拟糖蛋白合成研究进展

2003年第23卷第5期,425～431有机化学Chinese Journal of Organic ChemistryV ol.23,2003N o.5,425～431・综述与进展・拟糖蛋白合成研究进展张　健a 张其胜b 田庚元Ξ,aΞ(a中国科学院上海有机化学研究所　上海200032)(b上海市第一人民医院分院消化科　上海200081)摘要　拟糖蛋白因为其很多方面的生物活性和它可以通过合成大量获得,而引起了化学家和生物学家极大的关注.就拟糖蛋白的应用及各种合成方法作一简要的评述.关键词　拟糖蛋白,合成,抗原,糖缀合物R ecent Develpoment in Synthesis of N eoglycoproteinZH ANG,Jian a ZH ANG,Qi2Sheng b TI AN,G eng2Y uanΞ,a(a Shanghai Institute o f Organic Chemistry,Chinese Academic o f Sciences,Shanghai200032)(b Department o f Gastroenterology,the Fir st People’s Hospital o f Shanghai,Shanghai200081)Abstract　S pecific interaction between proteins and sugars has recently been em phasized in many biological system.The neoglycoproteins are exactly the material which has been useful in studying the distribution and benefits of sugar2 recognizing systems,and may help us to understand this rapidly developing area.This paper summarizes the synthetic methods of neoglycoprotein and discusses their physicochemical properties,biological activities and applications.K eyw ords　neoglycoprotein,synthesis,antigen,glycoconjugate 酶促的糖类和蛋白质的连接反应称为蛋白质的糖基化(glycosylation).但是,糖和蛋白也可以发生许多类型的非酶反应.随着有机合成技术的飞速发展,糖类连接到蛋白质上的方法也不断增加,这些将糖类连接到蛋白质肽链上的非酶过程被定名为糖化(glycation).由此过程而得到的糖类和蛋白质的复合物,被统称为拟糖蛋白(neoglycoprotein)[1]. 自拟糖蛋白第一次被Lee教授命名以来[2],其合成和应用已引起化学家、生物学家和药物学家的广泛关注[3～6],因为某种糖链可以被特定的细胞专一性识别并结合,而且拟糖蛋白具有高价性,可以用来作为靶向药物的特异性载体[7～9].近年来,分子生物学家发现拟糖蛋白还可以作为免疫激活剂,产生免疫反应,另外可以制备单克隆抗体.目前许多单糖和寡糖链的拟糖蛋白(抗原)已被合成出来,并研究了它们的结构与免疫活性的关系[10,11].1　物理化学性质 拟糖蛋白的表征工作主要集中在糖修饰后蛋白结构的改变,以及糖的存在对蛋白质的热稳定性、活性的影响. Wash等[12]曾报道,用还原胺化法将乳糖修饰到天冬酰胺酶上,得到的拟糖蛋白比天然酶具有更好的热稳定性.而后,Washall[13]又尝试了其他各种天然酶,发现他们的糖缀合物都显示了对热、蛋白水解酶、变性剂有很好的稳定性.2　生物活性 一般说来,在合成拟糖蛋白的过程中,如果保留了原有的蛋白质的净电荷,将不会改变原有的蛋白酶的活性[14,15],例如采用还原胺化法、活化酰基化法、咪化法.但是如果修饰过程中,蛋白质上的电荷被中和或引入了疏水基团通常会降低酶的活性[15,16],这一点在抗原设计中应特别注意.当然,糖基结构的不同也会影响整个拟糖蛋白的活性.例如,在靶向药物载体的设计中,因为62磷酸甘露糖与星状细胞表面的62磷酸甘露糖/胰岛素生长因子(M6P/IG F2II)受体专一性结合,所以若将62磷酸甘露糖修饰到蛋白上,该载体将会专一ΞE2mail:tiangy@Received June7,2002;revised August27,2002;accepted December2,2002.性的导向星状细胞[7].但若将糖基结构改变为乳糖时,它会专一性的导向肝细胞[16];改变为甘露糖时,它会专一性地导向肝巨噬细胞.3　拟糖蛋白的应用 首先,拟糖蛋白可以大量的制备,这对天然的糖蛋白来说是很困难的.另外,拟糖蛋白的结构远比天然糖蛋白简单,因此易于表征.3.1　抗原 拟糖蛋白最早、最广泛的应用,是作为人工抗原研究抗碳水化合物的抗体,如模拟细菌多糖和人体内血浆中的一些糖类化合物形成抗糖抗体,从而能与其抗原结合形成复合物用于临床检验,该方法具有专一性.另外,可以通过改变拟糖蛋白中糖的结构,来确定具有免疫专一性的碳水化合物的结构.用来研究的碳水化合物有天然糖、氨基糖、糖醛酸、脱氧糖、唾液酸等等.通常它们是一些单糖和二糖,但是近年来一些寡糖和多糖也研究了它们的免疫专一性[3].3.2药物载体年代就已经开展.拟糖蛋白同样也具有作为药物载体的潜力.因为拟糖蛋白可以特定识别细胞膜上糖蛋白的受体,所以它可以携带小分子药物进入内体、溶酶体.然后,这些可渗透的分子在细胞内聚集,水解后小分子药物将脱离载体充满于整细胞. 也许,拟糖蛋白的最大优势在于它可以得到各种特别结构的糖缀合物,给研究糖-蛋白质的关系提供了方便.但是目前限制拟糖蛋白发展的是可以连接到蛋白质上的寡糖的合成.随着有机合成和糖化学技术的飞速发展,这一点正在被逐步解决.4　拟糖蛋白的合成 拟糖蛋白的合成工作从七十年代开展以来,从简单的重氮盐偶联[17]、异硫氰酸酯偶联[18～20]到后来发展起来的还原胺化法[21]、活化酰基化法[22]、酰基叠氮法[23,24]以及双功能试剂交链法[25,26]等.作为拟糖蛋白的原料,最常用的是牛血清蛋白(BSA),这是因为它取材方便、价格低廉、分子量较大、赖氨酸含量较多(每分子有59个赖氨酸残基).如有特殊目的还可选用特定的蛋白质.4.1重氮盐偶联 氮盐偶联是最经典的方法,这种方法的一般程序是[27]:先在糖中引入对氨苯基[如通过形成对氨基苯基糖苷(1)],用亚硝酸钠处理将氨基转化为重氮盐(2),然后在碱性溶液中与蛋白质作用,形成偶氮蛋白(3)(azo2protein). 该方法因为重氮盐能迅速地与蛋白质中的组氨酸、赖氨酸残基反应,因此能够获得高偶合度的拟糖蛋白(每个蛋白链上连有3050个糖基),但由于疏水性苯基的引入可能较大地改变蛋白质的性质(如在抗原设计中,可能会诱导出非预期的抗体)[28];而且所形成的偶合产物呈深棕色,往往限制了蛋白质和糖的一些标准方法的应用.4.2　异硫氰酸酯法 该方法是应用最广泛的一种蛋白质糖化方法[29],异硫氰酸酯法是先将氨基糖苷(4)用硫代光气处理,转化为异硫氰酸酯(5),然后在弱碱性条件下,异硫氰酸酯与蛋白质上的氨基反应,得到稳定的产物6(硫代碳酰二胺衍生物). 异硫氰酸酯因为反应的选择性好,比较稳定,所以可以与多种蛋白质偶联,如牛血清蛋白(BSA)[30～32]、人血清蛋白(HSA)[33]、IgA[34]、藻红蛋白[35]、血蓝蛋白(K LH)[25].同时,运用异硫氰酸酯法可以很好的获得具有寡糖链的拟糖蛋白.如N obert等[36]合成了具有K O(D2丙三氧基2D2塔罗吡喃糖222酸)基团的拟糖蛋白(7).624 有机化学V ol.23,20034.3　还原胺化法 还原胺化法适合于寡糖的拟糖蛋白的合成,Schwartz 将纤维二糖通过糖环开环产生还原性醛基的方法获得拟糖蛋白[37].他将二糖的还原端开环,产生具有还原性醛基的产物8,再与蛋白质中的氨基形成席夫碱9,在还原剂硼氰氢化钠的作用下,成为稳定的拟糖蛋白10. 该方法中最常用的还原剂是NaCNBH 3,它可以专一性地还原席夫碱中的双键,而对糖中的醛基没有作用.近年来,随着功能试剂的出现,可以人为地在异头碳引入醛基,所得到的产物也能通过还原胺化法偶联到蛋白质上,且可保持单糖的吡喃环结构.P ozsg oy [21a ,21b]用该方法合成了寡糖(四糖～十六糖)的HSA 的拟糖蛋白14.他将寡糖酰肼化合物11用杂双功能试剂12转化为含醛基的中间体13,化合物13再用还原胺化法得到高偶合度的糖缀合物14.该化合物的分子量经过M A LDI 2T OF 2MS 测定得到了很好的结果.724N o.5张健等:拟糖蛋白合成研究进展4.4　活化酰基化法 该方法先将糖通过氧化开环形成羧酸衍生物,再转化为混合酸酐[17,22]活性酯[10],酰基叠氮[23,24],让其与蛋白质中的氨基反应,通过酰胺键连接形成糖-蛋白质缀合物.Arakatusu 等[22]运用葡聚糖水解得到的寡糖片段15,用溴氧化断裂形成羧酸16,再与异丁基甲酰氯反应,得到活性中间体17,最后将酸酐17与BSA 缩合,得到蛋白质链上连有8～14个寡糖链的拟糖蛋白18. 2001年,Scherrmann 等[10]用这种方法得到了高偶合度(16∶1)的拟糖蛋白,用来作为产生抗六位磷酸化糖的单克隆抗体的抗原.他用酰氯20将半抗原19转化为活性酯21,最后与蛋白质高效偶合得到产物22.作者证明了在抗原设计中,六位磷酸化的糖可以作为更好的半抗原,这一说法在他之前也得到过证明[7].Ratio of hapten 2to 2protein 16∶1824 有机化学V ol.23,2003 同样,Pinto 等[24]将羧酸转变为酰肼23,再转化为酰基叠氮活性中间体24,最后与蛋白质上的氨基反应形成拟糖蛋白25.4.5　双功能试剂交联法 糖类或糖肽可以用多功能团的试剂和蛋白质交联成为拟糖蛋白[38],所用的交联剂非常多.用这种方法的优点在于可以将天然的糖蛋白或多糖中的的糖链接到蛋白质上,同时可以提高蛋白质上糖链的密度[3]. 利用双功能试剂制备拟糖蛋白,一般先将糖转变为其衍生物,然后通过双功能试剂将糖衍生物偶联到蛋白质上.这些双功能试剂既可与氨基结合,也可与羟基结合,例如β2苯胺基乙胺[39,40]、β2巯基乙胺[41～45]、二乙烯砜[46]都是很好的偶联试剂. K osma [41～43]用HSCH 2CH 2NH 2功能试剂合成了各种天然寡糖(二糖到五糖)的拟糖蛋白26,它们产生的抗体与天然抗体比较,显示出更强的对脂多糖的亲合性. 另外,还有一些特殊的比较复杂的功能试剂,K andil 等[47]曾经报道了一种双马来酰亚胺的功能试剂27,用它合成了荚膜多糖的寡糖片段的拟糖蛋白28.4.6　水溶性碳二亚胺法运用水溶性碳二亚胺(如EDC )将糖基上的羧基与蛋白上的游离氨基偶合形成酰胺键,该方法只需一步反应,操作简单,不需加入连接基团,而且偶合度较高.K unz [48]报道了T N 和T 抗原与BSA 的缀合物,它是蛋白链上连有大于20个糖肽的拟糖蛋白.2.5to 6olig osaccharids chains per BSA924N o.5张健等:拟糖蛋白合成研究进展E DC :12乙基232(32二甲胺基丙基)碳二亚胺 该方法适用于糖肽与蛋白质缀合物的合成,也可用于寡糖与蛋白质缀合物的合成,只要将末端糖氧化开环形成羧酸,然后用该法与蛋白偶联[49]. 此外,还有一些方法也有零星的报道,如酶催化合成法[48]、咪化法[49]、胍化法[50]等.5　展望由于生物体内反应的复杂性,使得要从生物体内获得化学结构单一的糖缀合物的可能变得微乎其微.因此拟糖蛋白的合成为我们研究糖对糖蛋白结构和功能的影响,以及糖蛋白结构的改变对分子识别的影响提供了有力的工具,也为实现导向药物的产业化展现了美好的前景.当然,在拟糖蛋白的合成中,如何开发方便、有效的方法来合成和分析拟糖蛋白显得尤为重要.近年来出现的自动合成(Automated synthesis )和固相合成(S olid 2phase synthesis )将为糖缀合物的合成开拓了广阔的天地.R eferences1S towell , C.P.;Lee ,Y. C.In Advances in Carbohydrate Chemistry and Biochemistry ,Eds.:T ips on ,R.S.;H orton ,D.,Academic Press ,San Dieg o ,1980,37,p.225.2Lee ,Y. 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