量蛋白、多肽的分离 4,000 ~150,000 中高分子量蛋白的分离 5,000 ~400,000 高分子量蛋白的分离 5,000 ~800,000
重点1
凝胶层析的原理 分子筛效应
比孔径大的分子不能扩散到孔穴内部， 完全被排阻在孔外，只能在凝胶颗粒外 的空间随流动相向下流动，它们经历的 流程短，流动速度快，首先流出。
亲和力 生物分子间存在很多特异性的相互作用， 如抗原－抗体、酶－底物、激素－受体等， 它们之间都能够专一而可逆的结合。 分离原理 在固定相载体表面偶联具有特殊亲和作用的 配基，这些配基可以与流动相中溶质分子发 生可逆的特异性结合而进行分离纯化。
1. Incubate crude sample with the immobilized ligand
混合物随流动相经固定相(网状孔径)的
层析柱时，混合物中各组份按其分子大
小不同而被分离的技术。
固定相（凝胶）
凝胶是一种不带电的具有三维空间的多孔 网状结构的高分子聚合物，每个颗粒的细 微结构及筛孔的直径均匀一致。
☻葡聚糖凝胶（Sephadex） ☻琼脂糖凝胶（Sepharose）
☻聚丙稀酰胺凝胶（Polyacrylamide）
葡聚糖凝胶柱层析法分离蛋白质
实验五.葡聚糖凝胶层析
实验五. 葡聚糖凝胶层析【实验目的】1.掌握葡聚糖凝胶的特性及凝胶层析的原理。
2．学习葡聚糖凝胶层析的基本操作技术。
【实验原理】凝胶层析又称分子排阻层析或凝胶过滤，是以被分离物质的分子量差异为基础的一种层析分离技术，这一技术为纯化蛋白质等生物大分子提供了一种非常温和的分离方法。
层析的固定相载体是凝胶颗粒，目前应用较广的是：具有各种孔径范围的葡聚糖凝胶（Sephadex）和琼脂糖凝胶（Sepharose）。
葡聚糖凝胶是由直链的葡聚糖分子和交联剂3—氯1，2—环氧丙烷交联而成的具有多孔网状结构的高分子化合物。
凝胶颗粒中网孔的大小可通过调节葡聚糖和交联剂的比例来控制，交联度越大，网孔结构越紧密；交联度越小，网孔结构就越疏松，网孔的大小决定了被分离物质能够自由出入凝胶内部的分子量范围。
可分离的分子量范围从几百到几十万不等。
葡聚糖凝胶层析，是使待分离物质通过葡聚糖凝胶层析柱，各个组分由于分子量不相同，在凝胶柱上受到的阻滞作用不同，而在层析柱中以不同的速度移动。
分子量大于允许进入凝胶网孔范围的物质完全被凝胶排阻，不能进入凝胶颗粒内部，阻滞作用小，随着溶剂在凝胶颗粒之间流动，因此流程短，而先流出层析柱；分子量小的物质可完全进入凝胶颗粒的网孔内，阻滞作用大，流程延长，而最后从层析柱中流出。
若被分离物的分子量介于完全排阻和完全进入网孔物质的分子量之间，则在两者之间从柱中流出，由此就可以达到分离目的。
本实验以葡聚糖凝胶G—25作为固定相载体，来分离蓝色葡聚糖—2000和溴酚蓝。
蓝色葡聚糖—2000分子量接近2×106，而溴酚蓝分子量为670，二者分子量相差较大，前者完全排阻，而后者则可完全进入凝胶颗粒网孔内，二者通过层析柱的时间不同而分开。
【实验材料】1.实验器材层析柱(1×20cm)附有一小段乳胶管及螺旋夹；洗脱液瓶(带下口的三角瓶，250m1)；试管及试管架；量筒10m1；721型分光光度计2.实验试剂(1) Tris—醋酸缓冲液(pH7.0):取0.0lmol/L Tris溶液(含0.1mol/L KCl)900m l，用浓醋酸调pH至7.0，加蒸馏水至1000m1。
葡聚糖凝胶 G-50 Medium 使用说明书
葡聚糖凝胶G-50 Medium使用说明书为确保产品的性能和无忧的操作，使用前请仔细阅读本手册，有任何疑问请咨询本公司售后技术支持或销售人员。
1. 产品介绍葡聚糖凝胶G-50 Medium是一种凝胶过滤层析介质（也叫体积排阻色谱），适用于生物分子的脱盐、缓冲液置换、组群分离、精细纯化。
特点如下：a. 经典的葡聚糖介质，选择性好。
b. 生物大分子（>30kDa）的快速脱盐和缓冲液置换（一步完成）。
c. G-50 Medium，可用于组群分离和杂质的去除（以排阻限30kDa为分界点）。
d. G-50 Fine，可用于小分子蛋白的分离纯化（1.5-30kDa）。
表1：性能参数2.选择2.1 介质级别的选择a. 快速脱盐、缓冲液置换、组群分离和杂质的去除：选择G-50 Medium，粒径大、流速快。
b. 小分子蛋白分离纯化：选择G-50 Fine，粒径小、分辨率高。
2.2 层析柱的选择a. 快速脱盐、缓冲液置换、组群分离和杂质的去除（上样量可达到30%CV）：选择粗短型层析柱（柱床高度低，例如XK 16/20），流速快、周期短。
b. 小分子蛋白分离纯化（上样量为0.5%-4%CV）：选择细长型层析柱（柱床高度高，例如XK 16/70），柱效高、分辨率好。
备注：CV指柱体积。
3. 使用3.1 溶胀取一定量的干粉，加入过量的纯化水（缓冲液：干粉≥20ml：1g），在室温（25℃）溶胀24小时或沸水浴溶胀3小时。
备注：溶胀过程中可进行柔和的搅拌，杜绝使用高速或剧烈的搅拌方式（例如磁力搅拌等）。
3.2 清洗待介质自然沉降后，小心的倒出上清液（包括极少量没有溶胀好的干粉和一些漂浮的小颗粒介质），再加入3-5倍体积的纯化水进行重悬。
重复此步骤5次。
备注：用于清洗产品中残留的微量有机试剂和碱性物质。
3.3 重悬在清洗好的介质中加入一定量的缓冲液（缓冲液:介质=1:3），用玻璃棒或其它搅拌装置柔和搅拌3-5分钟。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
SephadexG-10葡聚糖凝胶 G-10 分离范围<700 适用于脱盐、肽与其它小分子的分离Sephadex G-15 葡聚糖凝胶 G-15 分离范围<1500 适用于脱盐、肽与其它小分子的分离Sephadex G-15 葡聚糖凝胶 G-15 分离范围<1500 适用于脱盐、肽与其它小分子的分离Sepharose 6B 琼脂糖凝胶 6B 分离范围：1000-5000，适用于脱盐、肽与其它小分子的分离ConA-Sepharose ConA琼脂糖凝胶分离范围：1000-5000，适用于脱盐、肽与其它小分子的分离
Sephadex G-25 Medium 葡聚糖凝胶 G-25 中分离范围 1000-5000 适用于脱盐、肽与其它小分子的分离
Sephadex G-25 Medium 葡聚糖凝胶 G-25 中分离范围 1000-5000 适用于脱盐、肽与其它小分子的分离
Sephadex G-25 Fine 葡聚糖凝胶 G-25 细分离范围 1000-5000 适用于脱盐、肽与其它小分子的分离
Sephadex G-25 Fine 葡聚糖凝胶 G-25 细分离范围 1000-5000 适用于脱盐、肽与其它小分子的分离
SephadexG-50 Medium 葡聚糖凝胶 G-50 中分离范围 1500-30000 Sephadex G-50 Medium 葡聚糖凝胶 G-50 中分离范围 1500-30000 Sephadex G-75 葡聚糖凝胶 G-75 分离范围 3000-80000 Sephadex G-75 葡聚糖凝胶 G-75 分离范围 3000-80000
DEAE Sepharose FF DEAE琼脂糖凝胶 FF 分离范围：3000-80000 Sephadex G-100 葡聚糖凝胶G-100 分离范围 4000-150000
Sephadex G-100 葡聚糖凝胶 G-100 分离范围 4000-150000
Sephadex G-150 葡聚糖凝胶 G-150 分离范围 5000-300000
DEAE Sepharose CI-6B 琼脂糖凝胶CI-6B 分离范围：5000-300000 Sephadex G-150 葡聚糖凝胶 G-150 分离范围 5000-300000
Sephadex G-200 葡聚糖凝胶 G-200 分离范围 5000-600000
Sephadex G-200 葡聚糖凝胶 G-200 分离范围 5000-600000
Sephadex G-200 葡聚糖凝胶 G-200 分离范围 5000-600000
DEAE Sephadex A-25 DEAE葡聚糖凝胶 A-25 颗粒大小：40-120μm 分离大小：小蛋白及巨大分子
DEAE Sephadex A-25 DEAE葡聚糖凝胶 A-25 颗粒大小：40-120μm 分离大小：小蛋白及巨大分子
DEAE Sephades A-50 DEAE DEAE葡聚糖凝胶 A-50 颗粒大小：40-120μm，分离范围：小蛋白及巨大分子。