分子生物学实验课件..
分子生物学实验技术ppt课件
质粒转化大肠杆菌的过程
感受态
非定向克隆 +
或
定向克隆
克隆的片段只能按
+ 特定方向连接基因组DNA的构建基因组DNA的类型
质粒（﹤10kb)噬菌体质经双向电泳之后，用蛋白质水解酶裂解成肽段，可 用于质谱分析。通过电离源将蛋白质分子转化为气相离子， 然后用质谱分析仪的电场、磁场将具有特定质量与电荷比 值（M/Z值）的蛋白离子分离开，经过离子检测器收集分离 的离子，确定离子的M/Z值，分析鉴定未知蛋白质。
两种离子发生方法： 基质辅助激光解吸附/离子化（MALDI)、电喷雾离子化 （ESI)
噬菌体展示技术
噬菌体展示技术是将编码目的蛋白的基 因与编码噬菌体表面蛋白的基因融合后， 以融合蛋白的形式表达在噬菌体表面的一 种技术。
将不同蛋白的cDNA插入噬菌体载体进 行表达，得到表达不同蛋白的一定规模的 噬菌体展示库 。
将“诱饵”蛋白固定化，基于“诱饵”蛋白与 “猎物”蛋白之间的相互作用，可将展示库 中与固定化的“诱饵”蛋白有相互作用的“猎 物”蛋白分离纯化出来，再对“猎物”蛋白进 行质谱鉴定。
四、蛋白组学研究
蛋白质分离 蛋白质分析 蛋白质相互作用的研究方法： 酵母双杂交技术，噬菌体展示技术，表
面等离子共振技术，荧光共振能量转移 技术，蛋白质微阵列芯片技术，免疫共 沉淀技术，pull-down技术
蛋白质分离
最常用的蛋白质分离技术是20世纪70年代发明的双 向电泳（2-DE），是根据蛋白质的等电点不同在pH 梯度介质中进行第一次分离，即等点聚焦（IEF)，然 后根据蛋白质分子量的不同进行第二次分离，即 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳。
重叠延伸PCR原理
重叠延伸PCR技术由于使用了具有互补末端的引物， 使PCR 产物形成了重叠链，从而在随后的扩增反应中通过 重叠链的延伸，将不同来源的扩增片段重叠拼接起来。可 简单迅速的将两个DNA片段连在一起，用于嵌合基因的构 建
现代分子生物学ppt课件
目录
• 分子生物学概述 • 基因与基因组 • DNA复制与修复 • RNA转录与加工 • 蛋白质翻译与修饰 • 基因表达调控 • 分子生物学技术与应用
01 分子生物学概述
分子生物学的定义与发展
分子生物学的定义
在分子水平上研究生物大分子的 结构和功能，以揭示生命现象本 质的科学。
重组DNA技术的应用
阐述重组DNA技术在基因克隆、基因表达、基因治疗等领域的应 用。
重组DNA技术的优缺点
分析重组DNA技术的优点，如高效、精确等，同时也指出其存在 的缺点，如安全性问题等。
PCR技术原理，包括引物设计、DNA聚合酶的作用 等。
PCR技术的应用
基因表达的调控
研究基因表达在时间和空间上的调控机制， 包括转录因子、表观遗传学等。
分子生物学与生物学的关系
分子生物学是生物学的重要分支
01
分子生物学研究生物大分子的结构和功能，是揭示生命现象本
质的基础科学。
分子生物学推动生物学的发展
02
随着分子生物学理论和技术的不断发展，生物学的研究领域不
断拓宽，研究水平不断提高。
microRNA调控
一类非编码小RNA分子，通过与靶mRNA结合抑制其翻译或促进 其降解来调节基因表达。
基因表达调控的生物学意义
适应环境变化
细胞分化和发育
能量代谢平衡
响应生物和非生物胁迫
基因表达调控使生物能够根据 不同环境条件调整其生理和代 谢状态，以维持生存和繁殖。
在细胞分化和发育过程中，基 因表达调控确保不同类型细胞 具有独特的表型和功能。
列举PCR技术在DNA片段扩增、基因突变分析、基因表达分析等领 域的应用。
分子生物学技术ppt课件
探针技术
• 探针是经过特殊标记的核酸片段，具有特定的 序列，能够与待测的核酸片段互补结合，因此 可用于检测核酸样品中的基因。
• 标记物：同位素、生物素或荧光染 Nhomakorabea • 核酸片段：人工合成、克隆的基因组DNA、
cDNA、RNA • 探针种类：DNA、RNA
印迹技术(Blotting): 将在凝胶中分离的 生物大分子转移(印迹)在固相化介质上 并加以检测分析的技术。
(1) DNA 印迹: Southern blotting (2) RNA 印迹: Northern blotting (3) 蛋白质印迹: Western blotting
印迹技术基本原理
凝胶电泳
转移
杂交
放射自显影 或化学显色
Southern blotting（DNA印迹技术）
组织或细胞中基因组DNA经限制性内切酶消 化后进行琼脂糖凝胶电泳，将含有DNA区带的凝 胶放入变性溶液变性后，使胶中的DNA分子转移 到NC膜上。转移完成后，加热使DNA固定于NC膜 上，用于杂交反应可进行DNA印渍。
三个步骤为一个循环。新合成的DNA分子作 为下一轮合成的模板，经多次循环（25～30次） 后即可达到扩增DNA片段的目的。
PCR的主要用途
目的基因的克隆 为重组DNA获得目的基因提供了简便快速的方法
基因的体外突变 利用PCR技术可以随意设计引物在体外进行基因 的嵌合、缺失、点突变等改造。
DNA和RNA的微量分析 一滴血液、一根毛发或一个细胞已足以满足PCR 的检测需要。
DNA序列分析 基因突变分析
PCR衍生技术
反转录PCR技术
mRNA反转录生成cDNA, cDNA 为模板PCR扩增
分子生物学PPT课件
顺式作用元件〔cis-acting element〕 反式作用因子〔trans-acting
element〕 真核生物启动子 增强子 转录因子〔trans-criptional factor,
TF) 转录过程
近启动子：〔核心启动子〕，－40～ ＋5，决定转录起始的准确位置。远启
动子：〔上游控制元件〕，－165～ －40，影响转录的频率。
膜受体介导的信息传递
cAMP -Ａ激酶 途径
磷脂酰肌醇途径
酪氨酸蛋白激酶 途径
胞内受体介导的信息传递
rRNA
RNA的加工成熟
tRNA mRNA
转录起始的选择 选择性加工 mRNA的稳定性
mRNA的构造 翻译的起始调节 可溶性蛋白因子的修饰与翻译起始
调控 选择性翻译 小分子RNA的调控〔反义RNA、干
制 复制的过程
复制的保真性
复制的调控
定义
半保存复制 特点
类型〔线型、环状〕
参与DNA复制的物质
底物 模板 引物 DNA聚合酶 解链酶 引物酶 单链结合蛋白 拓扑异构酶 连接酶
复制起始 复制的过程 延伸
终止
复制起始点 复制方向 引发体的形成
DNApolⅠ和 Ⅲ的3′－5′活性 RNA引物起始复制，引物最终除去，
扰RNA、微小RNA、时序RNA〕 翻译的自我调节 翻译后程度的调控
谢谢
染色质构造对基因表达的影响 DNA的甲基化与去甲基化 染色体(质)丧失 基因扩增 基因重排
顺式作用元件 反式作用因子〔类型、构造〕 转录起始的调节〔转录起始复合物、
反式作用因子的活性、作用方式〕 RNA聚合酶 真核基因转录调控的主要形式 应答元件的作用机制 真核基因转录后程度上的调控
医学分子生物学实验课件
121 ttttgtcgca ctctccttgtt tttgacaatg caatcatat gcttctgcta tgttaagcgt
目的基因片段长度：330bp 181 attcaacagc gatgattaca gtccagctgt gcaagagaat attcccgctc tccggagaag
分子生物学实验
一、人类基因组DNA提取 二、PCR技术 三、RFLP技术
1
实验流程图
采集血液样本
提取基因组DNA
基因位点的PCR扩增
琼脂糖凝胶检测PCR扩增产物
PCR产物酶切
琼脂糖凝胶电泳检测酶切产物
DNA凝胶成像系统判读基因型
统计分析各等位基因频率
2
一、人类基因组DNA提取 材料：生物组织、培养细胞、血液样品 常规提取基因组DNA主要步骤： 1.破碎细胞： （1）物理方法：超声波、匀浆、液氮研磨 法等（易导至DNA链的断裂 ） （2）化学等温和方法（获得大分子量DNA）
10
引物：能与模板DNA两条链上的各一 段序列互补的寡核苷酸（15～20bp）
SRY基因引物：
上游引物：5′GATCAGCAAGCAGCTGGGATACCAGTG3′ 下游引物：5′CTGTAGCGGTCCCGTTGCTGCGGTC 3' 扩增DNA片段长度：330bp
11
SRY基因部分序列
1 gttgaggggg tgttgagggc ggagaaatgc aagtttcatt acaaaagtta acgtaacaaa
1OD260单链DNA或RNA≈40μg/ml 样品纯度判定：OD260/ OD280 ≈ 1.8～2.0 DNA或RNA较纯
《分子生物工程》课件
05
分子生物工程的挑 战与未来发展
技术挑战与解决方案
技术挑战
分子生物工程技术在应用过程中面临着许多技术挑战，如基 因编辑技术的精确性、基因表达调控的复杂性以及细胞命运 决定的机制等。
解决方案
针对这些挑战，科研人员正在探索新的技术和方法，如开发 更精确的基因编辑工具、深入研究基因表达调控机制以及揭 示细胞命运决定的过程等。
生物能源领域
生物燃料
利用分子生物工程技术，开发新型生物燃料，替代化石燃料，减少碳排放。
生物质能
利用分子生物工程技术，实现生物质的高效转化和利用，提高能源利用效率。
04
分子生物工程的前 沿研究
基因编辑技术
基因编辑技术
CRISPR-Cas9系统是目前最常用 的基因编辑技术，它能够精确地
定位和修改生物体的基因组。
未来发展方向
随着分子生物工程技术的不断进步和 应用领域的拓展，未来发展方向将更 加多元化和个性化，如精准医疗、生 物制药、农业生物技术以及环境生物 技术等。
前景展望
分子生物工程技术将在未来继续发挥 重要作用，为人类带来更多的福祉和 创新。同时，需要加强科研合作和人 才培养，推动技术的可持续发展和广 泛应用。
医药领域
01
02
03
基因治疗
利用基因工程技术修复、 替换或增减人类基因，以 达到治疗疾病的目的。
药物研发
利用分子生物工程技术， 快速筛选和优化药物候选 物，提高药物研发效率。
诊断技术
基于分子生物工程技术， 开发新型诊断试剂和仪器 ，提高疾病诊断的准确性 和灵敏度。
农业领域
转基因作物
通过转基因技术改良作物 ，提高抗逆性、产量和品 质。
历史
分子生物学ppt课件
基因组大小(Mb)
0.58 1.83 4.20 4.60 13.50 12.50 466 165 97 2700 3000
基因数
470 1743 4100 4288 6034 4929 30000 13601 18424 30000 25000
染色体数*
无 无 无 无 16 16 21 4 6 20 23
包括：
结构基因组学
功能基因组学
三个亚领域.
比较基因组学
28
29
一、病毒基因组 二、原核生物基因组 三、真核生物基因组
30
一、病毒基因组
基因组（genome） 1个配（精子或卵子），1个单倍 体细胞或1个病毒所包含的全套遗传物质的总和。病毒核酸 或为DNA或为RNA，可以统称为病毒染色体。
完整的病毒颗粒具有蛋白质外壳，以保护病毒核酸不 受核酸酶的破坏，并能识别和侵袭特定的宿主。
分子生物学
Molecular Biology
1
What is Molecular Biology?
分子生物学是从分子水平研究生命现象、生命规律和生命本质 的学科。
核心内容是从分子水平研究基因和基因的活动，这些活动主要 通过核酸和蛋白质的活动来实现。
医学分子生物学主要研究人体生物大分子和大分子体系的结构、 功能、相互作用及其与疾病发生、发展的关系。
16
三、基因的结构特点和分类
基因的结构
结构基因：编码区序列（coding region sequence ）
在细胞内表达为蛋白质或功能RNA的DNA序列
转录调控序列：非编码序列（non-coding sequence）
基因表达需要的调控区（regulatory region）序列， 包括启动子（promoter）、增强子（enhancer）等。
分子生物学课件(共51张PPT)
蛋白质局部主链的空间结构， 包括α-螺旋、β-折叠等。
三级结构
整条肽链中全部氨基酸残基的 相对空间位置Байду номын сангаас即整条肽链每 一原子的相对空间位置。
四级结构
由两条或两条以上的多肽链组 成的一类结构，每一条多肽链
都有完整的三级结构。
蛋白质的功能与分类
结构蛋白：作为细胞的结构，如膜蛋白，染色体蛋白等 。 酶：催化生物体内的化学反应。
分子生物学是生物学的重要分支
01
分子生物学以生物大分子为研究对象，揭示生命现象的分子基
础，是生物学的重要分支之一。
分子生物学推动生物学的发展
02
分子生物学的发展推动了生物学的研究从细胞水平向分子水平
深入，为生物学的发展提供了新的理论和技术支持。
分子生物学与其他学科的交叉融合
03
分子生物学与遗传学、生物化学、微生物学、免疫学等学科存
。
表观遗传学调控
通过改变染色质结构和DNA 甲基化等方式来调控基因表达
。
05
蛋白质的结构与功能
蛋白质的分子组成
氨基酸
蛋白质的基本组成单元，共有20 种标准氨基酸。
肽键
连接氨基酸之间的主要化学键。
辅基与辅酶
某些蛋白质还包含辅基或辅酶， 以辅助其功能的发挥。
蛋白质的结构层次
一级结构
指蛋白质中氨基酸的排列顺序 。
重组DNA分子的构建和 筛选
PCR技术及其应用
01
02
PCR技术的基本原理和步骤
引物的设计和选择
03
04
PCR反应体系和条件优化
PCR技术在DNA扩增、突变 分析、基因分型等领域的应用
基因克隆与基因工程
《分子生物学》课件
基因编辑实验室
展示现代基因编辑实验室的设 备和技术。
基因治疗
探讨基因编辑技术在治疗遗传 病和癌症中的潜力。
生物信息学与计算生物学
大数据分析
使用生物信息学和计算生物学的工具来分析 海量生物数据。
蛋白质结构预测
通过模拟和计算来预测和研究蛋白质的结构 和功能。
3 基因修复与修复机
制
探讨基因损伤修复和细 胞保护机制在环境暴露 中的作用。
生物多样性与保护
生物多样性
解释生物多样性的重要性和全球生物多样性状 况。
保护生物多样性
讨论保护生物多样性的 分子标记物
液体活检
通过PCR和测序技术检测基因突变和遗传病。
《分子生物学》PPT课件
《分子生物学》PPT课件大纲： 1. 介绍分子生物学概念 2. DNA和RNA结构与功能 3. 蛋白质的合成与结构 4. DNA复制和细胞分裂 5. 基因表达与转录 6. RNA加工修饰 7. 蛋白质翻译和折叠 8. 基因调控及表观遗传学
基因编辑与CRISPR技术
CRISPR Cas9
介绍分子标记物在疾病诊断和治疗中的应用， 如肿瘤标志物。
探讨液体活检在肿瘤诊断和监测中的潜力。
分子生物学的社会影响
1 伦理和法律问题
讨论基因编辑和遗传修 复等技术引发的伦理和 法律问题。
2 公众教育和意识
强调公众了解分子生物 学的重要性和科学素养 的培养。
3 医疗与健康
探讨分子生物学在医疗 和健康领域的革命性发 展。
基因组学研究
利用计算方法研究基因组结构、功能和进化。
网络生物学
通过构建和分析生物网络来揭示生物体内的 复杂关系。
《分子生物学全套》ppt课件
分子生物学是一门从子水平研究生 物大分子的结构和功能的科学，主要 关注DNA、RNA和蛋白质等生物大 分子的复制、转录、翻译和调控等过 程。
分子生物学特点
以分子为研究对象，阐明生命现象的 本质；与多学科交叉融合，推动生命 科学的发展；实验技术手段不断更新 ，提高研究效率和准确性。
分子生物学发展历程
分子生物学研究内容及方法
研究内容
包括基因和基因组的结构与功能、DNA损伤与修复、基因表达的调控、蛋白质 组学的研究以及疾病产生的分子基础等。
研究方法
包括基因克隆与表达、蛋白质分离与纯化、PCR技术、基因敲除与敲入、高通 量测序技术、生物信息学分析等。这些方法的应用使得分子生物学研究更加深 入和广泛。
阔前景。
下一代测序技术在分子生物学中应用
下一代测序技术原理
基于大规模并行测序的原理，一次可对数百万至数十亿个DNA分 子进行测序。
测序数据分析
包括序列比对、变异检测、基因表达量分析等，以揭示基因组的结 构和功能。
下一代测序技术的应用
在疾病诊断、个性化医疗、物种鉴定和进化生物学等领域发挥重要 作用。
非编码RNA与疾病关系
非编码RNA异常表达与多种疾病相关，如肿瘤、心血管疾 病等，可作为疾病诊断和治疗的新靶点。
非编码RNA研究前景
随着高通量测序技术和生物信息学发展，非编码RNA研究 将更加深入，为疾病防治提供新思路和新方法。
合成生物学在分子生物学中应用前景
合成生物学概念及研究范畴
合成生物学是一门新兴交叉学科，旨在通过设计和构造新的生物部件、系统和机器来理解 和操控自然生物系统。
RNA产物。
影响因素
包括DNA模板的序列和 结构、RNA聚合酶的活 性和选择性、转录因子
分子生物学实验 ppt课件
对每个收集管进行A280与酶活力定性测定
ppt课件
5
实验操作
第1次： 菌体超声破壁、离心、包涵体复性、装离子交换柱
实验顺序：超声破壁-->离心（洗涤，注意平衡）-->装柱 -->平衡-->包涵体溶解（2hr） -->复性-->测活
涉及单元实验：破壁、离心、装柱、复性、酶活测定 掌握要点：破壁原理
装离子交换柱方法 包涵体复性原理及方法 脂肪酶测活原理
5 注意留样!（上清0.5ml -20度保存） 注意标清组号！
6 登记测活数据（老师本子）
8 值日： A室、B室
（2组/次）
公用台物品不得挪用 桌面整齐 出席率-平时分！
冰箱分配 测活次序
上午定性测活！
ppt课件
11
ppt课件
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ppt课件
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实验二内容
• 对上一次制备的上清液（8ml）/2 进行离子交 换层析 • 样品活性分析及蛋白浓度测定 • 绘制纯化表 • 纯度分析 (蛋白电泳)
对硝基苯酚磷酸酯 p-NPP
O
O - Na+
O-
P O-
N a+
碱性磷酸酶
O H 对硝基苯酚
p-NP
NO2 NO2
以对硝基酚磷酸二钠为底物，根据水解磷酯键所产生的对 硝基酚量测定酶活力。在37℃、pH10.0条件下，每分钟转 化产生1μmol/L对硝基酚的酶量为1个酶单位
《分子生物学技术》课件
获取目标蛋白质的基因序列， 进行必要的克隆操作和序列分 析。
表达和纯化
将改造后的基因导入表达系统 ，表达并纯化目标蛋白质。
确定目标蛋白质
根据实际需求，选择需要改造 的蛋白质。
基因突变和改造
根据需要，对基因进行突变和 改造，以改变蛋白质的结构和 功能。
性能评估
对改造后的蛋白质进行性能评 估，包括结构和功能分析。
CHAPTER 03
蛋白质工程技术
蛋白质工程技术的定义与原理
蛋白质工程技术的定义
蛋白质工程技术是通过基因工程技术 对蛋白质进行改造，以达到改善或优 化蛋白质的特性和功能的一种技术手 段。
蛋白质工程技术的原理
基于基因工程技术，通过改变蛋白质 编码基因的序列，实现蛋白质结构和 功能的优化。
蛋白质工程技术的操作步骤
《分子生物学技术》 ppt课件
contents
目录
• 分子生物学技术概述 • 基因工程技术 • 蛋白质工程技术 • 基因组学技术 • 生物信息学技术
CHAPTER 01
分子生物学技术概述
定义与分类
定义
分子生物学技术是以分子为研究 基础，通过分析分子的结构、功 能和相互作用的科学方法。
分类
分子生物学技术包括基因工程技 术、蛋白质工程技术、基因组学 技术和生物信息学技术等。
详细描述：基因工程技术是一种利用重组DNA技术对生物体的遗传物质进行操作 的方法。其原理基于分子遗传学和生物化学的基本原理，通过人工设计和构建基 因表达载体，将外源基因导入受体细胞，实现基因的转移、表达和调控。
基因工程技术的操作步骤
总结词：全面解析
详细描述：基因工程技术主要包括目的基因的获取、基因表达载体的构建、将目的基因导入受体细胞、目的基因的表达与检 测等步骤。其中，基因表达载体的构建是整个技术的核心环节，涉及到限制性内切酶、DNA连接酶等工具酶的应用。
《分子生物学》PPT课件
复制起始时，母链即已解开，两股单链都 是模板，其作用是按碱基配对规律指引核 苷酸加入到新链。
每次加入的单个核苷酸，都是以dNTP为原 料，复制时子链从5’向3’延长。
复制延长速度相当快。E.coli每秒钟能加入 的核苷酸数达2500个。
复制的半不连续性和冈崎片段
在形成双螺旋结构时，DNA双链的走 向是相反的。复制经解链后，两股单链在 复制叉上也是走向相反。复制，包括引物 合成，只能从5′向3′延伸。而在同一复制叉 上，解链的方向只可能有一个。复制方向 与解链方向不一致，可以理解不连续复制 的成因。
四种碱基：腺嘌呤 （adenine，缩写为A） 胸腺嘧啶（thymine，缩写为T） 胞嘧啶（cytosine，缩写为C） 鸟嘌呤（guanine，缩写为G）
DNA分子是由两条脱氧核苷酸长链组成的。
DNA分子的结构特点是:
DNA分子是由两条链组成的，这两链按反 向平行方式盘旋成双螺旋结构。
复制的终止
原核生物基因是环状DNA，双向复制的 复制片段在复制的终止点(ter)处汇合。复制 的起始点和终止点刚好把环状DNA分为两 个半圆，两个方向各进行180，同时在终止 点汇合。
原核DNA聚合酶的种类:
有三种DNA聚合酶（I，II，III），可 进行5’→3’方向聚合和3’→5’外切酶活性逐 个切下核苷酸，聚合酶I和III还可从5’→3’ 切下核苷酸。聚合酶III是主要的DNA复制 酶，酶I填补引物去除后的缺口，而酶II与 酶I协作或作为其补充。
B.真核生物的DNA复制
真核生物每个染色体有多个起始点，是多 复制子复制。复制有时序性，即复制子以 分组方式激活而不是同步起动。
在复制叉及RNA引物生成后，DNA-polδ通 过PCNA的协同作用，逐步取代DNA-polα， 在引物的3’－OH基础上分别合成领头链和 随从链。复制子复制完成后，除去引物。
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实验一、菌株复壮与单菌落菌株的获取一、实验目的学习细菌培养的LB培养基及抗生素抗性筛选培养基的配制，掌握高压灭菌和获取细菌单菌落菌株两种基本实验操作技能。
二、实验材料、设备及试剂1、实验材料大肠杆菌（E. coli）DH5α菌株：R-，M-，Amp-2、实验设备恒温摇床，电热恒温培养箱，无菌工作台，高压灭菌锅3、试剂酵母浸膏，蛋白胨，氯化钠，琼脂，卡那霉素三、实验步骤液体LB（Luria-Bertain）培养基配方：蛋白胨(typtone) 1.0% （1 g/100 ml）酵母提取物(Yeast extraction)0.5% （0.5g/100 ml）氯化钠 1.0% （1 g/100 ml）PH 7.0固体LB培养基：每100 ml液体培养基中加入1.5g琼脂粉请按试剂瓶上的编号使用相应编号的药勺取药，防止药品相互污染！(1)每组按上述液体LB培养基配方，以配制100ml的量称取药品放入烧杯。
(2)用量筒量取约80 ml 蒸馏水注入烧杯中，玻棒搅拌使药品完全溶解后用100ml量筒定容至100ml。
(3)pH试纸检测pH值，并用1 N NaOH或1 N HCl调节pH值至7.0。
(4)将100ml溶液分装入两个三角瓶，每瓶为50ml。
(5)按固体培养基配方称取适量琼脂粉分别放入两个三角瓶中，以配制成两瓶50ml固体LB培养基。
(6)两个三角瓶分别用锡纸包扎瓶口。
并用记号笔在三角瓶上标注各组标记。
(7)把装有培养基三角瓶放入灭菌锅中，盖上锅盖，以对称方式拧紧锅盖，打开排气阀通电加热，至有连续的白色水蒸气从排气阀排出时，关闭排气阀。
当高压锅温度（气压）指示器指示锅内温度升高至121℃（0.1Mpa）时，调节电压（或利用手动开关电源的方式）使高压锅稳定在该温度（压力）下20 min，然后断开电源。
待指示器指示压力降为0时，方可打开排气阀，然后再打开锅盖小心取出锅内物品。
(8)取出三角瓶后，在酒精灯火焰旁进行下述操作。
(9)取其中的一瓶直接倒培养皿，每皿倒入的量以刚好能在培养皿底铺展成薄薄的一层即可。
每组倒1块培养皿，在皿盖上用记号笔写上“LB”及各组的标记。
(10)另外一瓶培养基待温度降低至60℃左右时（刚能感觉不烫手），向培养基中加入0.1ml50mg/ml的氨苄青霉素（Amp）溶液，使培养基中Amp的终浓度为50mg/L。
快速充分混匀后每组倒1块培养皿，在皿盖上标注“LB+”及各组的标记。
(11)接种环蘸取菌液，密密划线。
(12)倒置于37℃恒温培养箱中进行培养。
(13)一天后观察菌落。
四、思考题(1)在说明本实验所用的菌种时用到这样的符号：“R-，M-，Amp-”，这告诉我们关于该菌种的什么信息？(2)在步骤7中，为何须待连续的白色水蒸气从排气阀排出时才能关闭排气阀？当灭菌完毕，为何又须待高压锅指示器指示压力降为0时才能打开高压锅，而且操作次序必须是先打开排气阀然后才能打开高压锅盖？(3)在步骤12中，为何需将涂有菌的培养皿倒置于37℃恒温培养箱中进行菌的培养？为什么不是正放呢？(4)你预计该实验结果是什么，即两种培养基上菌的生长情况如何？实验二碱裂解法小量提取质粒DNA一实验目的了解少量质粒制备方法与原理，掌握碱法小量提取质粒DNA的操作步骤。
二实验原理本实验利用NaOH破坏菌体细胞使核酸物质从细胞中释放出来，因此称为碱裂解法抽提。
十二烷基磺酸钠(SDS)能裂解细菌细胞膜，但更重要的作用在于其与钾离子反应后所引起的溶液中绝大部分蛋白质以及基因组DNA共沉淀。
由于还有很多蛋白质不能被共沉淀掉，因此要进一步用酚、氯仿对溶液进行抽提。
最后加入2倍体积的无水乙醇或0.7倍体积的异丙醇沉淀就能得到质量稳定的质粒DNA。
从细菌中分离质粒DNA的方法主要包括3个基本步骤：培养细菌使质粒扩增；收集和裂解细胞；分离和纯化质粒DNA。
三实验材料转化质粒pUC19后经氨苄抗性筛选获得的E. coli DH5α系列菌株四实验设备微量取液器(100μl,1000μl)，台式高速离心机五试剂溶液Ⅰ：50 mmol/L 葡萄糖，25 mmol/L Tris.Cl (pH8.0)， 10mmol/L EDTA (pH8.0)。
溶液Ⅰ可成批配制,每瓶100ml,高压灭菌15分钟,储存于4℃冰箱。
溶液Ⅱ：0.2 mol/L NaOH 、1％ SDS (临用前用0.4mol/L NaOH和2％ SDS母液稀释)。
溶液Ⅲ：5 mol/L KAc 60ml，冰醋酸 11.5ml， H2O 28.5ml，定容至100ml, 并高压灭菌。
溶液终浓度为: K+ 3mol/L, Acˉ 5mol/L饱和酚、氯仿、TE缓冲液六实验步骤1. 用移液枪取1.5ml培养液放入1.5ml eppendorf管中，5000 rpm 5 min收集菌体；2. 弃上清,将管倒置于吸水纸上尽量使液体流尽；3. 菌体沉淀重悬浮于200μl溶液Ⅰ中；4. 按试剂配方配制溶液Ⅱ，加入新配制的溶液Ⅱ200μl, 盖紧管口，快速温和上下颠倒eppendorf管数次以混匀溶液(千万不要振荡，动作轻柔)；5. 立即加入200μl预冷的溶液Ⅲ，盖紧管口并温和颠倒离心管数次，混匀溶液，置冰浴中10分钟；6. 12000 rpm离心10分钟；7. 加入等体积的酚/氯仿(1:1)，颠倒混匀， 12000 rpm 10分钟；8. 小心吸取上清夜移入干净eppendorf管中，加入2倍体积的无水乙醇，振荡混匀后置于-20℃冰箱中20分钟；9. 12000 rpm离心10分钟；10. 弃上清, 将管倒置于吸水纸上使所有液体流出，加入200μl预冷的70％乙醇洗涤沉淀。
11. 同步骤10，重复洗涤沉淀一次；12. 弃去乙醇溶液，将管倒置于吸水纸上使液体流尽，室温或37℃下干燥；13、将沉淀溶于5μl TE缓冲液(pH8.0，含20μg /ml RNaseA)中，储于-20℃冰箱中。
[注意]1. 提取过程应尽量保持低温。
2. 提取质粒DNA过程中除去蛋白很重要,采用酚/氯仿去除蛋白效果较单独用酚或氯仿好。
最好在用酚/氯仿抽提一次后再用氯仿抽提一次，以去除残留的酚对质粒的后继实验，如酶切反应等的不良影响。
3. 沉淀DNA通常使用冰冷的无水乙醇,在低温条件下放置时间稍长可使DNA沉淀完全。
沉淀DNA也可用异丙醇，但由于常把盐沉淀下来，所以多数还是用乙醇。
4. 质粒DNA分子小，所以没有变性，染色体变性后不能复性。
5．用碱法分离质粒DNA时，染色体DNA之所以可以被除去，是因为：CA.染色体DNA断成了碎片B.染色体DNA分子量大，而不能释放C.染色体变性后来不及复性D.染色体未同蛋白质分开而沉淀七思考题1.溶液I中葡萄糖和EDTA各有什么作用？答：葡萄糖：增加溶液的粘度，维持渗透压，防止DNA受机械剪切力作用而降解。
EDTA：（1）螯合Mg2＋、Ca2＋等金属离子，抑制脱氧核糖核酸酶对DNA的降解作用（DNase作用时需要一定的金属离子作辅基）;（2）EDTA的存在，有利于溶菌酶的作用，因为溶菌酶的反应要求有较低的离子强度的环境。
2. 溶液II为何必需即用即配？答：NaOH溶液长时间配制存放会与空气中的CO2反应，降低PH值，影响对细胞的裂解作用。
3. 加入溶液II后作用时间不能长，需要快速加入溶液III中和碱性溶液。
如果溶液II的作用时间过长或者反应过于激烈会导致什么后果？答：作用时间过长会使细菌的基因组DNA被打断，从而不能被彻底沉淀除去，影响质粒DNA的纯度。
4. 在变性蛋白质的过程中，为何必须注意不要将酚残留在上清液中？答：残留的酚对核酸酶具有抑制作用，因而会影响后面质粒DNA的酶切反应。
5. 最后DNA沉淀可以溶解在双蒸水（ddH2O）中，但最好溶解于TE缓冲液中，为何？答：由于缓冲液是TrisH+/Tris，不存在金属离子的干扰作用，故在提取或保存DNA时，大都采用Tris-HCl 系统，而TE缓冲液中的EDTA更能稳定DNA的活性。
\实验三琼脂糖凝胶电泳检测质粒DNA一、实验目的：学习琼脂糖凝胶电泳检测DNA的方法和技术，了解质粒DNA电泳条带的多态性二、实验原理DNA分子在琼脂糖凝胶中时有电荷效应和分子筛效应。
DNA分子在高于等电点的溶液中带负电荷，在电场中向正极移动。
在一定的电场强度下, DNA分子的迁移速度取决于分子筛效应.具有不同的相对分子质量的DNA片段泳动速度不一样,可进行分离.凝胶电泳不仅可分离不同分子质量的DNA, 也可以分离相对分子质量相同,但构型不同的DNA 分子。
在细菌细胞内,共价闭环质粒以超螺旋形式存在。
在提取质粒过程中，除了超螺旋DNA外，还会产生其它形式的质粒DNA。
如果质粒DNA两条链中有一条链发生一处或多处断裂,分子就能旋转而消除链的张力,形成松驰型的环状分子,称开环DNA(Open circular DNA, 简称 ocDNA)；如果质粒DNA的两条链在同一处断裂,则形成线状DNA(Linear DNA)。
当提取的质粒DNA电泳时,同一质粒DNA其超螺旋形式的泳动速度要比开环和线状分子的泳动速度快，开环与线状分子的泳动亦有差异，于是在电泳时会产生三个条带的现象。
三、试剂与仪器设备：1. 质粒DNA2. 琼脂糖3. 6×载样buffer 0.25% 二甲苯青FF，0.25% 溴酚蓝，30% 甘油4．50×TAE 电泳Buffer 12.2g Tris，2.85ml 冰醋酸，10ml 0.25 mol/L EDTA(pH8.0)，加水至50ml。
5．溴化乙锭(EB)溶液10mg/ml(避光保存)，每100ml琼脂糖凝胶加5μl贮存液，即凝胶中EB终浓度为0.5μg/ml，此试剂为强致癌物，要戴手套操作，避免污染环境。
6. DNA Marker：共6条带，2000bp、1000bp、750bp、500bp、250bp、100bp。
上样6ul时750bp的带约为100ng，其余带约为50ng7．各种国产移液器(10，20，100μl)8．消毒的tips枪头9．水平电泳槽和电泳仪四、实验步骤1、胶液的制备：称取0.4g琼脂糖,置于锥形瓶中,加入50ml 1×TAE稀释缓冲液,放电炉上加热至琼脂糖全部熔化,取出摇匀,此为0.8％琼脂糖凝胶液。
加热过程中要不时摇动,使附于瓶壁上的琼脂糖颗粒进入溶液。
加热时应盖上封口膜,以减少水份蒸发。
2、胶板的制备：将有机玻璃胶槽两端分别用挡板隔出需要制胶的空间，将胶槽置于水平支持物上,插上样品梳子,注意观察梳子齿下缘应与胶槽底面保持1mm左右的间隙。
用移液器吸取少量融化的琼脂糖凝胶封挡板内侧,待琼脂糖溶液凝固后将剩余的琼脂糖小心地倒入胶槽内,使胶液形成均匀的胶层。