紫外可见分光光度法简介
紫外可见分光光度法
5、电荷转移吸收带：许多无机物（如碱金属卤化 物）和某些有机物混合而得的分子配合物引起。 特点：近紫外和可见光区。 吸收强度大， max>104，测定灵敏度高。 6、配位体场吸收带：过渡金属水合离子与显色剂 （通常为有机化合物）所形成的配合物引起。 特点：可见光区。
四、影响吸收带的因素
3、溶剂效应：溶剂极性。
极性溶剂：π→π*跃迁→长移，n→π*跃迁→短移， 后者移动一般比前者大。* 原因：π→π*跃迁吸收长移，激发态的极性总比基态 极性大，因而激发态与极性溶剂之间相互作用所降 低的能量大。 n→π*跃迁吸收短移，是由于基态极性大，非 键电子与极性溶剂之间能形成较强的氢键，使基态 能量降低大于反键轨道与极性溶剂相互作用所降低 的能量，因而跃迁所需能量变大。 溶剂的选择：极性；纯度高；截止波长< λmax
例：亚甲蓝、重铬酸钾
（二）光学因素 1、非单色光：
前提是入射光为单色光。
谱带宽度（band width）：当光源为连续光谱时， 采用单色器分离出来的光同时包含了所需波长的光 和附近波长的光，即是具有一定波长范围的光，这 一宽称为谱带宽度，用半峰宽S表示。
单色光的谱带宽
S=λ1-λ2
设入射光由波长为1和 2的光组成 入射光光强分别为 I 01和I 02 对应的透过光光强分别为I 1和I 2
27,600
21,000 12,300 12,000 11,000
CH3 CH3 C2H5
2、跨环效应： β、γ不饱和酮中，由于立体排列，使羰基孤 对电子和双键的π电子作用，使相当于n→π* 跃迁的R带长移，同时吸收强度增强。 当C=O的π轨道与一个杂原子的P轨道能够有 效交盖时，也会出现跨环效应。
紫外可见分光光度法在食品检测中的应用
工作中直线经常发生弯曲，这称为朗伯-比
尔定律旳偏离。
原因：
吸光物质浓度较高；非单色光引起；介质
不均匀引起；吸光物质不稳定引起。
摩尔吸收系数ε：
1mol/L浓度旳溶液，液层厚度为1cm时旳吸
收度。
强吸收：ε＞104；
中档强度吸收：102 ＜ ε ＜ 104；
度。（吸收池厚度为10.0mm)。
c.
4、紫外-可见分光光度计旳构成、类型和使用
（1）构成：光源、单色器、吸收池、检测器、
信号处理器、显示屏
可见光源：碘钨灯、钨灯：320-2500nm
紫外光源：氢灯、氘灯、汞灯：150-400nm
玻璃吸收池：仅用于可见光区
石英池：可用于紫外光区和可见光区
选择原则：
能完全溶解样品；
在所用旳波长范围内有很好旳透光性；
纯度为“光谱纯”或经检验其空白符合要求。
处理措施：
蒸馏水煮沸清除气泡；
乙醇清除醛类、苯等杂质；
环己烷、正己烷清除苯；
氯仿预防光和空气破坏；
乙醚清除过氧化物；
烃类吸附除杂
（3）参比溶液旳选择
1）. 溶剂参比：试样构成简朴、共存组份少（基体
注意事项：
粗酶液制备时根据目旳酶旳性质选择缓冲液、温度、
时间等条件；
酶和底物旳反应条件也要恰当；
一般以检测产物变化量居多。
二、紫外-可见分光光度法
在食品检测中旳应用
（一）、食品酶分析
1、-半乳糖苷酶（乳糖酶）
以ONPG（邻硝基苯β-D-半乳吡喃糖苷）为
底物测定-半乳糖苷酶活力。
紫外可见分光光度法在食品包装材料检测中的应用
紫外可见分光光度法在食品包装材料检测中的应用紫外可见分光光度法在食品包装材料检测中的应用1. 紫外分光光度法简介紫外可见分光光度（UV-vis）是一种物质吸收到紫外及可见光的能量的光谱分析技术，是一种非破坏性检测方法，是进行食品中污染物、报警物质和有机物含量等快速检测的常用技术。
2. 紫外分光光度法在食品包装材料检测中的应用（1）检测含有机物的含量：紫外分光光度法可以有效检测食品包装材料中石油类、香精、活性剂等有机物的含量，可有效控制污染物和有害物质的增加，维护食品安全。
（2）检测染料的残留：紫外分光光度法可以有效检测食品包装材料中的各种染料和可以能有毒的残留物，这样可以有效控制这些有害物质影响食品的安全性。
3. 紫外分光光度法的优势（1）精度高：紫外可见分光光度分析仪操作简单，自动化程度高，可获得高精度、高灵敏度的试验结果。
（2）操作快速：紫外分光光度法操作简单速度快，检测时间短，可以快速获得检测数据，大大减少了研究时间和成本。
（3）检测范围广泛：紫外分光光度法可以用于检测各种类的物质，具有检测范围广泛的优势。
4. 紫外分光光度法的局限（1）分析精度受材料影响大：不同的包装材料会影响分析仪的检测准确性，所以检测的精度不可避免的会受影响。
（2）结果不易定量：由于紫外分光光度技术提供的检测结果更多是定性的，而不是定量的，所以不容易用定量来说明检测结果。
（3）测量结果受抗干扰性影响：受外部干扰比较大，结果可能不稳定，容易造成出现偏差。
5. 结论紫外可见技术是一种快速、高效、准确、准确、无需特殊处理的物质分析技术，在食品包装材料检测中具有重要的作用。
尽管存在抗干扰性等操作难度的问题，但只要正确操作，紫外可见分光光度法仍然可以提供准确可靠的检测结果，为食品包装材料检测提供了一种新的可能。
1紫外可见分光光度法
1．紫外可见分光光度法1.1 概述物质的吸收光谱本质上就是物质中的分子和原子吸收了入射光中的某些特定波长的光能量，相应地发生了分子振动能级跃迁和电子能级跃迁的结果。
由于各种物质具有各自不同的分子、原子和不同的分子空间结构，其吸收光能量的情况也就不会相同，因此，每种物质就有其特有的、固定的吸收光谱曲线，可根据吸收光谱上的某些特征波长处的吸光度的高低判别或测定该物质的含量，这就是分光光度定性和定量分析的基础。
分光光度分析就是根据物质的吸收光谱研究物质的成分、结构和物质间相互作用的有效手段。
紫外可见分光光度法的定量分析基础是朗伯-比尔（Lambert-Beer）定律。
即物质在一定波长的吸光度与它的吸收介质的厚度和吸光物质的浓度呈正比。
当分子中含有一个或更多的生色基团（即具有不饱和键的原子基团），辐射就会引起分子中电子能量的改变。
常见的生色团有：如果两个生色团之间只隔一个碳原子，则形成共轭基团，会使吸收带移向较长的波长处（即红移），且吸收带的强度显著增加。
当分子中含有助色基团（有未共用电子对的基团）时，也会产生红移效应。
常见的助色基团有：-OH, -NH2, -SH, -Cl, -Br, -I。
紫外可见分光光度法从问世以来，在应用方面有了很大的发展，尤其是在相关学科发展的基础上，促使分光光度计仪器的不断创新，功能更加齐全，使得光度法的应用更拓宽了范围。
目前，分光光度法已为工农业各个部门和科学研究的各个领域所广泛采用，成为人们从事生产和科研的有力测试手段。
我国在分析化学领域有着坚实的基础，在分光光度分析方法和仪器的制造方面在国际上都已达到一定的水平。
1.2 特点分光光度法对于分析人员来说，可以说是最有用的工具之一。
几乎每一个分析实验室都离不开紫外可见分光光度计。
分光光度法的主要特点为：（1）应用广泛由于各种各样的无机物和有机物在紫外可见区都有吸收，因此均可借此法加以测定。
到目前为止，几乎化学元素周期表上的所有元素（除少数放射性元素和惰性元素之外）均可采用此法。
紫外可见分光光度法
由图可见ΔT =1%, T 在20%～ 65%之间时, 浓度相对误差较小, 此为 最佳读数范围。
所以要求选择适宜的吸光度范围 （0.2-0.7）, 以使测量结果的误差最 小。
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措施: （a）控制溶液的浓度；（b） 选择不同厚度的比色
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溶液颜色与光吸收的关系
当一束太阳光照射某一溶液时, 太阳光中某一颜色的光 被吸收, 其互补色光透过溶液, 刺激人的眼睛, 使人感觉到它 的颜色。
实例:
1)高锰酸钾吸收绿光显紫 红色；
2)重铬酸钾吸收蓝光显黄 色；
3)邻菲罗啉铁溶液吸收蓝 绿光显红色。
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可见光波长及其互补光
(如国产710型，730型)； 3.双波长双光束分光光度计
(如国产WFZ800-5型）
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紫外可见分光光度的使用
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721分光光度计操作步骤
➢ 1.预热仪器。为使测定稳定, 将电源开关打开, 使仪器预热20min, 为了防止光电管疲劳, 不要连续光照。预热仪器和不测定时应将比 色皿暗箱盖打开, 使光路切断。
ε: 摩尔吸收系数，单位L·mol -1·cm-1。（讲解78页 例题）
摩尔吸收系数越大表明该物质的吸光能力越强，用光度法测
定该物质的灵敏度越高。
ε > 105: 超高灵敏；
ε = (6～10）×104 : 高灵敏；
ε < 2×104
: 不灵敏。
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吸光度的加和性
紫外—可见分光光度法
（三）溶剂对吸收光谱的影响
1.对最大吸收波长的影响 溶剂极性增大， *红移， n*蓝移。
产生*跃迁的基团， 激发态的极性比基态强， 溶剂化作用使激发态能 量降低，吸收峰红移。
产生n*跃迁的基团， 基态时n电子会与极性 溶剂形成氢键，n轨道 能量降低，吸收峰蓝移。
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溶剂对亚异丙酮紫外吸收光谱的影响。
3、*跃迁 吸收峰一般接近或大于200 nm，其特征是摩尔吸光 系数大，一般max104，为强吸收带。如乙烯（蒸气） 的最大吸收波长max为162 nm(孤立）。丁二烯为 217nm（离域）。
5
4、n*跃迁 虽然所需跃迁能量最小，但n轨道和*
轨道重叠少，跃迁机率很小。其特点是谱带强度弱， 摩尔吸光系数小，通常小于100，属于禁阻跃迁。
共轭体系 最大吸收波长红移，但摩尔吸收系数
显著变化。 1,3-丁二烯 217nm, 20 900 Lmol-1cm-1
*
碳氧双键与烯键
220nm, 15 000 Lmol-1cm-1
的共轭
CH3CH=HCHO 322nm, 28 Lmol-1cm-1
170nm
280nm
n*
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助色团是指带有非键电子对的基团，如184OnHm、 5-O0R0、00 -LNmHRo、l-1-cSmH-、1 -Cl、 -Br、-I等，它们本身不能吸收大 204于nm200n7m40的0光L，m但ol-是1c当m它-1 们与生 色团相连时，会使生色团的吸收 254峰nm向长2波00方L向m移ol动-1，cm并-1且增加其 吸收强度。
1
2
§2 紫外—可见吸收光谱
一、有机化合的紫外-可见吸收光谱 （一）电子跃迁类型
3
4
紫外可见分光光度法简介
化合物
共轭双键数 max / nm
m ax
CH2 CH2
1
195
5000
C H 2 C H C O O H 2
200
10000
H 2 CC HC HC H 2 2
217
21000
CH3 CH CH2 COOH3
254
25000
H (C H C H )3H3
258
a
35000
10
另有一些基团，本身并不产生吸收峰，但与生色团共存于同一分 子时，可引起吸收峰的位移和吸收强度的改变，这些基团称为助 色团。如苯环的一个氢原子被一些基团取代后，苯环在254nm处 的吸收带的最大吸收位置和强度就会改变。
吸光度: 为透光度倒数的对数，用A表示， 即
A=lg1/T=lgI0/It
a
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二、朗伯-比尔定律
朗伯-比尔定律：当一束平行单色光通过含有吸光物质的稀溶液时，溶液的吸光 度与吸光物质浓度、液层厚度乘积成正比，即
A= κ cl
式中比例常数κ与吸光物质的本性，入射光波长及温度等因素有关。c为吸光 物质浓度，l为透光液层厚度。
a
5
在分子发生电子能级跃迁的同时，总是伴随着振 动能级和转动能级的跃迁。所以，在分子的电 子光谱中，包含有不同振动能级跃迁产生的若 干吸收谱带和转动能级跃迁产生的若干吸收谱
线不。出一电般 子情 光况 谱下中由振于动能E 级e和转动EV 能 级 跃E 迁r所,分产辨
生的谱线结构，观察到的只是这些谱线展宽后 合并在一起形成的较宽的吸收带。所以通常又 将分子的电子光谱称为带状光谱。
生色团 化合物
羰基
H3C C
溶剂
正己烷
CH3
紫外可见光分光光度法
紫外-可见分光光度法是在190～800nm波长范围内测定物质的吸光度，用于鉴别、杂质检查和定量测定的方法。
当光穿过被测物质溶液时，物质对光的吸收程度随光的波长不同而变化。
因此，通过测定物质在不同波长处的吸光度，并绘制其吸光度与波长的关系图即得被测物质的吸收光谱。
从吸收光谱中，可以确定最大吸收波长λmax和最小吸收波长λmin。
物质的吸收光谱具有与其结构相关的特征性。
因此，可以通过特定波长范围内样品的光谱与对照光谱或对照品光谱的比较，或通过确定最大吸收波长，或通过测量两个特定波长处的吸收比值而鉴别物质。
用于定量时，在最大吸收波长处测量一定浓度样品溶液的吸光度，并与一定浓度的对照溶液的吸光度进行比较或采用吸收系数法求算出样品溶液的浓度。
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紫外-可见分光光度法简介
紫外-可见分光光度法(ultraviolet-visible spectrophotometry, UV-VIS)，它是利用物质的分子或离子对某一波长范围的光的吸收作用，对物质进行定性分析、定量分析及结构分析, 所依据的光谱是分子或离子吸收入射光中特定波长的光而产生的吸收光谱。
按所吸收光的波长区域不同，分为紫外分光光度法和可见分光光度法，合称为紫外-可见分光光度法。
紫外--可见分光光度法：是根据物质分子对波长为200-760nm这一范围的电磁波的吸收特性所建立起来的一种定性、定量和结构分析方法。
操作简单、准确度高、重现性好。
波长长（频率小）的光线能量小，波长短（频率大）的光线能量大。
分光光度测量是关于物质分子对不同波长和特定波长处的辐射吸收程度的测量。
吸收光谱
描述物质分子对辐射吸收的程度随波长而变的函数关系曲线，称为吸收光谱或吸收曲线。
紫外-可见吸收光谱通常由一个或几个宽吸收谱带组成。
最大吸收波长（λmax）表示物质对辐射的特征吸收或选择吸收，它与分子中外层电子或价电子的结构（或成键、非键和反键电子）有关。
朗伯-比尔定律是分光光度法和比色法的基础。
这个定律表示：当一束具有I0强度的单色辐射照射到吸收层厚度为b，浓度为c的吸光物质时，辐射能的吸收依赖
于该物质的浓度与吸收层的厚度。
其数学表达式为：式中的A 叫做吸光度；I0为入射辐射强度；I为透过吸收层的辐射强度；（I/I0）称紫藤为透射率T；ε是一个常数，叫做摩尔吸光系数，ε值愈大，分光光度法测定的灵敏度愈高。
紫外-可见分光光度计
有稳定的、有足够输出功率的、能提供仪器使用波段的连续光谱，如钨灯、卤钨灯（波长范围350～2500纳米），氘灯或氢灯（180～460纳米），或可调谐染料激光光源等。
②单色器[1]。
它由入射、出射狭缝、透镜系统和色散元件（棱镜或光栅）组成，是用以产生高纯度单色光束的装置，其功能包括将光源产生的复合光分解为单色光和分出所需的单色光束。
③试样容器，又称吸收池。
供盛放试液进行吸光度测量之用，分为石英池和玻璃池两种，前者适用于紫外到可见区，后者只适用于可见区。
容器的光程一般为0.5～10厘米。
④检测器，又称光电转换器。
常用的有光电管或光电倍增管，后者较前者更灵敏，特别适用于检测较弱的辐射。
扫描的特点。
⑤显示装置。
这部分装置发展较快。
较高级的光度计，常备有微处理机、荧光屏显示和记录仪等，可将图谱、数据和操作条件都显示出来。
仪器类型则有：单波长单光束直读式分光光度计，单波长双光束自动记录式分光光度计和双波长双光束分光光度计。
应用范围包括：①定量分析，广泛用于各种物料中微量、超微量和常量的无机和有机物质的测定。
②定性和结构分析，紫外吸收光谱还可用于推断空间阻碍效应、氢键的强度、互变异构、几何异构现象等。
③反应动力学研究，即研究反应物浓度随时间而变化的函数关系，测定反应速度和反应级数，探讨反应机理。
④研究溶液平衡，如测定络合物的组成，稳定常数、酸碱离解常数等。
使用方法
仪器的校正和检定
（1）波长由于环境因素对机械部分的影响，仪器的波长经常会略有变动，因此除应定期对所用的仪器进行全面校正检定外，还应于测定前校正测定波长。
常用汞灯中的较强谱线237.83nm、253.65nm、275.28nm、296.73nm、313.16nm、334.15nm、365.02nm、404.66nm、435.83nm、546.07nm与576.96nm，或用仪器中氘灯的486.02nm与656.10nm谱线进行校正，钬玻璃在279.4nm、287.5nm、333.7nm、360.9nm、418.5nm、460.0nm、484.5nm、536.2nm与637.5nm波长处有尖锐吸收峰，也可作波长校正用，但因来源不同或随着时间的推移会有微小的差别，使用时应注意。
（3）杂散光的检查可按下页表的试剂和浓度，配制成水溶液，置1cm石英吸收池中，在规定的波长处测定透光率，应符合表中
对溶剂的要求
含有杂原子的有机溶剂，通常均具有很强的末端吸收。
因此，当作溶剂使用时，它们的使用范围均不能小于截止使用波长。
例如甲醇、乙醇的截止使用波长为205nm 。
另外，当溶剂不纯时，也可能增加干扰吸收。
因此，在测定供试品前，应先检查所用的溶剂在供试品所用的波长附近是否符合要求，即将溶剂置1cm石英吸收池中，以空气为空白（即空白光路中不置任何物质）测定其吸收度。
溶剂和吸收池的吸光度，在220～240nm 范围内不得超过0.40，在241～250nm范围内不得超过0.20，在251～300nm 范围内不得超过0.10，在300nm以上时不得超过0.05。
测定法
测定时，除另有规定外，应以配制供试品溶液的同批溶剂为空白对照，采用1cm的石英吸收池，在规定的吸收峰波长±2nm 以内测试几个点的吸收度，或由仪器在规定波长附近自动扫描测定，以核对供试品的吸收峰波长位置是否正确，除另有规定外，吸收峰波长应在该品种项下规定的波长±2nm以内，并以吸光度最大的波长作为测定波长。
一般供试品溶液的吸收度读数，以在0.3～0.7之间的误差较小。
仪器的狭缝波带宽度应小于供试品吸收带的半宽度，否则测得的吸收度会偏低；狭缝宽度的选择，应以减小狭缝宽度时供试品的吸收度不再增大为准，由于吸收池和溶剂本身可能有空白吸收，因此测定供试品的吸光度后应减去空
白读数，或由仪器自动扣除空白读数后再计算含量。
当溶液的pH 值对测定结果有影响时，应将供试品溶液和对照品溶液的pH值调成一致。
（1）鉴别和检查分别按各品种项下的方法进行。
（2）含量测定一般有以下几种。
对照品比较法
按各品种项下的方法，分别配制供试品溶液和对照品溶液，对照品溶液中所含被测成分的量应为供试品溶液中被测成分规定量的100%±10%，所用溶剂也应完全一致，在规定的波长测定供试品溶液和对照品溶液的吸光度后，按下式计算供试品中被测溶液的浓度∶
CX=（AX/AR）CR
式中 CX为供试品溶液的浓度；
AX为供试品溶液的吸收度；
AR为对照品溶液的浓度；
CR为对照品溶液的吸收度。
吸收系数法
按各品种项下的方法配制供试品溶液，在规定的波长处测定其吸光度，再以该品种在规定条件下的吸收系数计算含量。
用本法测定时，吸收系数通常应大于100，并注意仪器的校正和检定。
比色法
供试品溶液加入适量显色剂后测定吸光度以测定其含量的方法为比色法。
用比色法测定时，应取数份梯度量的对照品溶液，用溶剂补充至同一体积，显色后，以相应试剂为空白，在各品种规定的波长处测定各份溶液的吸光度，以吸光度为纵坐标，浓度为横坐标绘制标准曲线，再根据供试品的吸光度在标准曲线上查得其相应的浓度，并求出其含量。
也可取对照品溶液与供试品溶液同时操作，显色后，以相应的试剂为空白，在各品种规定的波长处测定对照品和供试品溶液的吸光度，按上述（1）法计算供试品溶液的浓度。
除另有规定外，比色法所用空白系指用同体积溶剂代替对照品或供试品溶液，然后依次加入等量的相应试剂，并用同样方法处理制得。
紫外-可见吸收光谱
朗伯-比耳定律
紫外-可见分光光度计
分析条件的选择
测定方法在医学检验中的应用。