Western blot详细操作过程

Western Blot

Western Blot 采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。经过PAGE 分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄（NC ）膜或聚偏二氟乙烯（PVDF ）膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。该技术广泛应用于检测蛋白水平的表达。

流程：蛋白样品的提取→蛋白样品定量与变性→PAGE 凝胶电泳→转膜→丽春红染色→封闭→抗体孵育→底物显色。

实验器材和试剂：

一． 蛋白提取试剂

1.10% SDS 裂解液：

称取10g SDS 粉末加入双蒸水至90mL ，充分溶解，定容至100ml 室温保存。 2.RIPA 裂解液

1ml 裂解液工作液配方： 10ul 100mmol/L PMSF (1mM) 0.2ul 10mg/ml Aprotinin (2ug/ml) 5.0ul 1mg/ml Leupeptin (5ug/ml)

0.9848ml 裂解液

0.5ml 裂解液工作液配方： 5ul 100mmol/L PMSF (1mM) 0.1ul 10mg/ml Aprotinin (2ug/ml) 2.5ul 1mg/ml Leupeptin (5ug/ml)

0.4924ml 裂解液 PMSF 必须摇匀至无结晶时才可与裂解液混合

3．蛋白酶抑制剂：100mmol/L PMSF ：

17.4mg PMSF 粉末溶于1ml 异丙醇(AR)，分装250ul 每管后－20℃保存。使用终浓度为1 mmol/L 。【PMSF ：在溶液中不稳定，应在临用前从储存液中现加于裂解液中。PMSF 剧毒，严重损害呼吸道粘膜、眼睛及皮肤，吸入、吞进或通过皮肤吸收后有致命危险一旦眼睛或皮肤接触了PMSF ，应立即用大量的水冲洗。凡被PMSF 污染的衣物应予丢弃。】

二． 蛋白定量试剂： 1. BCA 蛋白定量试剂盒

2. 10ml 0.9%的生理盐水（90mg NaCl 溶于10ml 去离子水中） 三． 上样用试剂： 6×SDS 上样缓冲液：

取一个离心管，秤取2.0g SDS 粉末，6mg 溴酚蓝(BromopHenolblue;Albutest)粉末，然后用枪头加入5mL 1.5mol/L Tris-HCl (pH 6.8)，用移液管加入10mL Glycerol(甘油，丙三醇)，枪头加入2mL β

-mercapteethanol （β

-巯基乙醇）充分混匀，加双蒸水定容至20ml ，涡旋溶解。4℃避光保存。

四．电泳工作液：

1.1.5mol/L Tris-HCl缓冲液：（三（羟甲基）氨基甲烷）

称取18.171g Tris粉末，加入60mL 双蒸水中，加盐酸调节pH至6.8或8.8，定容至100mL。4℃保存。可致癌，不要直接接触皮肤。

2.1.0mol/L Tris-HCl缓冲液：

称取12.114g Tris粉末，加入60mL 双蒸水中，加盐酸调节pH至6.8或8.8，定容至100mL。4℃保存。可致癌，不要直接接触皮肤。

3.0.5mol/L Tris-HCl缓冲液：

称取6.057g Tris粉末，加入60mL 双蒸水中，加盐酸调节pH至6.8或8.8，定容至100mL。4℃保存。可致癌，不要直接接触皮肤。

4.10% APS：(一周内使用，最好新鲜配置)

称取0.5g APS粉末，加入双蒸水至5 mL，充分溶解，4℃保存。

5.10% SDS:

秤取10g SDS粉末溶于100ml双蒸水中，可50℃水浴下溶解，室温保存。如在长期保存中出现沉淀，水浴溶化后，仍可使用

混匀后在室温下静置15min，然后加入5ul TEMED即为分离胶，即可灌胶。

6. 4%浓缩胶（上层胶）：

0.7mL 30% Acr/Bis；

1.5mL 0.5mol/L Tris-HCl (pH 6.8)；

60μL 10% SDS；

3.6mL双蒸水混匀后加入50μL 10% APS和5μL TEMED（灌胶时再加）。

7.1×电泳液缓冲液（使用液）（PH=8.3）：

3.04 g Tris粉末，1

4.4g甘氨酸（Glycine）粉末，1g SDS粉末溶于800ml双蒸

O定容至1000ml，室温保存。可重复使用3-5次。

水中，调PH=8.3，用ddH

2

10×电泳液缓冲液（储存液）（PH=8.3）：

30.4 g Tris粉末，144g甘氨酸（Glycine）粉末，10g SDS粉末溶于800ml双蒸

O定容至1000ml，室温保存。

水中，调PH=8.3（浓HCl调），用ddH

2

五．转膜工作液：

1×转膜液缓冲液（使用液）（PH=8.3）：

3.0 g Tris粉末，1

4.1g甘氨酸（Glycine）粉末，1.25g SDS粉末溶于800ml双蒸水中，用ddH

O定容至1000ml，溶解后室温保存，使用时再加250mL甲醇(AR)可重复

2

使用3-5次。

10×转膜液缓冲液（储存液）（PH=8.3）：

30.0 g Tris粉末，141g甘氨酸（Gl ycine）粉末，12.5g SDS粉末溶于800ml双蒸

O定容至1000ml，溶解后室温保存。使用时稀释10倍，加入20%甲醇。水中，用ddH

2

可取10×溶液100ml, ddH2O 900ml，甲醇250ml。（重复利用再重新加入甲醇50ml）六．封闭液

1g脱脂奶粉于20mL 1X TBST混匀,4℃保存。保存时间不能太久，有味道就不

能用了。

七．抗体孵育用液

1X TBST缓冲液（使用液）：

O 24.2g Tris粉末，87.6g NaCl，10mL Tween20（AR)溶于800ml双蒸水中，用ddH

2定容至1000ml调节pH至7.4。室温保存。

10X TBST缓冲液（储存液）：

O 24.2g Tris粉末，87.6g NaCl，10mL Tween20（AR)溶于800ml双蒸水中，用ddH

2定容至1000ml调节pH至7.4。室温保存。

八．丽春红染液（可回收利用）

九．显影液

Western Lightning ECL Pro

十．STRIP膜再生

试剂 100ml 5ml 8ml 12ml 14ml

10% SDS 20ml 1ml 1.6ml 2.4ml 2.8ml

0.5M Tris HCl （pH6.8） 12.5ml 0.625ml 1ml 1.5ml 1.75ml

0 67.5ml 3.375ml 5.4ml 8.1ml 9.45ml

ddH

2

β- mercaptoethanol 0.8ml 40ul 64ul 96ul 112ul

操作步骤：

（一）蛋白样品制备

（1）待测蛋白细胞收集

1.准备冰盒，提前准备好需要的试剂和器材，EP管：标记好相关信息（细胞名称，蛋白提

取，转染信息，时间）；离心管，滴管，含血清的培养液，胰蛋白酶，PBS。4℃离心机提前

预冷；

2.弃掉皿内的无血清培养液（含血清的培养液，可直接收到相应的离心管），用1.0ml的

PBS清洗，将PBS收到相应的离心管内，再用1.0ml的PBS清洗，收集PBS，每皿加1ml的胰蛋白

酶进行消化，37℃，5min。

3.消化后将皿放在冰盒上，冰上操作。用培养液（可以用离心管内带血清的培养液）吹打

细胞，收入离心管（可再冲洗一次，冲洗干净），将离心管配平后放1500r/5min离心。

4.取出离心管，吸掉上清（注意不要碰到蛋白固体），管底留少量液体，用手弹离心管底

部，震荡离心管，加入1ml的PBS吹打几次后移入相应的EP管，在离心管再加入0.5ml的PBS

清洗加入EP管。EP管配平后4℃，1500r/5min。

5.取出EP管，轻轻吸掉上清，留少许液体在底部，弹几下EP管进行震荡，加入1.5ml的PBS

涡旋3-5次，配平后4℃，1500r/5min。

6.取出EP管，轻轻吸掉上清，留少许液体在底部，配平状态在4℃离心机进行离心，转速

为最高转速14800转，达到此速度立刻停止，取出EP管，小心吸掉所有的液体。

7.将EP管放在-80℃冰箱内保存。