转座子标签法克隆分离植物基因的研究进展

转座子标签法克隆分离植物基因的研究进展

胡英考

(首都师范大学生物系,北京100037)

摘　要:　转座子标签法是克隆与分离植物基因的一项十分有效的方法。概述了转座子标签技术克隆与分离植物基因的基本原理与方法,介绍了可用于转座子标签技术的转座子,对于转座子标签系统以及在克隆与分离异源植物基因方面的主要成就进行了综述,并对将来的研究方向进行了讨论。

关键词:　转座子　转座子标签　基因克隆

Progress of Plant G enes Cloning and Isolation

by T ransposon T agging

Hu Y ingkao

(Biology Depart ment of Capital Normal U niversity,Beiji ng100037)

Abstract:　Transposon tagging is an effective method for plant gene cloning and isolation.The principle and proce2 dure of transposon tagging are summarized and the trans poson used for plant gene cloning and isolation are introduced in this paper.The progress of transposon tagging system and alloplant gene cloning and isolation were reviewed.The per2 spective of trans poson tagging was also discussed.

K ey words:　Transposon　Transposon tagging　G ene cloning

分子生物学的迅速发展,为人们提供了许多分离植物基因的有效方法。传统上,可根据已知基因的产物推测其相应的核苷酸序列,再据此序列合成寡核苷酸探针,从cDNA文库或基因组文库中钓取目的基因,此即所谓的功能克隆(functional cloning)。近年来,表型克隆(phenotypical cloning)发展十分迅速,它是根据材料间表型的差异,来克隆引起这种差异的基因的方法。但是,在大多数情况下,我们既不知道基因的表达产物,又没有适宜的相对表型用于表型克隆,此时最常用的基因克隆技术是图位克隆(map2based cloning or positional cloning)[1]和转座子标签(transposon tagging)技术[2]。以下仅对转座子标签技术在植物基因克隆中的研究进展作一综述。

1　转座子标签法克隆植物基因的原理与方法

转座子(transposon)又称转座因子或移动因子,最早在1951年由美国遗传学家McClintock在研究玉米籽粒色斑不稳定现象而提出来的,但该概念直到1967年在大肠杆菌中发现插入序列这类转座因子后才被普遍承认和接受,现在我们知道,转座子在生物界是普遍存在的。

转座子是染色体上一段可以移动的DNA序列,它可以从一个基因座位转移到另一个基因座位,当转座子插入到某个功能基因内部或邻近位点时,就会使插入位置的基因失活并诱导产生突变型,通过遗传分析可以确定某基因的突变是否由转座子引起,由转座子引起的突变可用转座子DNA为探针,从突变株的基因组文库中钓取含该转座子的DNA 片段,获得含有部分突变株DNA序列的克隆,然后以该DNA序列为探针,筛选野生型植株的基因组文库,最终得到完整的目的基因[3]。在转座子作为外源基因通过农杆菌介导等方法导入植物时,由于T2DNA整合到基因组所引起的插入突变,也可用上述原理来克隆基因,这样就大大提高了分离基因的效率。

利用转座子标签法分离植物基因的主要步骤如下:(1)构建含转座子的质粒载体;(2)将含转座子的质粒载体通过农杆菌介导或其他适当的转化方法导

生物技术通报

・综述与专论・ B IO TECHNOL O G Y　BULL ETIN 2003年第2期

入目标植物中;(3)转座子插入突变的鉴定与分离;

(4)转座子在目标植物体内的活动性能检测;(5)利用转座子序列作探针,与突变体基因组文库杂交,获得部分基因序列;(6)用部分基因序列作探针,与野生型基因组文库杂交,分离出完整的目的基因。

2　用于植物基因克隆的转座子

根据DNA的结构和转座的机理,可将转座子分为两大类:转座子和逆转座子(retroposon)。转座子是基于DNA2DNA的转座过程,是最早发现的一类转座子因子,包括细菌的插入序列(insertion se2 quence)、复合转座子(composite transposon)、TnA转座子家族(Tn A family)、可转移噬菌体(transposable phage)等,还包括真核生物中果蝇的P成分、FB (foldback)成分和玉米的Ac/Ds(Activator/dissocia2 tion)、En/Spm(Enhancer/suppressor mutator)系统等。目前研究得比较清楚且应用较多的是玉米的Ac/Ds、En/Spm和金鱼草的Tam3转座子。植物中转座子的结构类似于细菌的复合转座成分,如Ac/ Ds,Ac全长为4.5kb,两端为11bp反向重复序列; Ds大小为0.4～4kb,一般认为Ds是Ac缺失的结果[4],Ac单独存在便可引起突变,但变异不稳定,Ds 在有Ac存在的条件下,才会引起插入突变。

逆转座子的转座过程是基于DNA2RNA2DNA 的转录和逆转录过程,最早是在动物和酵母的基因组中发现的,如酵母的Ty(transposable element in yeast)因子、果蝇的copia因子等。近年来的研究表明,逆转座子几乎存在于所有植物的基因组中,并且是基因组中一个很大的组成部分,其增殖以RNA 为中介,且拷贝数较多[7]。在通常情况下,逆转座子受到严格控制,在胁迫情况下,可被激活,但果蝇和酵母的逆转座子在正常的生命周期中就具有活性,烟草的逆转座子也可在拟南芥中转座[5]。

根据转座子分离植物基因的物种范围的不同,可将转座子标签法分为两大类:一类是利用内源转座子来分离同源寄生植物的基因,即同源转座子标签技术(homologous transposon tagging),这就需要从分子水平上研究新的更多的植物内源转座子,以便于同源寄生植物的基因克隆。目前,玉米的Ac/ Ds、En/Spm和金鱼草的Tam3转座子在分离内源植物基因方面已取得了令人瞩目的成就[6]。另一类是利用已经在分子水平上研究较清楚的转座子系统,如玉米的Ac/Ds、En/Spm及金鱼草的Tam3等来分离异源植物基因,即异源转座子标签技术(het2 erologous transposon tagging),这一技术已成为植物基因分离技术中的一个热点。

3　转座子标签法分离异源植物基因的主要成就

采用异源转座子标签技术来分离植物基因,首先必须研究清楚转座子在异源植物中的转座活性;其次,需要建立一个切实可行的异源转座子标签系统。

3.1　转座子标签系统的发展

最初用于植物基因克隆的都是含有完整转座子序列的自主转座子,且分离的大都是同源寄生植物的基因,后来发现自主转座子在异源植物中也表现转座,并且利用他们在异源植物中分离到了有关基因,这一系统称为单转座子标签系统(one2element system)。Chuck等[7]利用玉米的Ac因子转化矮牵牛,使花朵颜色由完全紫色变为出现白色花斑。分析表明,这是由于玉米的Ac因子插入到矮牵牛p H6基因内部造成的,而p H6基因的功能是影响花冠细胞的酸碱度。

单转座子标签系统的优点是转座效率较高,但由于使用的是自主转座子,所以转座子很容易从插入位点切离,使突变恢复或产生新的变异,这种变异的不稳定性,使人们无法有效地克隆基因。为克服这一缺点,人们又设计了双转座子标签系统。以玉米的Ac/Ds转座子为例,Ac在玉米中是一个完整的转座子,编码转座酶的基因位于中间,两端为反向重复序列,可自行转座;Ds是Ac缺失了转座酶基因序列的剩余部分,其两端仍含有反向重复序列,Ds在有转座酶存在的情况下,可以转座。根据以上特点,科学家构建了分别含有Ac(可合成转座酶,但缺少末端反向重复序列)和Ds(不能合成转座酶,但含有末端重复序列)的质粒载体,分别用于转化异源植物,通过转化植株的杂交(Ac×Ds),使Ac与Ds存在于一个个体中导致转座,其引起的突变既可以稳定遗传(Ac与Ds分离),又可再次转座引起新的突变(Ac与Ds存在于一个个体),利用Ac/Ds作探针,筛选突变株基因组文库,进而钓出与突变有关的基

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2003年第2期 胡英考:转座子标签法克隆分离植物基因的研究进展