粪大肠菌群的测定
GBT 肥料中粪大肠菌群的测定
GB/ 肥料中粪大肠菌群的测定1 范围本标准规定了肥料中粪大肠菌群的测定方法。
2 定义粪大肠菌群 fecal coliforms系指一群在℃±℃条件能发酵乳糖、产酸产气、需氧和兼性厌氧的革兰氏阴性无芽胞杆菌。
粪大肠菌群数为每克（毫升）肥料样品中粪大肠菌群的最可能数（MPN）。
3 设备和材料（内容略）4 培养基和试剂培养基：遵照附录A的规定。
革兰氏染色液：遵照附录B的规定（略）。
5 检验步骤样品稀释在无菌操作下称取样品g或吸取样品10mL，加入到带玻璃珠的90 mL无菌水中，置于摇床上200 r/min 充分振荡30min，即成10-1稀释液。
用无菌移液管吸取 mL上述稀释液加入到45 mL无菌水中，混匀成10-2稀释液。
这样依次稀释，分别得到10-3，10-4等浓度稀释液（每个稀释度须更换无菌移液管）。
乳糖发酵试验选取三个连续适宜稀释液，分别吸取不同稀释液mL加入到乳糖胆盐发酵管内，每一稀释度接种3支发酵管，置℃±℃恒温水浴或隔水式培养箱内，培养24h±2h。
如果所有乳糖胆盐发酵管都不产酸不产气，则为粪大肠菌群阴性；如果有产酸产气或只产酸的发酵管，则按进行。
分离培养从产酸产气或只产酸的发酵管中分别挑取发酵液在伊红美蓝琼脂平板上划线，置36℃±1℃条件下培养18h～24h。
证实试验从分离平板上挑取可疑菌落，进行革兰氏染色。
染色反应阳性者为粪大肠菌群阴性；如果为革兰氏阴性无芽胞杆菌则挑取同样菌落接种在乳糖发酵管中，置℃±℃条件下培养24h ±2h。
观察产气情况，不产气为粪大肠菌群阴性；产气为粪大肠菌群阳性。
结果证实实验为粪大肠菌群阳性的，根据粪大肠菌群阳性发酵管数，查MPN检索表，得出每克（毫升）肥料样品中的粪大肠菌群数。
附录 A（规范性附录）培养基乳糖胆盐发酵培养基蛋白胨g猪胆盐g乳糖g%溴甲酚紫水溶液m L蒸馏水1000m LpH值～制法：将蛋白胨、猪胆盐及乳糖溶解于蒸馏水中，校正pH，加入溴甲酚紫水溶液，然后分装试管，每管9mL，并放入一支倒置的小套管，高压灭菌115℃15min。
粪大肠菌群的测定
15.7mg硫代硫酸钠可去除样品中1.5mg活性氯，硫代硫酸钠用量可 根据样品实际活性氯量调整。
4 .无菌水:取适量实验用水，经 高压蒸汽灭菌20min， 备用。 5. 硫代硫酸钠( Na2S2O3.5H2O)。 (去除游离氯) 6.乙二胺四乙酸二钠(C10H14N2O8Na2 .2H2O)。 7.乙二胺四乙酸二钠溶液: ρ (C10H14N2O8Na2 .2H2O) =0.15 g/ml 称取15g乙二胺四乙酸二钠,溶于适量水中，定容至100ml,此溶液可保存 30d。 8.硫代硫酸钠溶液: ρ ( Na2S2O3.5H2O) =0.10 g/ml 称取15.7g硫代硫酸钠， 溶于适量水中，定容至100ml，临用现配。
2. 浓缩乳糖蛋白胨培养液： (此溶液用于检验大肠菌群) 按上述乳糖蛋白胨培养液的制备方法配制。除蒸馏水外，各组分用量 增加至三倍。 (即按上述配方比例三倍 (除蒸馏水外) ，配成三倍浓 缩的乳糖蛋白胨培养液)
①在何种情况下用多少三倍浓度的培养基接种？ 答：接种体积为10ml时，试管内应装入有3倍浓度乳糖蛋 白胨培养液5ml。
• 三、肯定要加塞子的，我们用的塞子是软材料 (好像是软橡胶？ 白色的，塞子中间另有一 个可以活动的塞子，能保证加塞后的试管透气，其实用什么材料不重要的。
• 四、需要的仪器设备为：生化培养箱、无菌操作台 (空气精华级别100) 、高压灭菌锅、 冰箱、干燥箱。
五、干扰和消除
1.
,能破坏微生物细胞内的酶活性，导
若接种量过高，培养液应加倍成分。这是由于样品的量大 的情况下，培养液稀释大,各种成分的相对浓度就会不足， 就不能满足细菌的生长要求，存在实验失败的概率。因此， 合理调整样品量和营养液浓度的比例需要反复实验和多组 对照。
粪大肠菌群检测标准
粪大肠菌群的检测标准根据不同的国家和地区以及不同的应用场景可能会有所不同。
一般来说，粪大肠菌群的检测标准通常是以每克或每毫升样品中的大肠菌群数量来表示的，常用的单位有CFU/g或CFU/mL。
在某些国家或地区，对于饮用水、食品等相关行业的检测标准可能会更加严格。
例如，某些国家可能规定饮用水中不得检出大肠菌群，而在某些食品中则可能规定每克样品中大肠菌群的数量不得超过一定数值。
需要注意的是，粪大肠菌群并非单一菌种，而是一组菌群的统称。
因此，在检测过程中需要针对这一组菌群进行检测，而非单一菌种。
同时，为了确保检测结果的准确性，检测过程需要严格遵守相关操作规范，避免交叉污染等因素的影响。
过滤膜法测粪大肠菌群数-国标方法
滤膜法-粪大肠菌群的测定1、适用范围本标准适用于地表水、地下水、及水中粪大肠菌群的测定。
用于检验加氯消毒的水样时，在滤膜法之前，先做试验，证实它所得的数据资料与多管发酵试验所得的数据资料具有可比性。
2、原理滤膜是一种微孔性薄膜。
将水样注入已灭菌的放有滤膜（孔径0.45微米）的滤器中，经过抽滤，细菌即被截留在膜上，然后将滤膜贴于M-FC培养基上，44.5℃温度下进行培养，计数滤膜上生长的此特性的菌落数，计算出每1L水样中含有粪大肠菌群数。
3仪器：滤膜（孔径0.45微米）、滤器、接液瓶、垫圈、无菌镊子夹3、培养基和试剂本标准所用试剂除另有注明外，均为符合国家标准的分析纯化学试剂，实验室用水为新制备的去离子水。
M-FC培养基：胰胨10g蛋白胨5g酵母浸膏 3.0g氯化钠 5.0g乳糖12.5g胆盐三号 1.5g1%苯胺蓝水溶10ml1%玫瑰色酸溶液（溶于0.2mol/L氢氧化钠液中）10ml蒸馏水1000ml制法：将上述培养基中的成分（除苯胺蓝和玫瑰色酸外），置于蒸馏水中加热溶解，调节PH为7.4，分装于小烧瓶内，每瓶100ml，于115℃灭菌20min。
储存于冰箱中备用，临用前，按上述配比，用灭菌吸管分别加入已煮沸灭菌的1%苯胺蓝溶液1ml及新配制的1%玫瑰色酸溶液（溶于氢氧化钠溶液）1ml，混合均匀。
加热溶解前，加入1.2%～1.5%琼脂制成固体培养基。
如培养物中杂菌不多，则培养基中不加玫瑰色酸亦可。
4、步骤水样的选择：水样量的选择根据细菌受检验的特征和水样中预测的细菌密度而定。
理想的水样体积是一片滤膜上生长20～60个粪大肠群菌落，总菌落数不超过200个。
滤膜及滤膜灭菌：将滤膜放入高压蒸汽灭菌锅里在121℃灭菌10min，滤器、接液瓶、垫圈分别用纸包好，在使用前经121℃灭菌20min，滤器也可用点燃的酒精棉球火焰灭菌。
过滤：用无菌镊子夹取灭菌滤膜边缘，将粗糙面向上，贴放在已灭菌的滤床上，稳妥的固定好滤器。
粪大肠菌群的测定步骤
粪大肠菌群的测定1、半个月前配好初、复发酵所需培养液2、采样时用500ml 广口玻璃瓶分开采样，牛皮纸封口3、操作（1） 培养液初发酵 单倍乳糖蛋白胨培养液：蛋白胨 10 g牛肉浸膏 3 g乳糖 5 g氯化钠 5 g蒸馏水 1000ml调节PH 为7.2—7.4（NaOH ）6%溴甲基紫乙醇溶液 1 ml 充分混匀后 10ml （三倍是5ml ）分装于试管中，盖紧塞于蒸气锅中灭菌20min （0.1—0.5kpa ），冷却后于药品储存箱保存。
单月13个地表水（每个水样需10个单倍，5个三倍），2个创业（每个水样需15个单倍）。
共190个（1900ml ）单倍，65个三倍（325ml ）。
双月10个地表水，2个创业。
共130个（1600ml ）单倍，50个三倍（250ml ）。
创业的水一个月采两次水样复发酵 EC 培养液胰胨 20 g乳糖 5 g胆盐三号 1.5 g磷酸氢二钾 4 g磷酸二氢钾 1.5 g氯化钠 5 g蒸馏水 1000ml充分混匀后 10ml 分装于试管中，盖紧塞于蒸气锅中灭菌20min （0.1—0.5kpa ），冷却后于药品储存箱保存。
三倍乳糖蛋白胨培养液： 蛋白胨 30 g 牛肉浸膏 9 g 乳糖 15 g 氯化钠 15 g 蒸馏水 1000ml 溴甲基紫乙醇溶液 3 ml（2）做样初发酵：地表水15根管为一个水样。
5根为一组。
第一排为5ml三倍培养液，加10ml水样；第二排为10ml单倍培养液，加1ml水样；第三排为10ml单倍培养液，取1ml水样稀释至10ml后再从中取1ml至装有培养液的试管。
（10、1、0.1的取样量）创业，每个水样15根单倍。
同上逐级稀释，取样量为0.1、0.01、0.001ml。
将初发酵管放入培养箱中培养，温度为37℃±0.5℃，时间为24h±2h。
观察：产酸产气为阳性，即变色且有气泡产生，可轻击试管查气泡。
复发酵：呈阳性的试管进行接种后，做复发酵。
粪大肠菌群的监测分析
1.粪大肠菌群粪大肠菌群是总大肠菌群中的一部分，用来表明水质受污染的程度，主要来自粪便。
粪大肠菌群是一类能使乳糖发酵、产酸产气的需氧及兼性厌氧的革兰氏阴性无芽孢杆菌，在44.5 ℃培养24~48ｈ能发酵乳糖产酸产气。
通过对粪大肠菌群的监测，可了解水体受生活污水污染的状况。
粪大肠菌群适用于河流、湖泊等地表水、企业污水及医院废水的监测，是综合评价城镇污水，尤其是生活污水污染的一个必不可少的重要指标。
粪大肠菌群作为地表水环境质量标准唯一的一项微生物监测指标，我国多用多管发酵法进行检测，近几年也更新了好几个相关环境标准。
２样品的采集和保存2.1 采样瓶的准备和存放采集粪大肠菌群的采样瓶需要用牛皮纸封包好后，再经过高压灭菌器灭菌才能使用。
灭菌后的采样瓶里如果含有少量冷凝水，可以放在烘箱里烘干。
有条件的单位，也可以使用无菌采样瓶。
灭菌后的采样瓶也有其保存期，超过两周内未使用就必须重新灭菌。
绝大部分实验室都是在首次灭菌后不再管其使用期限。
采样瓶存放过久可能受到杂菌污染。
2.2 样品采集采样人员大多缺乏细菌学监测知识，出现很多采样不规范的现象。
如：微生物项目水样和理化水样混采；灭菌瓶开盖时间过早、水样在空气中暴露时间过长；水样采集量过满（既容易导致水样中细菌缺氧死亡，又不利于水样检测前振荡摇匀）；微生物样品和其他理化项目同时采样时，没有做到细菌样品优先采集；采样人员在采集样品时，没注意避免采样瓶受杂菌污染（手接触到瓶盖和瓶颈、采样设备不规范）。
2.3 样品运输保存在样品的运输和保存过程中，样品的冷藏是关键（温度过高过低都不利于样品的保存）。
由于仪器设备条件不够，运输过程不满足样品所需温度或者路途遥远，送检时间超过６ｈ，都会导致样品失效。
样品交接时间过长（在样品送入实验室之后，采样人员要将采样记录移交给业务室，然后由接样员对水样进行编号并将检测任务下发到监测室），导致样品没有及时分析而超过时限。
特别是，在执法监测和污染源监督性监测中，需要的采样时间长，有时还需要分时间段监测，这过程很容易造成样品超时。
粪大肠菌群检测方法
粪大肠菌群检测方法粪大肠菌群检测是指对人体粪便中的大肠菌群进行检测分析，以了解肠道微生态的状况。
粪大肠菌群的平衡与人体健康密切相关，因此对其进行检测具有重要意义。
目前，有多种方法可用于粪大肠菌群检测，本文将对常见的几种方法进行介绍和比较。
首先，传统的培养法是一种常见的粪大肠菌群检测方法。
该方法通过在特定培养基上培养粪便样本中的细菌，然后根据形态、生理生化特性进行鉴定和计数。
这种方法简单易行，能够得到各种细菌的数量和种类，但是需要较长的培养周期，且无法培养一些难以培养的菌种，因此在一定程度上存在局限性。
其次，分子生物学方法在粪大肠菌群检测中得到了广泛应用。
其中，16SrRNA基因测序是一种常用的方法，通过对粪便样本中的细菌DNA进行测序，可以得到细菌的种类和数量信息。
这种方法具有高通量、高灵敏度的特点，能够检测到微生物群落的整体结构，但是需要较高的技术水平和设备支持。
另外，代谢组学方法也被应用于粪大肠菌群检测。
这种方法通过检测粪便样本中的代谢产物，了解肠道微生物的代谢活动情况，从而推断微生物群落的组成和功能。
代谢组学方法能够直观地反映微生物群落的代谢活动，但是受到代谢产物的多样性和复杂性的限制，需要较高的分析技术和数据处理能力。
此外，基于人工智能的分析方法也逐渐应用于粪大肠菌群检测。
这种方法通过建立粪便微生物组的数据库和模型，利用人工智能算法对样本数据进行分析和预测，从而实现对微生物群落的快速、准确的检测。
人工智能方法具有高效、自动化的特点，但是需要大量的数据支持和算法优化。
综上所述，粪大肠菌群检测方法多种多样，各有优缺点。
在实际应用中，可以根据具体需求和条件选择合适的方法进行检测。
随着科技的不断发展，相信粪大肠菌群检测方法会越来越完善，为人体健康提供更多的帮助。
GBT肥料中粪大肠菌群的测定
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2 定义粪大肠菌群 fecal coliforms系指一群在℃±℃条件能发酵乳糖、产酸产气、需氧和兼性厌氧的革兰氏阴性无芽胞杆菌。
粪大肠菌群数为每克（毫升）肥料样品中粪大肠菌群的最可能数（MPN）。
3 设备和材料（内容略）4 培养基和试剂培养基：遵照附录A的规定。
革兰氏染色液：遵照附录B的规定（略）。
5 检验步骤样品稀释在无菌操作下称取样品g或吸取样品10mL，加入到带玻璃珠的90 mL无菌水中，置于摇床上200r/min充分振荡30min，即成10-1稀释液。
用无菌移液管吸取 mL上述稀释液加入到45 mL无菌水中，混匀成10-2稀释液。
这样依次稀释，分别得到10-3，10-4等浓度稀释液（每个稀释度须更换无菌移液管）。
乳糖发酵试验选取三个连续适宜稀释液，分别吸取不同稀释液mL加入到乳糖胆盐发酵管内，每一稀释度接种3支发酵管，置℃±℃恒温水浴或隔水式培养箱内，培养24h±2h。
如果所有乳糖胆盐发酵管都不产酸不产气，则为粪大肠菌群阴性；如果有产酸产气或只产酸的发酵管，则按进行。
分离培养从产酸产气或只产酸的发酵管中分别挑取发酵液在伊红美蓝琼脂平板上划线，置36℃±1℃条件下培养18h～24h。
证实试验从分离平板上挑取可疑菌落，进行革兰氏染色。
染色反应阳性者为粪大肠菌群阴性；如果为革兰氏阴性无芽胞杆菌则挑取同样菌落接种在乳糖发酵管中，置℃±℃条件下培养24h ±2h。
观察产气情况，不产气为粪大肠菌群阴性；产气为粪大肠菌群阳性。
结果证实实验为粪大肠菌群阳性的，根据粪大肠菌群阳性发酵管数，查MPN检索表，得出每克（毫升）肥料样品中的粪大肠菌群数。
过滤膜法测粪大肠菌群数-国标方法
滤膜法-粪大肠菌群的测定1、适用范围本标准适用于地表水、地下水、及水中粪大肠菌群的测定。
用于检验加氯消毒的水样时，在滤膜法之前，先做试验，证实它所得的数据资料与多管发酵试验所得的数据资料具有可比性。
2、原理滤膜是一种微孔性薄膜。
将水样注入已灭菌的放有滤膜（孔径0.45微米）的滤器中，经过抽滤，细菌即被截留在膜上，然后将滤膜贴于M-FC培养基上，44.5℃温度下进行培养，计数滤膜上生长的此特性的菌落数，计算出每1L水样中含有粪大肠菌群数。
3仪器：滤膜（孔径0.45微米）、滤器、接液瓶、垫圈、无菌镊子夹3、培养基和试剂本标准所用试剂除另有注明外，均为符合国家标准的分析纯化学试剂，实验室用水为新制备的去离子水。
M-FC培养基：胰胨 10g蛋白胨 5g酵母浸膏 3.0g氯化钠 5.0g乳糖 12.5g胆盐三号 1.5g1%苯胺蓝水溶10ml1%玫瑰色酸溶液（溶于0.2mol/L氢氧化钠液中）10ml蒸馏水 1000ml制法：将上述培养基中的成分（除苯胺蓝和玫瑰色酸外），置于蒸馏水中加热溶解，调节PH为7.4，分装于小烧瓶内，每瓶100ml，于115℃灭菌20min。
储存于冰箱中备用，临用前，按上述配比，用灭菌吸管分别加入已煮沸灭菌的1%苯胺蓝溶液1ml及新配制的1%玫瑰色酸溶液（溶于氢氧化钠溶液）1ml，混合均匀。
加热溶解前，加入 1.2%～1.5%琼脂制成固体培养基。
如培养物中杂菌不多，则培养基中不加玫瑰色酸亦可。
4、步骤水样的选择：水样量的选择根据细菌受检验的特征和水样中预测的细菌密度而定。
理想的水样体积是一片滤膜上生长20～60个粪大肠群菌落，总菌落数不超过200个。
滤膜及滤膜灭菌：将滤膜放入高压蒸汽灭菌锅里在121℃灭菌10min，滤器、接液瓶、垫圈分别用纸包好，在使用前经121℃灭菌20min，滤器也可用点燃的酒精棉球火焰灭菌。
过滤：用无菌镊子夹取灭菌滤膜边缘，将粗糙面向上，贴放在已灭菌的滤床上，稳妥的固定好滤器。
粪大肠菌群的测定演示文稿(精)
MPN值
MPN指数
1（0 mL） 接种量最大的一管（mL）
• 表3 最可能（MPN） 表
作业
1. 为什么说提高温度培养出的大肠菌群更能代表水质受粪 便污染的情况？
2. 根据试验情况，报告每升水中含粪大肠菌群的数目。
谢谢！
• 表1 接种水量参考表
• 由于本次测定的是污水处理厂的出水水样，所以选取的 浓度梯度为10-3、10-4、10-5。
（2） 乳糖蛋白胨培养基分装
如接种体积为10mL，则试管内应装有三倍浓度乳糖蛋白胨 培养液5mL；如接种量为1mL或少于1mL，则可接种于普通浓度的 乳糖蛋白胨培养液10mL中。
蛋白胨
10g
牛肉膏
3g
乳糖
5g
氯化钠
5g
1.6%溴甲酚紫乙醇溶液
1mL
蒸馏水
1000mL
制法：
将蛋白胨、牛肉膏、乳糖、氯化钠加热溶解于1000mL 蒸馏水中，
调节pH 为7.2～7.4，再加入1.6%溴甲酚紫乙醇溶液1mL，充分混匀，
分装于含有倒置的小玻璃管的试管中，于高压蒸汽灭菌器中，在115
℃灭菌20min，贮存于暗处备用。
10 mL 1 mL 1 mL 1 mL 1 mL
原液
90 mL 9 mL 9 mL 9 mL 9 mL 无菌水 无菌水 无菌水 无菌水 无菌水
10-1
10-2
10-3
10-4
10-5
3.3 粪大肠菌群的初发酵
10-3
10-4
10-5
杜 氏 小 管 10ml 3倍
杜 氏 小 管
10 ml 1倍
杜 氏 小 管 10 ml 1倍
职业教育环境监测与治理技术专业教学资源库
粪大肠菌群检测方法20110520
粪大肠菌群的测定（多管发酵法）一、检测限二、试剂(均为分析纯)1、配制单倍乳糖蛋白胨培养液（1份量）(因有固体培养基，以下配置方法仅做参考)单倍乳糖蛋白胨培养液成分：蛋白胨10g、牛肉浸膏3g、乳糖5g、氯化钠5g、1.6%溴甲酚紫乙醇溶液1mL、碳酸钠10.6g。
1.6%溴甲酚紫乙醇溶液（1mL）：称取溴甲酚紫1.6g倒入小烧杯，用少量95%乙醇溶解，移至100mL容量瓶，用95%乙醇多次洗小烧杯，洗液移入容量瓶，最后用95%乙醇定容至100mL，摇匀备用。
（滤纸、100mL小烧杯2只、100mL容量瓶1只、95%乙醇、玻璃棒、药匙、天平、滴管、溴甲酚紫）碳酸钠（10.6g）：称取10.6g碳酸钠溶于蒸馏水，并定容到100mL。
（100mL容量瓶1个、100mL小烧杯2只、碳酸钠）将单倍乳糖蛋白胨培养液成分蛋白胨10g、牛肉浸膏3g、乳糖5g、氯化钠5g加热溶解于1000mL蒸馏水中，调节pH为7.2~7.4（用10%碳酸钠调节），再加入1.6%溴甲酚紫乙醇溶液1mL，充分混匀，分装于含有倒置的小玻璃管的试管(10mL左右)中，于高压蒸汽灭菌器中，在115℃灭菌20min，贮存于暗处备用（冰箱中可存放3个月）。
(>1L锥形瓶1只、1mL移液管1根、pH计、电炉、倒置的小玻璃管的试管60套（小试管(12x150mm ）+小套管（杜氏小管）（约6mm × 36mm )）、高压蒸汽灭菌器、试管架（10只入）、纱布和棉花)2、三倍配制单倍乳糖蛋白胨培养液：制法同上，除蒸馏水外，其余配方比例三倍。
3、EC培养液（1份量）将EC培养液所需成分胰胨20g、乳糖5g、胆盐三号1.5g、磷酸氢二钾（K2HPO4）4g、磷酸二氢钾（KH2PO4）1.5g、氯化钠5g，加热溶解于1L烧杯中，然后分装于含有玻璃倒管的试管中。
用10%Na2CO3调节pH以防止培养基灭菌后pH上升0.2左右（确定值需要前期在实验室寻找规律）。
粪大肠菌群检测方法
粪大肠菌群检测方法
粪大肠菌群检测是一种常用的微生物检测方法，用于评估肠道内大肠埃希杆菌等菌群的数量和组成。
以下介绍几种常见的粪大肠菌群检测方法：
1. 传统培养法：该方法通过将粪便样本接种在含有特定培养基的培养皿中，利用培养皿中的营养物质、温度等条件，使大肠菌群等菌种在培养基上生长。
然后通过观察培养皿中的菌落形态、颜色等特征，或进行进一步的生化试验，来鉴定和计数菌群。
这种方法操作简便，但需要较长时间（通常需要2-3天）。
2. PCR法：PCR（聚合酶链反应）是一种快速、高效的核酸扩增技术，可用于检测微生物的DNA或RNA。
在粪大肠菌群检测中，可以选择一种或多种特异引物，通过PCR扩增粪便样
本中的大肠菌群DNA片段。
扩增后的产物可以进行电泳分析，根据特定的条带模式来鉴定和计数菌群。
相比传统培养法，PCR法的优势在于快速、高灵敏度和特异性。
3. 16S rRNA测序法：16S rRNA是细菌基因组中高保守的区域，其序列具有物种特异性。
基于16S rRNA序列的差异，可以通
过测序技术快速准确地鉴定粪大肠菌群的组成。
该方法可通过提取粪便样本中的总DNA，进行PCR扩增和纯化后，进行高
通量测序。
测序结果可以使用相应的数据库比对，识别和计数样本中的各种大肠菌群。
总结来说，传统培养法、PCR法和16S rRNA测序法是常见的
粪大肠菌群检测方法。
其中，PCR法和16S rRNA测序法更加
快速、准确，逐渐成为主流的检测方法。
这些方法的应用有助于揭示肠道微生物群落的组成和功能，为相关疾病的诊断和治疗提供依据。
粪大肠菌群的测定步骤
粪大肠菌群的测定1、半个月前配好初、复发酵所需培养液2、采样时用500ml 广口玻璃瓶分开采样，牛皮纸封口3、操作（1） 培养液初发酵 单倍乳糖蛋白胨培养液：蛋白胨 10 g牛肉浸膏 3 g乳糖 5 g氯化钠 5 g蒸馏水 1000ml调节PH 为7.2—7.4（NaOH ）6%溴甲基紫乙醇溶液 1 ml 充分混匀后 10ml （三倍是5ml ）分装于试管中，盖紧塞于蒸气锅中灭菌20min （0.1—0.5kpa ），冷却后于药品储存箱保存。
单月13个地表水（每个水样需10个单倍，5个三倍），2个创业（每个水样需15个单倍）。
共190个（1900ml ）单倍，65个三倍（325ml ）。
双月10个地表水，2个创业。
共130个（1600ml ）单倍，50个三倍（250ml ）。
创业的水一个月采两次水样复发酵 EC 培养液胰胨 20 g乳糖 5 g胆盐三号 1.5 g磷酸氢二钾 4 g磷酸二氢钾 1.5 g氯化钠 5 g蒸馏水 1000ml充分混匀后 10ml 分装于试管中，盖紧塞于蒸气锅中灭菌20min （0.1—0.5kpa ），冷却后于药品储存箱保存。
三倍乳糖蛋白胨培养液： 蛋白胨 30 g 牛肉浸膏 9 g 乳糖 15 g 氯化钠 15 g 蒸馏水 1000ml 溴甲基紫乙醇溶液 3 ml（2）做样初发酵：地表水15根管为一个水样。
5根为一组。
第一排为5ml三倍培养液，加10ml水样；第二排为10ml单倍培养液，加1ml水样；第三排为10ml单倍培养液，取1ml水样稀释至10ml后再从中取1ml至装有培养液的试管。
（10、1、0.1的取样量）创业，每个水样15根单倍。
同上逐级稀释，取样量为0.1、0.01、0.001ml。
将初发酵管放入培养箱中培养，温度为37℃±0.5℃，时间为24h±2h。
观察：产酸产气为阳性，即变色且有气泡产生，可轻击试管查气泡。
复发酵：呈阳性的试管进行接种后，做复发酵。
GBT 肥料中粪大肠菌群的测定
GB/ 肥料中粪大肠菌群的测定1 范围本标准规定了肥料中粪大肠菌群的测定方法。
2 定义粪大肠菌群 fecal coliforms系指一群在℃±℃条件能发酵乳糖、产酸产气、需氧和兼性厌氧的革兰氏阴性无芽胞杆菌。
粪大肠菌群数为每克（毫升）肥料样品中粪大肠菌群的最可能数（MPN）。
3 设备和材料（内容略）4 培养基和试剂培养基：遵照附录A的规定。
革兰氏染色液：遵照附录B的规定（略）。
5 检验步骤样品稀释在无菌操作下称取样品g或吸取样品10mL，加入到带玻璃珠的90 mL无菌水中，置于摇床上200 r/min 充分振荡30min，即成10-1稀释液。
用无菌移液管吸取 mL上述稀释液加入到45 mL无菌水中，混匀成10-2稀释液。
这样依次稀释，分别得到10-3，10-4等浓度稀释液（每个稀释度须更换无菌移液管）。
乳糖发酵试验选取三个连续适宜稀释液，分别吸取不同稀释液mL加入到乳糖胆盐发酵管内，每一稀释度接种3支发酵管，置℃±℃恒温水浴或隔水式培养箱内，培养24h±2h。
如果所有乳糖胆盐发酵管都不产酸不产气，则为粪大肠菌群阴性；如果有产酸产气或只产酸的发酵管，则按进行。
分离培养从产酸产气或只产酸的发酵管中分别挑取发酵液在伊红美蓝琼脂平板上划线，置36℃±1℃条件下培养18h～24h。
证实试验从分离平板上挑取可疑菌落，进行革兰氏染色。
染色反应阳性者为粪大肠菌群阴性；如果为革兰氏阴性无芽胞杆菌则挑取同样菌落接种在乳糖发酵管中，置℃±℃条件下培养24h ±2h。
观察产气情况，不产气为粪大肠菌群阴性；产气为粪大肠菌群阳性。
结果证实实验为粪大肠菌群阳性的，根据粪大肠菌群阳性发酵管数，查MPN检索表，得出每克（毫升）肥料样品中的粪大肠菌群数。
附录 A（规范性附录）培养基乳糖胆盐发酵培养基蛋白胨g猪胆盐g乳糖g%溴甲酚紫水溶液m L蒸馏水1000m LpH值～制法：将蛋白胨、猪胆盐及乳糖溶解于蒸馏水中，校正pH，加入溴甲酚紫水溶液，然后分装试管，每管9mL，并放入一支倒置的小套管，高压灭菌115℃15min。
酶底物法测粪大肠菌群标准
酶底物法测粪大肠菌群标准
酶底物法测量粪便中的大肠菌群是一种常用的方法，其标准可以根据具体的实验需求和研究目的来确定。
以下是一般情况下的标准参考：
1.反应时间：一般为24-48小时，视实验要求而定。
2.温度：通常在35-37摄氏度下进行反应。
3.反应液pH值：在酶底物法中，常使用的底物为4-苯胺甲酸
盐（p-aminobenzoic acid），需要在反应液中调节pH值为约
7.2-7.4，以适应大肠菌群的酶活性。
4.底物浓度：底物的浓度可以根据实验目的和需求进行调整和
优化。
一般来说，底物浓度在1-10 mM之间。
5.反应停止方法：常用的反应停止剂包括盐酸（HCl）或碱液
（如氢氧化钠NaOH）等，用于使反应停止并保持结果稳定。
具体的测量方法和标准可能会因实验目的、设备和试剂的不同而有所变化。
GBT肥料中粪大肠菌群的测定
G B T肥料中粪大肠菌群的测定集团标准化工作小组 #Q8QGGQT-GX8G08Q8-GNQGJ8-MHHGN#GB/ 肥料中粪大肠菌群的测定1 范围本标准规定了肥料中粪大肠菌群的测定方法。
2 定义粪大肠菌群 fecal coliforms系指一群在℃±℃条件能发酵乳糖、产酸产气、需氧和兼性厌氧的革兰氏阴性无芽胞杆菌。
粪大肠菌群数为每克（毫升）肥料样品中粪大肠菌群的最可能数（MPN）。
3 设备和材料（内容略）4 培养基和试剂培养基：遵照附录A的规定。
革兰氏染色液：遵照附录B的规定（略）。
5 检验步骤样品稀释在无菌操作下称取样品g或吸取样品10mL，加入到带玻璃珠的90 mL无菌水中，置于摇床上200r/min充分振荡30min，即成10-1稀释液。
用无菌移液管吸取 mL上述稀释液加入到45 mL无菌水中，混匀成10-2稀释液。
这样依次稀释，分别得到10-3，10-4等浓度稀释液（每个稀释度须更换无菌移液管）。
乳糖发酵试验选取三个连续适宜稀释液，分别吸取不同稀释液mL加入到乳糖胆盐发酵管内，每一稀释度接种3支发酵管，置℃±℃恒温水浴或隔水式培养箱内，培养24h±2h。
如果所有乳糖胆盐发酵管都不产酸不产气，则为粪大肠菌群阴性；如果有产酸产气或只产酸的发酵管，则按进行。
分离培养从产酸产气或只产酸的发酵管中分别挑取发酵液在伊红美蓝琼脂平板上划线，置36℃±1℃条件下培养18h～24h。
证实试验从分离平板上挑取可疑菌落，进行革兰氏染色。
染色反应阳性者为粪大肠菌群阴性；如果为革兰氏阴性无芽胞杆菌则挑取同样菌落接种在乳糖发酵管中，置℃±℃条件下培养24h ±2h。
观察产气情况，不产气为粪大肠菌群阴性；产气为粪大肠菌群阳性。
结果证实实验为粪大肠菌群阳性的，根据粪大肠菌群阳性发酵管数，查MPN检索表，得出每克（毫升）肥料样品中的粪大肠菌群数。
附录 A（规范性附录）培养基乳糖胆盐发酵培养基蛋白胨g猪胆盐g乳糖g%溴甲酚紫水溶液m L蒸馏水1000m LpH值～制法：将蛋白胨、猪胆盐及乳糖溶解于蒸馏水中，校正pH，加入溴甲酚紫水溶液，然后分装试管，每管9mL，并放入一支倒置的小套管，高压灭菌115℃15min。
粪大肠菌群检测方法作业指导书
粪大肠菌群检测方法作业指导书(多管发酵法)1、方法原理及适用范围多管发酵技术是以最可能数（most probable number，简称MPN）来表示试验结果的。
它是根据统计学理论，通过水样不同稀释浓度多组重复生物培养阳性结果估计水体中被测生物密度的一种方法，具体是通过查MPN表获得结果的。
适用于地表水、地下水及废水中粪大肠菌群的测定。
2、培养液和试剂2.1单倍乳糖蛋白胨培养液2.2三倍乳糖蛋白胨培养液2.3EC培养液2.4氯化钠3、样品测定3.1水样接种量将水样充分混匀后，根据水样污染的程度确定水样接种量。
每个样品至少用三个不同的水样量接种。
同一水样接种量要有五管。
相对未受污染的水样接种量为10ml、1ml、0.1ml。
受污染水样接种量根据污染程度接种1ml、0.1ml、0.01ml或0.1ml、0.01ml、0.001ml等。
使用的水样量可参考下表一。
水样种类检测方法接种量（mL）1005110.110-210-310-410-5井水多管发酵法×××河水、塘水多管发酵法×××湖水、塘水多管发酵法×××城市原污水多管发酵法×××如接种体积为10ml，则试管内应装有三倍乳糖蛋白胨培养液5ml；如接种量为1ml或少于1ml，则可接种于普通浓度的乳糖蛋白胨培养液10ml 中。
3.2初发酵试验将水样分别接种到盛有乳糖蛋白胨培养液的发酵管中。
在37℃±0.5℃下培养24±2h。
产酸和产气的发酵管表明试验阳性。
如有倒管内产气不明显，可轻拍试管，有小气泡升起的为阳性。
3.3复发酵试验轻微震荡初发酵试验阳性结果的发酵管，用3mm 接种环或灭菌棒将培养物转接到EC 培养液中。
在44.5℃±0.5℃温度下培养24h±2h。
接种后所有发酵管必须在30min 内放进水浴中。
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粪大肠菌群的测定
1 卫生学意义
粪大肠菌群测定的卫生学意义：一、与大肠菌群相比，粪大肠菌群在人和动物粪便中所占的比例较大，而且在自然界容易死亡。
因此，粪大肠菌群的存在表明食品近期内可能直接或间接的受到了粪便的污染；二、作为粪便污染指标评价食品的卫生状况，推断食品中肠道致病菌污染的可能性；三、常用做贝类和贝类养殖用水的卫生指标。
2 检验方法
2.1 术语与定义
一群在44.5℃培养24h-48h能发酵乳糖、产酸产气的需氧和兼性厌氧革兰氏阴性无芽胞杆菌。
卫生学概念，又称为耐热大肠菌群，主要是大肠杆菌，但也包括克雷伯氏菌属等。
2.2 设备和材料
除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其他设备和材料如下：
（1）恒温培养箱：36℃±1℃。
（2）冰箱：2℃～5℃。
（3）恒温水浴箱：46℃±1℃。
（4）天平：感量0.1g。
（5）无菌吸管：1mL（具0.01mL刻度）、10mL（具0.1mL刻度）或微量移液器及吸头。
（6）无菌锥形瓶：容量500mL。
（7）无菌培养皿：直径90mm。
（8）pH 计或pH 比色管或精密pH 试纸。
2.3 培养基和试剂
（1）月桂基硫酸盐胰蛋白胨（Lauryl Sulfate Tryptose，LST）肉汤：1）成分：胰蛋白胨或胰酪胨：20.0g；氯化钠：5.0g；乳糖：5.0g；磷酸氢
二钾（K
2HPO
4
）：2.75g；磷酸二氢钾（KH
2
PO
4
）：2.75g；月桂基硫酸钠：0.1g；
蒸馏水：1000mL；pH：6.8±0.2
2）制法：将上述成分溶解于蒸馏水中，调节 pH。
分装到有玻璃小倒管的试管中，每管10 mL。
121 ℃高压灭菌15 min。
（2）EC肉汤（E.coli，BGLB）：
1）成分：胰蛋白胨或胰酪胨：20.0 g；3号胆盐或混合胆盐：1.5 g；乳糖：
5.0g；磷酸氢二钾（K
2HPO
4
）：4.0g；磷酸二氢钾（KH
2
PO
4
）：1.5g；氯化钠：5.0g；
蒸馏水：1000mL；pH：6.9±0.1。
2）制法：将上述成分溶于约蒸馏水中，调节pH，分装到有玻璃小导管的试管中，每管8mL，121℃高温灭菌15min。
（3）无菌生理盐水：
1）成分：氯化钠：8.5 g；蒸馏水：1000mL；
2）制法：称取8.5g氯化钠溶于1000mL蒸馏水中，121℃高压灭菌15min。
2.4 检验程序
2.5 操作步骤
（1）初发酵
选择适宜的三个连续稀释度的样品匀液。
每个稀释度接种三管月桂基磺酸盐胰蛋白胨（LST）肉汤，每管接种1mL（如接种量需要超过1mL，则用双料LST肉汤）。
36℃±1℃培养24h±2h，检查倒管内是否有气泡产生或轻摇试管时是否有密集连续的细小气泡从管底逸出，如未产气则继续培养至48h±2h。
记录在24h和48h内产气的LST肉汤管数。
未产气者为粪大肠菌群阴性；对产气者，则进行复发酵试验。
（2）复发酵
用接种环从所有48h±2h内发酵产气的LST肉汤管中分别取培养物1环，移种于已提前预温至45℃的EC肉汤管中。
将所有接种的EC肉汤管放入于带盖的44.5℃±0.2℃恒温水浴箱内，水浴的水面应高于肉汤培养基液面，培养24h±2h，记录EC肉汤管的产气情况。
产气管为粪大肠菌群阳性，不产气为粪大肠菌群阴性。
注：EC肉汤管在接种之前要提前预温至45℃，因为这个温度是选择性生长的条件之一，如果不提前预温，那些能够在44.5度以下生长的非粪大肠菌群类细菌在培养基的升温阶段就可能已经生长并发酵乳糖产气了。
2.6 结果与报告
证实为粪大肠菌群的阳性管数, 查(MPN)表, 报告每g（mL）样品中粪大肠菌群MPN值。