第十章 遗传重组(要1)

二、RecA和Holliday连接体的形成
RecA具有两种相当不同的活性:


RecA可以促进单链DNA 与其在双链DNA 分子中互补的DNA 链的碱基相配对。 RecA还可以在SOS 反应中激活蛋白酶。 RecA 需要单链DNA和 ATP才能激活蛋白酶。

RecA能够利用由RecBCD在Chi位点附近切 割所释放的单链3’末端。 RecA的DNA操作酶活性可以使一个单链 DNA与双螺.旋中的同源序列发生臵换，这 一反应被称为单链摄取(single-strand uptake) 或单链同化(single-strand assimilation)。
第三节 大肠杆菌重组的分子基础


在分子水平上，重组事件发生的先后顺序 是相似的：从一个已断裂的分子中产生的 单链与其对应的双螺旋发生作用，配对区 间扩展，重组中间体形成直到核酸内切酶 解离此两个双螺旋分子。 识别反应是重组机制的不可分割的重要部 分，并且只涉及到DNA分子的特定区域而 不是整个完整的染色体。


切除反应发生在原噬菌体两端的attL和attR 之间，产物为λ噬菌体环状DNA和细菌染色 体DNA。催化切除反应的除了Int和IHF外， 还需要一种叫做切除酶（exicisionase, Xis） 的蛋白参加，该酶由λ噬菌体的cis基因编码。 Xis对控制反应方向起重要作用，它是切除 反应所需要的，但却抑制整合反应。

两个DNA分子的链之间互补的碱基配对确 保重组只发生在同样的基因座之间。

在该部位两个双链DNA分子通过链之间互 补的碱基配对被维系在一起称为联会。
（3）重组酶


参与重组反应的酶保证重组的顺利进行。 重组过程中，每个分子的链首先断裂， 然后进行修复和连接，两个DNA分子之 间发生交换。重组完成后，重组分子的 解离和释放等过程均是在酶催化下进行 的。

Holliday连接体形成以后，就会产生异构 化然后拆分。

单链侵入模型中，异源双链首先只在两 个DNA分子中的一个形成。Holliday中 间体形成以后通过支链迁移能够在另一 个DNA分子上产生异源双链，这样就解 释了异源双链是如何形成的。
双链断裂修复模型



目前证明通过两个DNA分子之中的一个双链 断裂引发重组是个常见的机制。 该模型认为参与重组的两个DNA分子之一的 两条链被核酸内切酶切断，然后在核酸外切 酶作用下产生3’单链黏性末端。 两个3’游离末端之一侵入到另一个双螺旋的 同源区，臵换“供体”双螺旋的一个单链而 形成一段异源双链DNA，并同时产生一个D 环（D-loop）。



整合反应由λ噬菌体int基因的产物整合酶 （integrase, Int）催化。Int是一种DNA结 合蛋白，对POP ’ 序列有强的亲和力。 整合反应还需要一种有大肠杆菌编码的一 种细菌蛋白，称为整合宿主因子IHF (integration host factor, IHF) 。 Int和IHF可以在体外进行位点特异性重组。
（4）异源双链区的形成

同源性重组时，在两个DNA分子之间互补 碱基配对的区域称为异源双链区 （heteroduplex region）。

两个DNA分子通过一段异源DNA双螺旋共 价相互连接。
二、同源性重组的分子模型

第一个被广泛接受的重组模型是1964年由 Robin Holliday提出的Holliday模型。 即将发生重组的两个DNA分子同一个部位 的两个单链的断裂，从而引发重组。 两个断裂单链的游离端彼此交换，形成两 个异源双链，然后末端连接形成Holliday连 接体（Holliday Junction）。

第四节 位点特异性重组

位点特异性重组发生在特殊序列对之间， 这一重组型式最早是在λ噬菌体的遗传学研 究中发现的。 λ噬菌体有两种存在型式：裂解状态和溶源 状态。两种类型间的转换是通过位点特异 性重组实现的。
进入溶源状态，游离的 DNA必须整合 （intergrate）到细菌DNA中去；而为了从溶 源状态向裂解状态转化，原噬菌体DNA则必 须从细菌染色体DNA上切除（excise）。 整合和切除均通过细菌DNA 和λDNA上特定 位点—附着点（attachment site，att）之间的 重组而实现。
第十章

基因重组
基因组的可变性和稳定性之间必须维持 一个恰到好处的平衡，这样才能使生物 体得以生存并能世代相传，繁衍不息。 染色体的遗传差异主要由两种 机制产生， 一种是突变，一种是遗传重组。


所谓遗传重组指的是遗传物质的重新组合， 其共有的特征是DNA双螺旋之间的遗传物质 发生交换。遗传重组的存在确保了遗传物质 代与代之间基因组的重排，从而形成一个物 种内部个体之间的遗传差异。

遗传重组不仅仅发生于代与代之间，一个个 体的基因组也可以发生重排。重组不只是在 减数分裂和体细胞核基因中发生，也在线粒 体基因间和叶绿体基因间发生。
遗传重组的证明
突变和重组是提供进化起始物质的两个 过程。

突变引起的遗传改变能引起蛋白质中氨 基酸序列的变化，该变化引起表型的改 变，通过自然选择发生作用。 重组提供一个基因组结构的变化，也会 引起表型的变化，也通过自然选择发挥 作用。
RuvAB蛋白复合体可以使支链以10～20 bp 的速度迁移。


第三个基因ruv C编码一种能够特异性地识别 Holliday连接体的核酸内切酶，此酶可以在 体外切断此种交叉而拆分重组中间体。 一个含4个碱基的序列提供了Ruv C拆分 Holliday连接体的热点。这一序列决定了拆 分过程中哪一对DNA链被切断，从而决定发 生的是补丁型重组（patch recombination）还 是剪接型重组（splice recombination）。


D环在DNA聚合酶的作用下修补而扩展， 直至D环的长度与“受体”DNA双螺旋缺 口长度相当，互补的两条单链退火。此时 在缺口的两侧各有一段异源双链DNA，两 个杂合双螺旋之间为断裂的缺口，并且此 缺口为供体DNA序列所填充。 缺口处双链的完整性可以被以缺口3’端为 起始的修补合成来修复。缺口是被两次单 链DNA的合成而修复的。


Holliday认为在DNA分子上存在某些位点， 特殊的引发重组的酶能够识别这些位点， 确保两条链在相同的部位被切断。 目前还没有足够的证据证明这些位点的 存在。

单链侵入模型

单链侵入模型是对Holliday模型的修改。 在该模型中，两个DNA分子中的一个单链 在随机部位被切断，然后暴露的末端侵入到 另一个双链DNA分子，发现它的互补序列 以后将替代与它相同的链。然后DNA聚合 酶将用留下的那条链作为模板，填充上侵入 链所留下的缺口。被替代的链被降解，它的 残留末端与另一分子中新合成的DNA链相 连接形成Holliday连接体。


异常重组按其机制主要分为两类：末端 连接（end-joining）和链滑动（strandslippage）。
末端连接是指断裂的DNA末端彼此相连。 链滑动是指DNA复制时，由一个模板跳 跃到另一个模板所引起的重组。



许多DNA序列都可发生上述两类的异 常重组，这直接威胁着基因组的完整 性，但同时也是进化的重要途径。

整合和切除反应所需要识别的序列对不相 同。整合要求对attB 和attP之间进行识别， 但切除要求对attL和attR识别。因此位点特 异性重组的方向性特征由重组位点的特征 所控制。
整合和切除反应皆需Int和IHF蛋白。

λ噬菌体DNA的整合机制



λDNA的整合涉及到attB 和attP的核心序列 DNA链的割裂和重接。 首先在attB 和attP位点上产生同样的交错切 口，形成了5’-OH和3’-P的末端。5’单链区 全长7个碱基。两个核心区的断裂完全相同， 连接过程不需要任何新DNA的合成。 在整合反应中，互补的单链末端交互杂和， 连接并完成整合过程。

异常重组能够产生许多不同的结果， 例如移码、缺失、倒位、融合和DNA 扩增。
一、 chi位点和RecBCD核酸酶

在λ噬菌体的一些突变种内，存在一些 称为chi的位点。chi位点单一的碱基对 的改变即可激发重组的发生。这些位 点皆含有一个恒定的非对称的8bp序列： 5’ GCTGGTGC 3’ 3’ CGACCACC 5’



Chi位点是一个由基因recBCD编码的Rec BCD酶作用的靶部位。 RecBCD酶是一种多功能酶，具有几种不同 的活性。它是一个强有力的降解DNA的核 酸酶，早期被检定为活性核酸外切酶V，具 有解旋酶的活性。 RecBCD 所介导的解旋和切割可以被用来产 生末端，并引发异源双链的形成。

整个反应中没有可以自由旋转的中间体。
断裂和重新结合反应与拓扑异构酶I催化的 反应机制相类似，不同的是相互连接的两 条链不是来自于同一双螺旋，而是来自于 不同的双螺旋。

第六节 异常重组

异常重组（illegitimate recombination）是指 发生在彼此同源性很小或没有同源性的 DNA序列之间的重组。异常重组可发生在 DNA很多不同的位点之上。 异常重组可能是最原始的重组类型，不需 要对特异性序列进行识别的复杂系统或对 DNA同源序列进行识别的机制。



一旦Holliday连接体形成后，它能进行重 排从而改变链的彼此关系。这种重排称 为异构化，因为在此过程中没有键的割 裂。

一旦形成Holliday连接体后，就能被拆分。 是否发生重组依赖于拆分时Holliday连接 体的构象。

Holliday模型被称为双链侵入模型，因为 由于每一个DNA分子的一条链侵入到另 一个DNA分子，它解释了在重组时两个 DNA分子的异源双链是如何形成的。 Holliday连接体也能通过碱基之间氢键的 断裂和再连接而发生左右移动。这个过 程称为支链迁移（branch migration)