亚细胞器分离纯化技术的发展

表! 沉淀 0$ 0% 0& 0) 02 01 离心力 （ +） , 时间 （-./） 差速离心各沉淀的组分% 沉淀成分
重线粒体， 质膜大片 $’’’ , $’ 核， 质膜片 &’’’ , $’ 重线粒体， 1’’’ , $’ $’’’’ , $’ %’’’’ , $’ $’’’’’ , $’ 线粒体， 溶酶体， 过氧化物酶体， 完整高 尔基体 线粒体， 溶酶体， 过氧化物酶体， 高尔基 体膜 溶酶体， 过氧化物酶体， 高尔基体膜， 大 颗粒 （如粗面内质网） 来自内质网的囊泡， 质膜， 高尔基体， 内 涵体等
3= （ 5,(. 6,6+7)(, 87)9:;<(. ） 、 线 粒 体3> 、 过氧化物酶 31 3? @ 42 体 、 囊泡 等。
! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! !
&
! "!
一般分离流程
免疫磁珠 $’()*+,)- / 0 122 （ 以 -’()* 公司专门 为分离纯化细胞器或亚细胞结构而设计的 / 0 122 为例） 是一种大小均一、 具有超顺磁性、 表面光滑的 聚苯乙烯珠子32 。其表面被 A 0 甲苯 0 磺酰氯活化 可提供活性基团以共价结合抗体或其他配体。在大 部分的亚细胞器分离中， 最好先将一种连接型二抗 与磁珠结合。这有利于特异性一抗的正确定位。尽 管有多种类型的二抗可供选择， 但最好使用 B, 结合 的抗体， 例如抗小鼠 *CD 的单克隆或多克隆抗体。二抗 必须经过亲和纯化， 不包含任何稳定剂 （例如蔗糖） 和 可与珠子相结合的蛋白。一抗若是多克隆， 必须经过 亲和纯化以确保珠子表面结合的特异性抗体的密度。 对于免疫分离技术来说， 特异性抗体的选择非常关键。 抗体必须能够特异识别并且能够到达位于靶细胞器上 的抗原表位。如果抗原表位被包埋在细胞器的内部， 则与磁珠相结合的抗体可能就很难达到。因而免疫分 离具有直接和间接两种方法 （见图 3） 。 若抗原表位位于靶细胞器的表面， 通常采用直 接法， 即将特异性抗体直接与磁珠或包被有二抗的 磁珠相结合， 然后再加入待分离的细胞粗提物进行 亲和纯化。直接法的分离速度和效率相对来说较 好。但若抗原表位被包埋在内部， 则更适于使用间 接法。即特异性抗体先与待纯化的细胞粗提物混 合， 然后再加入包被有二抗的磁珠， 将抗体E靶细胞 器复合物进行免疫分离。在间接法中有一点很重 要， 即抗体与靶细胞器结合后， 要通过密度梯度离心 =
! 亲和纯化"免疫磁珠纯化分离法
! "# 技术背景 在生物体内， 许多大分子具有与某些相对应的 专一分子可逆结合的特性。例如抗原和抗体、 酶和 底物及辅酶、 激素和受体、 !"# 和其互补的 $"# 等 （两个进行专一结合的分子互称对方为配基） 。生物 分子之间这种特异的结合能力称为亲和力， 亲和纯 化就是利用这种配基之间的亲和吸附和解吸附原 理， 最终实现细胞器的分离。许多高分子材料， 例如 琼脂糖凝胶等， 以及与这些高分子骨架相结合的磁 性纳米材料 （磁性微球） 可作为亲和纯化的固相介 质。 随着越来越多的亚细胞器的标志性蛋白的发 现， 亲和纯化技术逐渐得到更为广泛的应用。免疫
表! 细胞器 细胞核 质膜大片 线粒体 溶酶体 过氧化物酶体 高尔基体 差速离心沉淀 ’9 ’9 5 匀浆液 ’9 ’6 ’6 ? ’< ? ’/ 匀浆液 ’/ ? ’; ’/ ? ’; ’/ ? ’; ’/ ? ’; ’/ ? ’; 光滑 5 粗面 内质网 核膜 线粒体外膜 ’3 ’9 ’6
二〇〇五年 ・ 第二期
是可以一次性对大量的细胞或组织粗提液进行分离 纯化， 并将其富集浓缩成较小的体积以适应后续的 分析研究。 但由于离心分离法仅仅依靠各细胞器的大小， 密度或沉降系数等物理特性来达到分离纯化的目 的， 因而具有一定的局限性。具体表现在， 第一， 无 法将具有相似密度、 大小的不同细胞器分离开来。 例如微粒体和过氧化物酶体等 。因而通过密度梯
! &!
现代仪器
组分 “颗粒” 在梯度液中沉降速率的差别， 而在离心 的某一时刻形成了数个含有单一组分颗粒的区带。 样品在离心后与梯度液一起收集， 用常规技术去除 梯度后就得到某个较纯的成分。每个单一组分的沉 降速率取决于它们的形状、 尺寸、 密度、 离心力的大 小、 梯度液的密度和粘性系数。与速率 ! 区带离心 法不同的是， 等密度离心是依赖于样品颗粒的不同 密度来进行离心分离的。混合样品可以铺在梯度液 之上， 也可以置于梯度液之下， 甚至和梯度液混在一 起。在离心过程中由于样品各单一成分向各自的等 密度区靠拢即达到了分离纯化的目的。 现在有多种介质可用作密度梯度材料， 例如蔗 糖， "#$%&&， ’()$%&& *+$%,(-. 等。对于大多数密度梯度 离心， 蔗糖是比较合适的梯度材料。尽管它在高密
%
磁珠作为亲和纯化固相介质具有其独特的优点。它 具有超顺磁性， 可通过抗体与靶细胞器特异性结合 并使之具有磁响应性。将免疫磁珠与待分离的混合 物共同孵育， 免疫磁珠就可通过抗原抗体反应选择 性地与靶细胞器物质结合， 当此复合物通过一个磁 场装置时， 与免疫磁珠结合的靶细胞器就会被磁场 滞留， 从而与其他复杂物质分离开来 。
贺 （北京师范大学 摘 要 芳 何大澄 北京 !""#$%） 本文就亚细胞器分离纯化的传统方式— — —密度梯度离心， 以及新方法— — —亲和 高等学校蛋白质组学研究院
纯化， 特别是免疫磁珠纯化技术进行概述和评价， 并进一步表明两种提取方法相结合， 更 有利于同时满足产量、 纯度两方面的要求。 关键词 亚细胞器分离纯化技术 密度梯度离心 亲和纯化 免疫磁珠
度 （/01 2 301 4 5 4） 时粘性系数较大， 但综合比较 表明它可以广泛使用。不过由于蔗糖在各种密度时 有较高的渗透性， 分离一些对渗透性敏感的生物组 分时需要选择其他梯度材料。 至于密度梯度的制备， 有自形成和预形成两种 方式。对于自形成梯度， 可以将被分离的样品和梯 度材料混合在一起离心， 梯度材料在离心过程中形 成密度梯度， 而样品中不同组分则沉降 （或上浮） 到 它们自己的等密度区。这种方式有较大的样品容 积。预形成梯度可以是连续的， 也可以是不连续的。 这种方法的优点是离心时间较短， 但相对自形成梯 度来说， 被分离样品的容积较小。根据以往文献报 道， 分离纯化各种亚细胞器推荐使用的密度梯度介 质 以及离心条件 （见表 6） 。
3
度离心得到的某些亚细胞器可能只具有中等纯度， 可能只适合进行某些功能方面的研究， 若要进行进 万方数据 6
二〇〇五年 ・ 第二期
综述与专论
附很快地与磁性微球结合， 如果微球表面有活性基 团， 则接下来就会通过较慢的化学反应共价结合在 磁性微球的表面。 用于细胞分离的免疫磁性微球应具备以下条 件： 化学性能稳定， 不产生凝聚； 不与细胞发生非特 异性的结合； 磁性微球与抗体的结合牢固； 磁性微球 的大小均匀， 磁响应性好， 磁性纳米材料的含量均匀 一致； 磁性微球大小适当， 对于较小的细胞器的我们 宜选择较大的磁珠， 以确保两者之间的相互作用更 为牢固。目前免疫磁珠产品中， $’()* 公司的一系列 磁珠 （例如 $’()+,)-. / 0 122 等， 具有的不同活性表 面） 可以用于亚细胞器分离32 。 迄今为止， 利用免疫磁珠进行亚细胞器的纯化 的方法已经被许多研究者广泛采用， 这些被纯化的 亚细胞器包括高尔基体33 、 肾小珠34 、 晶状体膜片断
二〇〇五年 ・ 第二期
综述与专论
! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! !
亚细胞器分离纯化技术的发展
引言
亚细胞结构分离纯化技术是细胞生物学研究中 的重要方法。它常常是研究某一细胞器超微结构， 生 化组成以及特定功能的前提和基础。在体外功能研 究中， 分离纯化得到的亚细胞器是否还具有生物学活 性是实验的关键。只有获得有活性的亚细胞结构才 能成功构建无细胞体系， 从而在体外对一些复杂的生 物学过程进行模拟研究。现在已成功构建一些无细 胞体系， 用于研究包括 !"# 复制和转录， 蛋白转运， 纺垂体组装， 蛋白合成等复杂的生物机制$。在生化 分析中， 只有分离纯化得到一定数量的， 并且纯度较 高的亚细胞器才能保证后续的研究。尤其在蛋白质 组学的研究中， 建立相应的亚细胞器蛋白质组数据库 就要确保用于电泳或色谱分离的亚细胞器具有相当 的纯度。现在随着一些亚细胞器分离技术的成熟和 发展， 已有一些亚细胞器的蛋白质组学研究的较为深 入， 例如线粒体蛋白质组学等%， 也有一些亚细胞器的 蛋白质组学获得突破性进展， 例如中心体蛋白质组学 等&。密度梯度离心是传统的亚细胞器分离纯化的方 式， 随着现代工业的进步， 离心机技术取得长足的发 展， 各种生物体组分的离心分离方法得到迅速推广和 应用。通过密度梯度离心可以一次性分离大量样品， 但由于仅依据细胞器的物理特性， 所以分离出来的样 品的纯度有限。另一类亚细胞器分离纯化方法是亲 和纯化， 尤其是近年来发展的免疫磁珠纯化分离方 法， 通过抗原抗体的特异反应， 可以分离得到纯度非 常高的亚细胞器， 但亲和纯化一次性所能分离的样品 量较少。因此将两种提取方法有机结合， 将可能同时 满足产量、 纯度等方面的要求。
是最常用的实验手段。根据亚细胞器的大小、 密度、 形状、 沉降系数等物理特性， 通过一系列的差分离心 结合各种形式的密度梯度离心可以分离和纯化各种 亚细胞器。最近 %’ 年来离心机的性能都有很大提 高， 相关硬件， 例如设备驱动器、 转头、 电子、 电器控 制、 制冷系统、 整机配置及附件等方面都有长足进步。 %’ 世纪 (’ 年代以来计算机开始被用于离心过程的模 拟， 以及通过离心技术的数学分析来探知各种生物样 品的沉降过程)。离心方法， 包括差分离心法、 速度 * 区带密度梯度离心法、 等密度离心法以及分析离心的 沉降速度法、 沉降平衡法 * 包括纹影光学系统、 干涉 光学系统， 吸收扫描光学系统等日臻完善。 ! &’ 一般分离过程 在选用合理的方法对细胞或组织进行破碎后， 首先要进行差速离心 ， 即根据不同离心速度所产生 的不同离心力， 将各种亚细胞组分和各种颗粒分离 开来。各细胞器典型的差速离心顺序 （见表 $） 。经