骨髓间充质干细胞免疫调节作用的机制及应用研究

结果

ｌ、小鼠ＭＳＣｓ和ＨＳＣｓ的鉴定（图１）

小鼠骨髓来源ＭＳＣｓ原代细胞为梭形贴壁细胞，细胞间夹杂少量圆形有核细胞，多为淋巴细胞和巨噬细胞（图１－１Ａ）。传代后细胞呈梭形或多角形，生长较慢，约２ｌ天达到７０—８０％融合（图１－１Ｂ）。流式细胞术检测细胞表面抗体显示ＣＤ３４一，ＣＤｌ０５＋（图１－２Ａ），小鼠骨髓单个核细胞中ｓｃａ－Ｉ＋／ｃｏｋｉｔ＋／ＣＤ３－细胞占１．６．２％（图１－２Ｂ）。

图１－１Ａ小鼠ＭＳＣｓ原代培养（为贴壁细胞，梭形，散在分布。ｘ１００）

图１・１Ｂ小鼠ＭＳＣｓ培养（Ｐ１代，贴壁细胞，梭形或多边形。ｘ１００）

Ａ．模型鼠皮肤瘀斑：Ｂ：模型鼠眼部黪染：ｃ：正常小鼠关节：Ｄ：模型鼠关节；

Ｅ：正常小鼠外周血涂片；Ｆ：模型鼠外周血涂片；ｏ．正常小鼠股骨切片；Ｈ：模型鼠

股骨切片．

图２免疫介导再生障碍性贫血小鼠模型建立：模型小鼠贫血、出血、感染；外周血涂片有核细胞减少（Ｘ１００）；骨髓增生减低（×１００）。

表４、治疗组存活小鼠外周血Ｔ细胞亚群的比较结果

５、骨髓病理组织学改变

对照组小鼠骨髓增生明显减低，血窦充血扩张，仅见极少量造血细胞，巨核细胞缺如，纤维细胞增生；治疗组死亡小鼠骨髓病理学改变同对照组；存活小鼠骨髓仍显示增生低下，但粒系、红系、巨核系三系细胞均可见，巨核细胞反应性增生（图５．１）。ＭＳＣｓ组和全骨髓细胞组相比，增生程度、造血面积上升无明显差异（图５．２）。

图５—１Ａ正常小鼠骨髓增生活跃，以造血细胞为主

巨核细胞易见：（ｘＡ００）

图５－１Ｂ对照组小鼠骨髓增生明显减低。血窦充血扩张，

仅见极少量造血细胞，巨核细胞缺如。（ｘ４００）

图５—１Ｃ存活小鼠骨髓增生低下。但粒系、红系、巨核系三系细胞均可见，巨核细胞反应性增生（ｘ４００）

图５－２ＡＭＳＣｓ组存活小鼠股骨（ｘ１００）

图５－２Ｂ全骨髓细胞组存活小鼠股骨（ｘ１００）

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中国协和医科大学中国医学科学院博士研究生学位论文

结果

１．正常人骨髓来源闻充质干细胞（ＭＳＣｓ）的鉴定。

原代培养５—７ｄ出现贴壁细胞克隆，散在分布；１０ｄ后细胞迅速增多，大多为长梭形；１４ｄ左右可传代（图１Ａ）。用于实验的Ｐ３代培养细胞为梭形贴壁细胞，形态均一（图１Ｂ）。流式检测Ｐ２代细胞免疫表型显示（图２）：ＣＤ９０、ＣＤｌ０５、ＣＤ２９、ＣＤｌ３、ＣＤ４４、ＣＤ７３、ＣＤ４９ｅ、ＣＤｌ０６、ＨＬＡ－Ｉ表达阳性：ＣＤ３４、ＣＤ４５、眦Ａ—ＩＩ表达阴性。

图１ＡＭＳＣｓ原代培养克隆形成（ｘ４０）

图１ＢＰ３代ＭＳＣｓ（为贴壁细胞，梭形，ｘ１００）

图２Ｐ２代ＭＳＣｓ免疫表型流式检测结果（为贴壁细胞，梭形）２．１１，－２３ｐ１９

ｍＲＮＡ在白血病患者与正常对照的表达（表１、图３）

应用实时定量ＰＣＲ进行相对定量测定，发现ＡＬ患者、ＣＭＬ患者骨髓单个核细胞ＩＬ．２３ｐ１９ｍＲＮＡ的表达水平与正常对照相比无统计学差异（ＰＡ州：０．９６３；ＰＣＵＬ－Ｉ叮＂－－０．６３１），ＩＬ一２３ｐ１９ｍＲＮＡ的表达水平在ＡＭＬ、ｍ工和ＣＭＬ患者之间也无差异（ＰＡＵＬ．ＡＬＬ＝０．４２２；ＰＡＭ∽眦＝０．８４６：ＰＡＬＬ．ＣＭＬ＝０．９１２）。

表１：骨髓单个核细胞ＩＬ一２３ｐ１９ｍＲＮＡ表达的比较

．１Ｌ２３基因的相对表达量

组别——＿ｉ乏戛———１五磊五；；ｉ————；泵ｉ一

中位数四分位数间距最小值最大值ＡＭＬ组Ｏ．１９７０．７６２

Ｏｍ５３．５４９

ＡＬＬ组ＣＭＬ组０．２６６

Ｏ．２７０

０．２０７

０．４９０

０．０５４

０，００１

Ｏ．５１４

４．５９４

正常对照组０．２０８Ｏ．７９４Ｏ．００５１．５８２

・３３－

图３Ａ内对照１３－ａｃｔｉｎ溶解曲线

图３ＢＩＬ一２３ｐ１９基因溶解曲线

图３ＣＴＧＦ一１３１基因溶解曲线