人外周血白细胞DNA提取标准操作规程(SOP)

人外周血白细胞DNA提取标准操作规程(SOP) （血液/组织/细胞基因组提取试剂盒(DP304)）

1实验原理

本法采用血液/组织/细胞基因组提取试剂盒(DP304)，从全血中分离白膜层，去除其中的红细胞及蛋白质，裂解白细胞释放DNA，再通过去除DNA中的杂质使其纯化，得到高纯度的DNA原液，最后使用微量紫外可见分光光度计对DNA 的浓度及纯度进行定量检测。

2实验仪器

EP管

微量移液器，10μL、50μL、200μL、1000μL

涡旋振荡器

数显恒温搅拌循环水箱

吸附柱CB3

收集管

离心机

涡旋振荡器

微量紫外可见分光光度计（Thermo NanoDrop1000）

3实验试剂

正常人混合血液，应避免反复冻融，否则会导致提取的DNA片段较小且提取量下降。

红细胞裂解液（裂解红细胞）

缓冲液GA（轻微裂解作用，为蛋白激酶K提供反应环境），若溶液产生沉淀，使用前应在37℃水浴中预热10min,以溶解沉淀。

蛋白激酶K（裂解蛋白质）

缓冲液GB（裂解白细胞，释放DNA），若溶液产生沉淀，使用前应在37℃水浴中预热10min,以溶解沉淀。

无水乙醇（沉淀DNA，去除杂质）

缓冲液GD（去除蛋白质），使用前应按照试剂瓶标签的说明加入无水乙醇。缓冲液PW（去除盐），使用前应按照试剂瓶标签的说明加入无水乙醇。

洗脱缓冲液TE（保存DNA）

4实验步骤

样品的采集与保存：用装有EDTA的塑料管采集2mL静脉血，2000rpm离心

5min，可见分层，分别为血浆层、白膜层、红细胞，将血浆吸出弃去，再通过点吸的方式将白膜层全部吸出，置于干净的EP管备用。如无法及时提取DNA，则应置于-80℃进行保存。

样品预处理：

裂解红细胞：通过低速涡旋15s混匀样品，取150μL样品置于干净的EP管，加入750μL红细胞裂解液，通过手摇振荡的方式进行颠倒混匀5min，然后10000rpm离心2min，吸去上清，留下白细胞沉淀。

重悬白细胞：加入200μL缓冲液GA，通过手摇振荡的方式进行颠倒混匀

3~5min，使白细胞沉淀重悬。

裂解蛋白质：加入20μL蛋白激酶K，通过手摇振荡的方式进行颠倒混匀1min。裂解白细胞，释放DNA：加入200μL缓冲液GB，通过手摇振荡的方式进行颠倒混匀10min，70℃水浴10min。

沉淀DNA，去除杂质：加入200μL无水乙醇，通过手摇振荡的方式进行颠倒混匀15s，简短离心使样品进一步混匀并去除管盖内壁的水珠。将管内所有溶液都加入吸附柱CB3中（吸附柱放入收集管中），12000rpm离心1min，倒掉废液，将吸附柱CB3放回收集管中。

去除蛋白质：向吸附柱CB3中加入500μL缓冲液GD，12000rpm离心1min，倒掉废液，将吸附柱CB3放回收集管中。

去除盐类：向吸附柱CB3中加入600μL缓冲液PW，12000rpm离心1min，倒掉废液，将吸附柱CB3放回收集管中。

去除盐类：重复步骤（7）。向吸附柱CB3中加入600μL缓冲液PW，12000rpm 离心1min，倒掉废液，将吸附柱CB3放回收集管中。

去除残存漂洗液：将吸附柱CB3放回收集管中，12000rpm离心2min，倒掉废液。将吸附柱CB3打开盖子置于室温放置10min。

洗脱DNA：将吸附柱CB3转入一个干净的EP中，向吸附膜的中间部位悬空滴加50μL洗脱缓冲液TE，室温放置5min，12000rpm离心2min，将溶液收集到EP 管中，如无法及时测定，应置于-80℃进行保存。

测定DNA浓度及纯度：使用微量紫外可见分光光度计进行测定，测定前通过手弹EP管底部3~5次的方式来使DNA溶液混匀。

5实验结果分析

A230nm：碳水化合物和盐类最高吸收峰吸收波长。

A280nm：蛋白质及酚类物质最高吸收峰吸收波长。

A260nm：DNA/RNA最高吸收峰吸收波长。

260/280：比值应在~之间，低于表示有蛋白质及酚类物质污染，高于表示有RNA污染。

260/230：比值应大于1，低于1表示有碳水化合物和盐类污染。

ng/μL：样品浓度单位，是通过样品在260nm处的吸光值以及选择的分析常数来计算的。采用本法提取的DNA溶液浓度应大于100ng/μL。