基因功能分析的基本策略资料
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转入的外源基因要能够高效表达，最好是 可以诱导表达。 转入基因中应该包含有帮助提高整合效率 的序列，如微卫星序列。
微卫星序列
诱导表达 启动子
外源基因
微卫星序列
2) 胚胎干细胞法
胚胎干细胞(embryo stem cells, ES 细胞)： 可人工培养增殖的小鼠胚泡发育期胚胎细 胞，当把这种胚胎细胞重新导入另一胚泡 期的胚胎之后，它仍然保持着分化成其他 类型细胞的能力。 ES 细胞具有与胚胎细胞相似的形态特征和分 化特性。
DNA
磷酸钙-DNA 共沉淀法 逆转录病毒感染法 电穿孔法
胚胎干细胞
微注射
囊胚
原囊胚
转基因动物
外源 DNA 的整合
用于 ES 细胞的 DNA 载体一般带有定点整
合元件, 避免了随机整合。
定点整合位点应选择在基因组内编码非必
需产物的地方，以减少整合对细胞正常功 能的影响。
定点整合位点必须在基因组的可以进行转
染色体基因水平：是否整合了外源基因以
及整合的位点和拷贝数。
转录水平：转基因的 mRNA 的存在与否以
及表达水平。
蛋白水平：转基因的蛋白质的表达以及功
能检测。
鉴定方法
PCR
Southern blot
染色体原位杂交 Northern blot RT-PCR Western blot
基因导入技术：物理、化学和生物学方法
1) 显微注射法 （microinjection)
2) 胚胎干细胞法（embryonic stem cells, ES 细胞） 3) 逆转录病毒感染法
4) 精子载体法
1) DNA显微注射法
制备超量受精卵。 DNA 显微注射。 转移注射卵到输卵管或子宫。 转基因鼠的鉴定及鼠系建立。
检测的提示重组体存在的基因。GFP、 LacZ、AP、 LUC。
融合基因 (fusion gene): 将特定的目的基因与报告
基因拼接成融合基因，并与顺式作用元件拼接成完 整的转录单位。
动物转基因常用的载体
腺病毒载体 逆转录病毒载体 非病毒类载体：如质粒等。
2. 中游—基因转移、胚胎移植与建系
一.转基因生物的意义
20 世纪 80 年代 (Brinster and Palmiter)： 著名的转基因小鼠实验，金属硫蛋白基 因启动子驱动大鼠生长激素基因表达。 转基因生物的用途： 研究手段：疾病的转基因动物模型。 改良动物性状：抗病性、耐寒性等。 生产产品：抗体、疫苗等的生产。
二、基本原理
第十二章
基因功能分析的基本策略
转基因模型是研究基因功能的主要手段
转基因生物： 外源基因导入生物体表达。 基因打靶： 外源基因替换内源基因。 基因敲除。 基因敲入。 基因沉默： 导入特定基因，抑制内源性基因表达。
第一节 转基因技术
转基因技术(transgenic technology)：将外源 基因导入细胞，随机整合到受体基因组内， 并随细胞分裂而遗传给后代。 细胞模型。 转基因动物。 转基因植物。
构建携带目的基因的载体。 外源基因导入：将目的基因通过显微注射等 方法注入实验动物的受精卵或着床前的胚胎 细胞中。 使目的基因整合到基因组中。 将此受精卵或着床前的胚胎细胞再植入受体 动物的输卵管或子宫中。 使其发育成携带外源基因的转基因动物。
基本原理
供体基因
受体的受精卵
基本原理
转基因的受精卵
4）精子载体法
外源 DNA 共育法 脂质体转染法
电穿孔法 精子 卵细胞 受精卵 转基因动物
DNA
DNA
磷酸钙-DNA共沉淀法 逆转录病毒感染法
电穿孔法
精子 卵细胞
受精卵 显微注射 四细胞 胚胎
胚胎干细胞
微注射 囊胚 转基因 动物
原肠胚
DNA
逆转录病毒感染 DNA
3. 下游—基因整合与表达检测及筛选
包装细胞与早期胚胎共培养
wk.baidu.com
感染后的胚胎植入受体动物子宫，发育
成携带外源基因的动物。
逆转录病毒感染法
外源基因 逆转录病毒载体
四/八细胞胚胎/囊胚/原肠胚
逆转录病毒感染
纯合体小鼠
嵌合小鼠
逆转录病毒感染法的特点
通过病毒 DNA 插入宿主 DNA 的机制，将 外源目的基因整合到宿主基因组，整合效率 高。 反转录病毒载体容量有限，只能转移小片段 DNA(＜10kb)。 对家禽类的转基因研究有重要意义。
DNA 大小无限制，最大可达 250Kb。 随机整合：在染色体上整合的位点是随
机的，整合的拷贝数也不一定。
转入的基因有可能碰巧整合到具有重
要功能的基因之中，干扰该基因的正 常表达，影响转基因动物的正常发育 和代谢。
总效率较低(实际成功率1/1000)。
提高显微注射 DNA 表达的成功率
胚胎干细胞法
分离和培养 ES 细胞。 外源基因导入 ES 细胞。 导入外源基因的 ES 细胞的子宫转移。 转基因鼠的鉴定及鼠系建立。
胚胎干细胞的分离和培养
胚胎干细胞 胚泡 培养皿中分离 胚泡内层细胞
加饲养层细胞培养
胰蛋白酶 消化解离
胚胎干细胞的分离和培养
胚胎干细胞外源 DNA 的导入
录的地方。
胚胎干细胞法的特点
定点整合。
ES 细胞在体外培养，外源 DNA 导入后可
用正-负选择法筛选择正确整合的 ES 细胞, 相对较简单。
目前只在小鼠身上获得成功。
3）逆转录病毒感染法
逆转录病毒载体的构建
获得四/八细胞胚胎/囊胚/原肠胚 外源 DNA 导入早期胚胎：
获得病毒颗粒感染早期胚胎
DNA 显微注射
DNA注射针
精原核 卵原核
持卵管
DNA 显微注射
DNA 显微注射到尚未发生核融合的受精卵 的精原核。显微镜下观察，精原核比卵原 核大，容易辨别。
线性 DNA 整合效率比超螺旋 DNA 高出数 倍，因而用于显微注射的转入基因通常是 去除载体序列的线状 DNA。
DNA 显微注射法的特点
基本原理
转基因动物
基本过程
上游—基因改造和载体构建
中游—基因转移、胚胎移植与建系 下游—基因整合、表达的检测与细胞筛选
1. 上游—基因改造和载体构建
外源基因: 完整的转录单位, 由顺式作用元件、结构
基因和转录终止信号组成。
报告基因 (reporter gene) : 在表达载体中引入易于
微卫星序列
诱导表达 启动子
外源基因
微卫星序列
2) 胚胎干细胞法
胚胎干细胞(embryo stem cells, ES 细胞)： 可人工培养增殖的小鼠胚泡发育期胚胎细 胞，当把这种胚胎细胞重新导入另一胚泡 期的胚胎之后，它仍然保持着分化成其他 类型细胞的能力。 ES 细胞具有与胚胎细胞相似的形态特征和分 化特性。
DNA
磷酸钙-DNA 共沉淀法 逆转录病毒感染法 电穿孔法
胚胎干细胞
微注射
囊胚
原囊胚
转基因动物
外源 DNA 的整合
用于 ES 细胞的 DNA 载体一般带有定点整
合元件, 避免了随机整合。
定点整合位点应选择在基因组内编码非必
需产物的地方，以减少整合对细胞正常功 能的影响。
定点整合位点必须在基因组的可以进行转
染色体基因水平：是否整合了外源基因以
及整合的位点和拷贝数。
转录水平：转基因的 mRNA 的存在与否以
及表达水平。
蛋白水平：转基因的蛋白质的表达以及功
能检测。
鉴定方法
PCR
Southern blot
染色体原位杂交 Northern blot RT-PCR Western blot
基因导入技术：物理、化学和生物学方法
1) 显微注射法 （microinjection)
2) 胚胎干细胞法（embryonic stem cells, ES 细胞） 3) 逆转录病毒感染法
4) 精子载体法
1) DNA显微注射法
制备超量受精卵。 DNA 显微注射。 转移注射卵到输卵管或子宫。 转基因鼠的鉴定及鼠系建立。
检测的提示重组体存在的基因。GFP、 LacZ、AP、 LUC。
融合基因 (fusion gene): 将特定的目的基因与报告
基因拼接成融合基因，并与顺式作用元件拼接成完 整的转录单位。
动物转基因常用的载体
腺病毒载体 逆转录病毒载体 非病毒类载体：如质粒等。
2. 中游—基因转移、胚胎移植与建系
一.转基因生物的意义
20 世纪 80 年代 (Brinster and Palmiter)： 著名的转基因小鼠实验，金属硫蛋白基 因启动子驱动大鼠生长激素基因表达。 转基因生物的用途： 研究手段：疾病的转基因动物模型。 改良动物性状：抗病性、耐寒性等。 生产产品：抗体、疫苗等的生产。
二、基本原理
第十二章
基因功能分析的基本策略
转基因模型是研究基因功能的主要手段
转基因生物： 外源基因导入生物体表达。 基因打靶： 外源基因替换内源基因。 基因敲除。 基因敲入。 基因沉默： 导入特定基因，抑制内源性基因表达。
第一节 转基因技术
转基因技术(transgenic technology)：将外源 基因导入细胞，随机整合到受体基因组内， 并随细胞分裂而遗传给后代。 细胞模型。 转基因动物。 转基因植物。
构建携带目的基因的载体。 外源基因导入：将目的基因通过显微注射等 方法注入实验动物的受精卵或着床前的胚胎 细胞中。 使目的基因整合到基因组中。 将此受精卵或着床前的胚胎细胞再植入受体 动物的输卵管或子宫中。 使其发育成携带外源基因的转基因动物。
基本原理
供体基因
受体的受精卵
基本原理
转基因的受精卵
4）精子载体法
外源 DNA 共育法 脂质体转染法
电穿孔法 精子 卵细胞 受精卵 转基因动物
DNA
DNA
磷酸钙-DNA共沉淀法 逆转录病毒感染法
电穿孔法
精子 卵细胞
受精卵 显微注射 四细胞 胚胎
胚胎干细胞
微注射 囊胚 转基因 动物
原肠胚
DNA
逆转录病毒感染 DNA
3. 下游—基因整合与表达检测及筛选
包装细胞与早期胚胎共培养
wk.baidu.com
感染后的胚胎植入受体动物子宫，发育
成携带外源基因的动物。
逆转录病毒感染法
外源基因 逆转录病毒载体
四/八细胞胚胎/囊胚/原肠胚
逆转录病毒感染
纯合体小鼠
嵌合小鼠
逆转录病毒感染法的特点
通过病毒 DNA 插入宿主 DNA 的机制，将 外源目的基因整合到宿主基因组，整合效率 高。 反转录病毒载体容量有限，只能转移小片段 DNA(＜10kb)。 对家禽类的转基因研究有重要意义。
DNA 大小无限制，最大可达 250Kb。 随机整合：在染色体上整合的位点是随
机的，整合的拷贝数也不一定。
转入的基因有可能碰巧整合到具有重
要功能的基因之中，干扰该基因的正 常表达，影响转基因动物的正常发育 和代谢。
总效率较低(实际成功率1/1000)。
提高显微注射 DNA 表达的成功率
胚胎干细胞法
分离和培养 ES 细胞。 外源基因导入 ES 细胞。 导入外源基因的 ES 细胞的子宫转移。 转基因鼠的鉴定及鼠系建立。
胚胎干细胞的分离和培养
胚胎干细胞 胚泡 培养皿中分离 胚泡内层细胞
加饲养层细胞培养
胰蛋白酶 消化解离
胚胎干细胞的分离和培养
胚胎干细胞外源 DNA 的导入
录的地方。
胚胎干细胞法的特点
定点整合。
ES 细胞在体外培养，外源 DNA 导入后可
用正-负选择法筛选择正确整合的 ES 细胞, 相对较简单。
目前只在小鼠身上获得成功。
3）逆转录病毒感染法
逆转录病毒载体的构建
获得四/八细胞胚胎/囊胚/原肠胚 外源 DNA 导入早期胚胎：
获得病毒颗粒感染早期胚胎
DNA 显微注射
DNA注射针
精原核 卵原核
持卵管
DNA 显微注射
DNA 显微注射到尚未发生核融合的受精卵 的精原核。显微镜下观察，精原核比卵原 核大，容易辨别。
线性 DNA 整合效率比超螺旋 DNA 高出数 倍，因而用于显微注射的转入基因通常是 去除载体序列的线状 DNA。
DNA 显微注射法的特点
基本原理
转基因动物
基本过程
上游—基因改造和载体构建
中游—基因转移、胚胎移植与建系 下游—基因整合、表达的检测与细胞筛选
1. 上游—基因改造和载体构建
外源基因: 完整的转录单位, 由顺式作用元件、结构
基因和转录终止信号组成。
报告基因 (reporter gene) : 在表达载体中引入易于