粪大肠菌群的测定步骤
GBT 肥料中粪大肠菌群的测定
GB/ 肥料中粪大肠菌群的测定1 范围本标准规定了肥料中粪大肠菌群的测定方法。
2 定义粪大肠菌群 fecal coliforms系指一群在℃±℃条件能发酵乳糖、产酸产气、需氧和兼性厌氧的革兰氏阴性无芽胞杆菌。
粪大肠菌群数为每克（毫升）肥料样品中粪大肠菌群的最可能数（MPN）。
3 设备和材料（内容略）4 培养基和试剂培养基：遵照附录A的规定。
革兰氏染色液：遵照附录B的规定（略）。
5 检验步骤样品稀释在无菌操作下称取样品g或吸取样品10mL，加入到带玻璃珠的90 mL无菌水中，置于摇床上200 r/min 充分振荡30min，即成10-1稀释液。
用无菌移液管吸取 mL上述稀释液加入到45 mL无菌水中，混匀成10-2稀释液。
这样依次稀释，分别得到10-3，10-4等浓度稀释液（每个稀释度须更换无菌移液管）。
乳糖发酵试验选取三个连续适宜稀释液，分别吸取不同稀释液mL加入到乳糖胆盐发酵管内，每一稀释度接种3支发酵管，置℃±℃恒温水浴或隔水式培养箱内，培养24h±2h。
如果所有乳糖胆盐发酵管都不产酸不产气，则为粪大肠菌群阴性；如果有产酸产气或只产酸的发酵管，则按进行。
分离培养从产酸产气或只产酸的发酵管中分别挑取发酵液在伊红美蓝琼脂平板上划线，置36℃±1℃条件下培养18h～24h。
证实试验从分离平板上挑取可疑菌落，进行革兰氏染色。
染色反应阳性者为粪大肠菌群阴性；如果为革兰氏阴性无芽胞杆菌则挑取同样菌落接种在乳糖发酵管中，置℃±℃条件下培养24h ±2h。
观察产气情况，不产气为粪大肠菌群阴性；产气为粪大肠菌群阳性。
结果证实实验为粪大肠菌群阳性的，根据粪大肠菌群阳性发酵管数，查MPN检索表，得出每克（毫升）肥料样品中的粪大肠菌群数。
附录 A（规范性附录）培养基乳糖胆盐发酵培养基蛋白胨g猪胆盐g乳糖g%溴甲酚紫水溶液m L蒸馏水1000m LpH值～制法：将蛋白胨、猪胆盐及乳糖溶解于蒸馏水中，校正pH，加入溴甲酚紫水溶液，然后分装试管，每管9mL，并放入一支倒置的小套管，高压灭菌115℃15min。
粪大肠菌群的测定
15.7mg硫代硫酸钠可去除样品中1.5mg活性氯，硫代硫酸钠用量可 根据样品实际活性氯量调整。
4 .无菌水:取适量实验用水，经 高压蒸汽灭菌20min， 备用。 5. 硫代硫酸钠( Na2S2O3.5H2O)。 (去除游离氯) 6.乙二胺四乙酸二钠(C10H14N2O8Na2 .2H2O)。 7.乙二胺四乙酸二钠溶液: ρ (C10H14N2O8Na2 .2H2O) =0.15 g/ml 称取15g乙二胺四乙酸二钠,溶于适量水中，定容至100ml,此溶液可保存 30d。 8.硫代硫酸钠溶液: ρ ( Na2S2O3.5H2O) =0.10 g/ml 称取15.7g硫代硫酸钠， 溶于适量水中，定容至100ml，临用现配。
2. 浓缩乳糖蛋白胨培养液： (此溶液用于检验大肠菌群) 按上述乳糖蛋白胨培养液的制备方法配制。除蒸馏水外，各组分用量 增加至三倍。 (即按上述配方比例三倍 (除蒸馏水外) ，配成三倍浓 缩的乳糖蛋白胨培养液)
①在何种情况下用多少三倍浓度的培养基接种？ 答：接种体积为10ml时，试管内应装入有3倍浓度乳糖蛋 白胨培养液5ml。
• 三、肯定要加塞子的，我们用的塞子是软材料 (好像是软橡胶？ 白色的，塞子中间另有一 个可以活动的塞子，能保证加塞后的试管透气，其实用什么材料不重要的。
• 四、需要的仪器设备为：生化培养箱、无菌操作台 (空气精华级别100) 、高压灭菌锅、 冰箱、干燥箱。
五、干扰和消除
1.
,能破坏微生物细胞内的酶活性，导
若接种量过高，培养液应加倍成分。这是由于样品的量大 的情况下，培养液稀释大,各种成分的相对浓度就会不足， 就不能满足细菌的生长要求，存在实验失败的概率。因此， 合理调整样品量和营养液浓度的比例需要反复实验和多组 对照。
过滤膜法测粪大肠菌群数-国标方法
滤膜法-粪大肠菌群的测定1、适用范围本标准适用于地表水、地下水、及水中粪大肠菌群的测定。
用于检验加氯消毒的水样时，在滤膜法之前，先做试验，证实它所得的数据资料与多管发酵试验所得的数据资料具有可比性。
2、原理滤膜是一种微孔性薄膜。
将水样注入已灭菌的放有滤膜（孔径0.45微米）的滤器中，经过抽滤，细菌即被截留在膜上，然后将滤膜贴于M-FC培养基上，44.5℃温度下进行培养，计数滤膜上生长的此特性的菌落数，计算出每1L水样中含有粪大肠菌群数。
3仪器：滤膜（孔径0.45微米）、滤器、接液瓶、垫圈、无菌镊子夹3、培养基和试剂本标准所用试剂除另有注明外，均为符合国家标准的分析纯化学试剂，实验室用水为新制备的去离子水。
M-FC培养基：胰胨10g蛋白胨5g酵母浸膏 3.0g氯化钠 5.0g乳糖12.5g胆盐三号 1.5g1%苯胺蓝水溶10ml1%玫瑰色酸溶液（溶于0.2mol/L氢氧化钠液中）10ml蒸馏水1000ml制法：将上述培养基中的成分（除苯胺蓝和玫瑰色酸外），置于蒸馏水中加热溶解，调节PH为7.4，分装于小烧瓶内，每瓶100ml，于115℃灭菌20min。
储存于冰箱中备用，临用前，按上述配比，用灭菌吸管分别加入已煮沸灭菌的1%苯胺蓝溶液1ml及新配制的1%玫瑰色酸溶液（溶于氢氧化钠溶液）1ml，混合均匀。
加热溶解前，加入1.2%～1.5%琼脂制成固体培养基。
如培养物中杂菌不多，则培养基中不加玫瑰色酸亦可。
4、步骤水样的选择：水样量的选择根据细菌受检验的特征和水样中预测的细菌密度而定。
理想的水样体积是一片滤膜上生长20～60个粪大肠群菌落，总菌落数不超过200个。
滤膜及滤膜灭菌：将滤膜放入高压蒸汽灭菌锅里在121℃灭菌10min，滤器、接液瓶、垫圈分别用纸包好，在使用前经121℃灭菌20min，滤器也可用点燃的酒精棉球火焰灭菌。
过滤：用无菌镊子夹取灭菌滤膜边缘，将粗糙面向上，贴放在已灭菌的滤床上，稳妥的固定好滤器。
肥料中粪大肠菌群的测定
肥料中粪大肠菌群的测定一：前期准备一次性帽子、口罩、脚套1， 移液管10ml 量筒100ml ｝玻璃珠 三角瓶 培养皿2， 乳糖胆盐发酵培养基（用于乳糖发酵） 乳糖发酵培养基（用于复发酵）伊红美蓝培养基（用于分离培养） } 121℃，15min无菌水 } 121℃，15min二：实验过程无菌条件下进行：10.0g 固体样品/10ml 液体样品↓三角瓶（带玻璃珠，90ml 无菌水）1:10=10-1↓200r/min 振荡30min↓吸取10-1—5ml ，加入45ml 无菌水（提前准备）1:100=10-2↓吸取吸取10-2—5ml ，加入45ml 无菌水（提前准备）1:1000=10-3↓……依次稀释得到10-4，10-5等浓度稀释液（每个稀释度必须更换无菌移液管）↓选取三个连续适宜稀释液，分别吸取1.0ml 加入到乳糖胆盐发酵管内（装有乳糖胆盐发酵培养基）（每一稀释度接种3支发酵管）↓培养箱45℃，24h↓结果：产酸，颜色变；产气，导管有气泡不产酸，不产气，为粪大肠菌群阴性↓分离培养：从产酸产气或只产酸的发酵管中挑取发酵液在伊红美蓝培养基平板上划线↓培养箱36℃，18-24h↓证实实验：从平板上挑取可以菌落，进行革兰氏染色。
结果：染色反应阳性者为粪大肠菌群阴性↓革兰氏阴性无芽孢杆菌，则挑取同样菌落接种在乳糖发酵管中（装有乳糖发酵培养基）↓培养箱44.5℃，24h↓结果，不产气为粪大肠菌群阴性，产气为粪大肠菌群阳性↓证实为粪大肠菌群阳性的，根据粪大肠菌群阳性发酵管数，查MPN 检索表，得出每克（毫升）肥料样品中的粪大肠菌群数 ｝160℃，4h ｝115℃，15min。
粪大肠菌群的测定步骤
粪大肠菌群的测定1、半个月前配好初、复发酵所需培养液2、采样时用500ml 广口玻璃瓶分开采样，牛皮纸封口3、操作（1） 培养液初发酵 单倍乳糖蛋白胨培养液：蛋白胨 10 g牛肉浸膏 3 g乳糖 5 g氯化钠 5 g蒸馏水 1000ml调节PH 为7.2—7.4（NaOH ）6%溴甲基紫乙醇溶液 1 ml 充分混匀后 10ml （三倍是5ml ）分装于试管中，盖紧塞于蒸气锅中灭菌20min （0.1—0.5kpa ），冷却后于药品储存箱保存。
单月13个地表水（每个水样需10个单倍，5个三倍），2个创业（每个水样需15个单倍）。
共190个（1900ml ）单倍，65个三倍（325ml ）。
双月10个地表水，2个创业。
共130个（1600ml ）单倍，50个三倍（250ml ）。
创业的水一个月采两次水样复发酵 EC 培养液胰胨 20 g乳糖 5 g胆盐三号 1.5 g磷酸氢二钾 4 g磷酸二氢钾 1.5 g氯化钠 5 g蒸馏水 1000ml充分混匀后 10ml 分装于试管中，盖紧塞于蒸气锅中灭菌20min （0.1—0.5kpa ），冷却后于药品储存箱保存。
三倍乳糖蛋白胨培养液： 蛋白胨 30 g 牛肉浸膏 9 g 乳糖 15 g 氯化钠 15 g 蒸馏水 1000ml 溴甲基紫乙醇溶液 3 ml（2）做样初发酵：地表水15根管为一个水样。
5根为一组。
第一排为5ml三倍培养液，加10ml水样；第二排为10ml单倍培养液，加1ml水样；第三排为10ml单倍培养液，取1ml水样稀释至10ml后再从中取1ml至装有培养液的试管。
（10、1、0.1的取样量）创业，每个水样15根单倍。
同上逐级稀释，取样量为0.1、0.01、0.001ml。
将初发酵管放入培养箱中培养，温度为37℃±0.5℃，时间为24h±2h。
观察：产酸产气为阳性，即变色且有气泡产生，可轻击试管查气泡。
复发酵：呈阳性的试管进行接种后，做复发酵。
酶底物法测粪大肠菌群标准
酶底物法测粪大肠菌群标准
摘要：
I.引言
A.酶底物法简介
B.粪大肠菌群检测的重要性
II.酶底物法测粪大肠菌群的标准方法
A.仪器和材料
B.实验步骤
1.准备工作
2.样品处理
3.酶底物反应
4.结果分析
III.酶底物法与其他检测方法的比较
A.纸片快速法
B.固定底物酶底物法
IV.应用案例
A.实际水样检测
B.检测结果比较
V.结论
A.酶底物法的优点
B.未来发展方向
正文：
酶底物法是一种常用于测定粪大肠菌群的方法，具有操作简便、结果准确等优点。
粪大肠菌群检测是环境监测的重要指标，对于评估水体污染程度、保障饮水安全具有重要意义。
酶底物法测粪大肠菌群的标准方法主要包括以下步骤：首先，准备所需的仪器和材料，如高压蒸汽灭菌器、恒温培养箱、程控定量封口机、紫外灯、移液管等。
然后，进行样品处理，包括采集水样、添加抑制剂等。
接下来，进行酶底物反应，将酶底物加入反应液中，观察其变化。
最后，对结果进行分析，计算粪大肠菌群的数量。
酶底物法与其他检测方法相比，如纸片快速法和固定底物酶底物法，具有较高的准确性和灵敏度。
在实际应用中，酶底物法已被广泛用于环境监测领域，取得了良好的效果。
例如，在检测实际水样中的粪大肠菌群时，采用酶底物法可以获得较为准确的结果，有助于评估水体的污染状况。
总之，酶底物法作为一种有效、可靠的粪大肠菌群检测方法，在环境监测领域具有广泛的应用前景。
然而，在实际操作中仍需注意一些问题，如避免实验操作过程中的污染、选择合适的酶底物等，以提高检测结果的准确性。
耐热大肠菌群粪大肠菌群快速检测（酶底物法）
耐热⼤肠菌群粪⼤肠菌群快速检测（酶底物法）1 适⽤范围本⽅法适⽤于⽣活饮⽤⽔及其⽔源⽔、地表⽔、污⽔、废⽔等⽔中粪⼤肠菌群（耐热⼤肠菌群）的定性检测、定量检测2 ⽅法原理固定底物酶底物法（DST）采⽤⼤肠菌群细菌能产⽣β-半乳糖苷酶分解ONPG使培养液呈黄⾊的原理，来判断⽔样中是否含粪⼤肠菌群（耐热⼤肠菌群），粪⼤肠的培养温度是44.5℃。
3 仪器设备3.1 程控定量封⼝机3.2电热恒温培养箱3.3 冰箱3.4 51孔定量盘、97孔定量盘3.5 100ml⽆菌⽔样瓶3.6 ⾼压蒸汽灭菌锅3.7 ⼲热灭菌器3.8 量筒3.9 吸管3.10 试管4 培养基和试剂4.1 科⽴得（固定底物技术酶底物法）检测试剂：MMO-MUG培养基4.2 ⽆菌⽔5 样品的采集和保存5.1采样前准备：5.1.1 采样瓶：采⽤IDEXX公司科⽴得系统配套的灭菌100毫升消毒带刻度容器。
5.2 样品采样及注意事项5.2.1将已灭菌和封包好的采样瓶，⽆论在什么条件下采样时，均要⼩⼼开启包封纸和瓶盖，避免瓶盖及瓶⼦颈部受杂菌污染，并注意在使⽤船只或附带的采样绳等附加设备采样时可能造成的污染。
5.2.2 在采集江、河、湖、库、地表⽔样时，可握住瓶⼦底部直接将采样瓶插⼊⽔中，约距⽔⾯10~15厘⽶处，瓶⼝朝来⽔⽅向，使⽔样灌⼊瓶内。
如果没有⽔流，可握住瓶⼦⽔平前推，直⾄充满⽔样为⽌。
采好样后，迅速盖上瓶盖和包装纸。
采样后，采样瓶内上部应留有⼀些空隙，以便检验前充分混匀⽔样。
5.2.3 ⽤采样器采样时，将⽆菌的⽔样瓶放⼊架内。
将采样装置放⼊⽔中。
到达预定深度后，打开瓶塞，待⽔样灌好后，松开瓶塞的软绳，盖上瓶盖。
再将整个装置提出⽔⾯。
5.2.4 从⾃来⽔龙头采集样品时，不要选⽤漏⽔的龙头，采⽔前可先将⽔龙头⽤酒精灯⽕焰灼烧灭菌或⽤70%的酒精溶液消毒⽔龙头及采样瓶⼝，然后将⽔龙头完全打开，放⽔数分钟后除去⽔管中的滞留杂质。
采⽔时控制⽔流速度⼩⼼接⼊瓶内。
粪大肠菌群的测定
LPEMS⁄ZYA-43-2011生活饮用水中耐热大肠菌群、总大肠菌群、大肠埃希氏菌的测定——酶底物法一、实验原理该革新的检测技术利用分别由大肠菌群β-半乳糖苷酶及大肠杆菌β-葡萄糖醛酸酶代谢的两种「营养剂─指示剂」：邻硝基苯-β-D-半乳派喃糖（ONPG）及甲基香豆基葡糖醛酸苷（MUG），作为Colilert试剂的主要碳源。
1、利用大肠菌群细菌能产生β2 半乳糖苷酶分解ONPG 使培养液呈黄色，检测大肠菌群；2、利用大肠埃希氏菌产生β2 葡萄糖醛酸酶分解MUG 使培养液在波长366nm 紫外光下产生蓝色荧光，检测大肠埃希氏菌；3、改变培养温度，可检测耐热大肠菌群。
因为大多数非─大肠杆菌属菌类没有这些酶，所以无法在Colilert试剂里生长及干涉这些物质。
而有这些酶的少数非─大肠杆菌属菌类会受到Colilert 特殊配方的基质选择性的抑制作用（专利技术）。
二、仪器和试剂耗材1、检测设备—程控定量封口机Quanti-TraySealer Model 2X 美国IDEXX；2、可充电紫外灯，6W，220V，366nm；3、紫外线防护镜；4、DST酶底物法24小时Colilert试剂美程控定量封口机国IDEXX；5、51孔定量盘（无菌）；97孔定量盘（无菌）6、阳性标准比色瓶，阳性51孔标准比色盘；7、100mL含硫代硫酸钠无菌取样袋/瓶；M U G试剂（科立得）定量盘（51孔或者97孔）取样瓶8.记号笔；9.无菌剪刀；10.无菌夹子；11.一次性医用无菌手套。
四、实验步骤1.操作流程图酶底物法即可以作定性又可以作定量分析，同时检测两个指标，总大肠菌群（total coli）和大肠埃希氏菌（Escherichia coli），方法简便，快速，结果准确。
2.操作说明注意：如果不按照说明使用机器，可能会有人员伤害、机器损害、其他财产损害以及出现检测结果不准确。
（1）操作前后或离开实验室必须用肥皂或消毒液洗手。
GBT肥料中粪大肠菌群的测定
G B T肥料中粪大肠菌群的测定Document serial number【LGGKGB-LGG98YT-LGGT8CB-LGUT-GB/ 肥料中粪大肠菌群的测定1 范围本标准规定了肥料中粪大肠菌群的测定方法。
2 定义粪大肠菌群 fecal coliforms系指一群在℃±℃条件能发酵乳糖、产酸产气、需氧和兼性厌氧的革兰氏阴性无芽胞杆菌。
粪大肠菌群数为每克（毫升）肥料样品中粪大肠菌群的最可能数（MPN）。
3 设备和材料（内容略）4 培养基和试剂培养基：遵照附录A的规定。
革兰氏染色液：遵照附录B的规定（略）。
5 检验步骤样品稀释在无菌操作下称取样品g或吸取样品10mL，加入到带玻璃珠的90 mL无菌水中，置于摇床上200r/min充分振荡30min，即成10-1稀释液。
用无菌移液管吸取 mL上述稀释液加入到45 mL无菌水中，混匀成10-2稀释液。
这样依次稀释，分别得到10-3，10-4等浓度稀释液（每个稀释度须更换无菌移液管）。
乳糖发酵试验选取三个连续适宜稀释液，分别吸取不同稀释液mL加入到乳糖胆盐发酵管内，每一稀释度接种3支发酵管，置℃±℃恒温水浴或隔水式培养箱内，培养24h±2h。
如果所有乳糖胆盐发酵管都不产酸不产气，则为粪大肠菌群阴性；如果有产酸产气或只产酸的发酵管，则按进行。
分离培养从产酸产气或只产酸的发酵管中分别挑取发酵液在伊红美蓝琼脂平板上划线，置36℃±1℃条件下培养18h～24h。
证实试验从分离平板上挑取可疑菌落，进行革兰氏染色。
染色反应阳性者为粪大肠菌群阴性；如果为革兰氏阴性无芽胞杆菌则挑取同样菌落接种在乳糖发酵管中，置℃±℃条件下培养24h ±2h。
观察产气情况，不产气为粪大肠菌群阴性；产气为粪大肠菌群阳性。
结果证实实验为粪大肠菌群阳性的，根据粪大肠菌群阳性发酵管数，查MPN检索表，得出每克（毫升）肥料样品中的粪大肠菌群数。
方法验证水质的粪大肠菌群
方法验证报告测试方法：HJ 347.2-2018测试项目：水质粪大肠菌群编写：日期：审核：日期：批准：日期：水质粪大肠菌群的方法验证1.目的确认所采用的方法适合于在本实验室进行对水质的粪大肠菌群的测定，照此方法检测和检验条件进行水样的粪大肠菌群检测，能保证检验结果的准确、可靠。
2.原理和范围2.1原理将样品加入含乳糖蛋白胨培养基的试管中，37℃初发酵富集培养，大肠菌群在培养基中生长繁殖分解乳糖产酸产气，产生的酸使溴甲酚紫指示剂由紫色变为黄色，产生的气体进入倒管中，指示产气。
44℃复发酵培养，培养基中的胆盐三号可抑制革兰氏阳性菌的生长，最后产气的细菌确定为是粪大肠菌群。
通过查MPN表，得出粪大肠菌群浓度值。
2.2范围本法适用于地表水、地下水、生活污水和工业废水中粪大肠菌群的测定。
3.主要仪器3.1 净化工作台。
3.2 立式高压蒸汽灭菌器。
3.3恒温恒湿培养箱。
3.4电热恒温鼓风干燥箱。
3.5电子天平。
3.6酒精灯、试管架、试管（带塞子）、平皿、小倒管、三角烧瓶（带塞子）、刻度吸管、采样瓶、接种环。
4.主要试剂乳糖蛋白胨培养液、EC培养液。
5.检验步骤5.1样品稀释与接种5.1.1 15管法将样品充分混匀后，在5支装有已灭菌5ml三倍乳糖蛋白胨培养液的大试管中（内有小倒管），按无菌操作要求各加入样品10ml，在5支装有已灭菌的10ml单倍乳糖蛋白胨培养液中（内有小倒管），按无菌操作要求各加入样品1ml，在5支装有已灭菌的10ml单倍乳糖蛋白胨培养液中（内有小倒管），按无菌操作要求各加入样品0.1ml。
对于受到污染的样品，先将样品稀释后再按照上述操作接种，以生活污水为例，先将样品稀释104倍，然后按照上述操作步骤分别接种10ml 、1ml 、0.1ml 。
当样品接种量小于1ml 时，应将样品制成稀释样品后使用。
按无菌操作要求方式吸取10ml 充分混匀的样品，注入盛有90ml 无菌水的三角烧瓶中，混匀成1：10稀释样品。
粪大肠菌群检测
粪大肠菌群检测一、室所用设备、器皿1、无菌区工作台2、恒温培养箱3、高压蒸汽灭菌器4、冰箱5、酒精灯6、天平7、电炉8、采样广口瓶9、烧杯、玻璃棒10 、玻璃发酵管11、试管架12、移液管13、锥形瓶二、药品：乳糖胆盐培养基三、前期准备1、玻璃器皿灭菌（高压蒸汽灭菌）所用采集水样的广口瓶、玻璃试管、移液管、玻璃棒、锥形瓶等玻璃器皿均需放入高压锅灭菌。
广口瓶：将清洗干净的采样瓶盖好瓶盖，用牛皮纸、报纸等防潮纸将瓶盖、瓶顶和瓶颈处包裹好，用绳子绑好，置于121℃的高压蒸汽灭菌器灭菌15分钟。
玻璃试管、移液管、玻璃棒：用牛皮纸、报纸等防潮纸将其包裹好，置于121℃的高压蒸汽灭菌器灭菌15分钟。
2、采样采取水样时，可握住瓶子下部直接将已灭菌的带盖采样瓶插入水中，约距水面10~15cm处，拔瓶盖，瓶口朝水流方向，使水样灌入瓶内然后盖上瓶盖，将采样瓶从水中取出。
如果没有水流，可握住瓶子水平前推，直到充满水样为止。
采好水样后，迅速盖上瓶盖和包装纸。
采好的水样，应迅速运往实验室，进行检验，一般从取样到检验不宜超过2h，否则应使用10℃以下的冷藏设备保存样品，但不得超过6h。
四、实验步骤（多管发酵法）1、配制乳糖胆盐培养基试制（注：做15管的话，10ml的要配双料的，如：30g配1000ml，就应称取60g配1000ml，其他1ml、0.1ml的配制成单料的）,配制试剂时不用定容，只需大概体积即可。
2、称取12g乳糖胆盐培养基溶于200ml蒸馏水中，置于电炉上加热至溶解完全为止，冷却至室温后，分装于玻璃发酵管里。
（5管10ml）3、称取6g乳糖胆盐培养基溶于100ml蒸馏水中，置于电炉上加热至溶解完全为止，冷却至室温后，分装于玻璃发酵管里。
（10管10ml）5、所有发酵管盖好盖子，包裹好置于高压锅灭菌15 分钟（第一次曝气开始计时）6、分别加入5管10ml、5管1ml、5管0.1ml的水样于已冷却至室温的发酵管中，并置于恒温培养箱里培养24小时（温度为44.5℃）五、结果根据不同接种量的发酵管所出现阳性结果的数目，从MPN表中查得相应的MPN指数，按总大肠菌群的计算方法计算每升水中粪大肠菌群细菌的MPN值。
滤膜法测定粪大肠菌群
滤膜法测定粪大肠菌群37.1.1 主题内容与适用范围本方法规定了生活饮用水中粪大肠菌群的滤膜测定方法。
本方法适用于生活饮用水和低浊度的水源水中粪大肠菌群数的测定。
37.1.2 方法提要用孔径为0.45μm的微孔滤膜过滤水样，细菌被截留在滤膜上，将滤膜贴在MFC培养基上，经44.5℃培养后，计数典型菌落。
37.1.3 培养基与试剂37.1.3.1 MFC培养基37.1.3.1.1 成份A 胰胨 10gB 多胨 5gC 酵母浸膏 3gD 氯化钠 5gE 乳糖 12.5gF 胆盐3号(Bile salt No.3)或混合胆盐 1.5gG 琼脂 15gH 苯胺蓝 0.2gI 蒸馏水 1000mL37.1.3.1.2 制法: 在1000mL蒸馏水中先加入玫红酸(10g/L)的氢氧化钠溶液[C(NaOH)＝0.2mol/L] 10mL，混合后，取500mL加入琼脂煮沸溶解，于另外500mL 蒸馏水中，加入除苯胺蓝以外的其他试剂，加热溶解，倒入已溶解的琼脂，混匀后调pH为7.4，加入苯胺蓝煮沸，迅速离开热源，待冷却至60℃左右，制成平板，不可高压灭菌。
制好的培养基应存放于2～10℃，不超过96h。
本培养基也可不加琼脂，制成液体培养基，使用时加2mL于灭菌吸收垫上，再将滤膜置于培养垫上培养。
37.1.3.2 EC培养基37.1.3.2.1 成份A 胰蛋白胨 20gB 乳糖 5g37.1.1 主题内容与适用范围本方法规定了生活饮用水中粪大肠菌群的滤膜测定方法。
本方法适用于生活饮用水和低浊度的水源水中粪大肠菌群数的测定。
37.1.2 方法提要用孔径为0.45μm的微孔滤膜过滤水样，细菌被截留在滤膜上，将滤膜贴在MFC培养基上，经44.5℃培养后，计数典型菌落。
37.1.3 培养基与试剂37.1.3.1 MFC培养基37.1.3.1.1 成份A 胰胨 10gB 多胨 5gC 酵母浸膏 3gD 氯化钠 5gE 乳糖 12.5gF 胆盐3号(Bile salt No.3)或混合胆盐 1.5gG 琼脂 15gH 苯胺蓝 0.2gI 蒸馏水 1000mL37.1.3.1.2 制法: 在1000mL蒸馏水中先加入玫红酸(10g/L)的氢氧化钠溶液[C(NaOH)＝0.2mol/L] 10mL，混合后，取500mL加入琼脂煮沸溶解，于另外500mL 蒸馏水中，加入除苯胺蓝以外的其他试剂，加热溶解，倒入已溶解的琼脂，混匀后调pH为7.4，加入苯胺蓝煮沸，迅速离开热源，待冷却至60℃左右，制成平板，不可高压灭菌。
粪大肠菌群检验记录
（4）天平：感量0.1g。
（5）无菌吸管：1mL（具0.01mL刻度）、10mL（具0.1mL刻度）或微量移液器及吸头。
（6）无菌锥形瓶：容量500mL。
（7）无菌培养皿：直径90mm。
（8）pH计或pH比色管或精密pH试纸。
1、操作步骤
（1）初发酵
选择适宜的三个连续稀释度的样品匀液。每个稀释度接种三管月桂基磺酸盐胰蛋白胨（LST）肉汤，每管接种1mL（如接种量需要超过1mL，则用双料LST肉汤）。36℃±1℃培养24h±2h，检查倒管内是否有气泡产生或轻摇试管时是否有密集连续的细小气泡从管底逸出，如未产气则继续培养至48h±2h。记录在24h和48h内产气的LST肉汤管数。未产气者为粪大肠菌群阴性；对产气者，则进行复发酵试验。
粪大肠菌群检查实验记录
品名
批号
物料编码
规格
来源
取样日期
代表量
检验日期
报告日期
检验编号
检验依据
1、粪大肠菌群检验记录
仪器设备名称：电热恒温培养箱仪器设备型号：DHP-500
生理盐水的配制：8.5g氯化钠加1000ml蒸馏水溶解待用（121℃灭菌30min）。
（1）恒温培养箱：36℃±1℃。
（2）冰箱：2℃～5℃。
稀释度
接种量
产气情况
BGLB肉汤培养后产气情况
阴性对照
原液
0.1g（ml）
0.01g（ml）
0.001g（ml）
检索MPN表结论：
备ห้องสมุดไป่ตู้：
检验员：复核员：
（5）初发酵试验：每个稀释度接种3管月桂基硫酸盐蛋白胨（LST）肉汤。
取1:10的稀释样1ml于标有0.1g的3只试管中，
粪大肠菌群检测方法20110520
粪大肠菌群的测定（多管发酵法）一、检测限二、试剂(均为分析纯)1、配制单倍乳糖蛋白胨培养液（1份量）(因有固体培养基，以下配置方法仅做参考)单倍乳糖蛋白胨培养液成分：蛋白胨10g、牛肉浸膏3g、乳糖5g、氯化钠5g、1.6%溴甲酚紫乙醇溶液1mL、碳酸钠10.6g。
1.6%溴甲酚紫乙醇溶液（1mL）：称取溴甲酚紫1.6g倒入小烧杯，用少量95%乙醇溶解，移至100mL容量瓶，用95%乙醇多次洗小烧杯，洗液移入容量瓶，最后用95%乙醇定容至100mL，摇匀备用。
（滤纸、100mL小烧杯2只、100mL容量瓶1只、95%乙醇、玻璃棒、药匙、天平、滴管、溴甲酚紫）碳酸钠（10.6g）：称取10.6g碳酸钠溶于蒸馏水，并定容到100mL。
（100mL容量瓶1个、100mL小烧杯2只、碳酸钠）将单倍乳糖蛋白胨培养液成分蛋白胨10g、牛肉浸膏3g、乳糖5g、氯化钠5g加热溶解于1000mL蒸馏水中，调节pH为7.2~7.4（用10%碳酸钠调节），再加入1.6%溴甲酚紫乙醇溶液1mL，充分混匀，分装于含有倒置的小玻璃管的试管(10mL左右)中，于高压蒸汽灭菌器中，在115℃灭菌20min，贮存于暗处备用（冰箱中可存放3个月）。
(>1L锥形瓶1只、1mL移液管1根、pH计、电炉、倒置的小玻璃管的试管60套（小试管(12x150mm ）+小套管（杜氏小管）（约6mm × 36mm )）、高压蒸汽灭菌器、试管架（10只入）、纱布和棉花)2、三倍配制单倍乳糖蛋白胨培养液：制法同上，除蒸馏水外，其余配方比例三倍。
3、EC培养液（1份量）将EC培养液所需成分胰胨20g、乳糖5g、胆盐三号1.5g、磷酸氢二钾（K2HPO4）4g、磷酸二氢钾（KH2PO4）1.5g、氯化钠5g，加热溶解于1L烧杯中，然后分装于含有玻璃倒管的试管中。
用10%Na2CO3调节pH以防止培养基灭菌后pH上升0.2左右（确定值需要前期在实验室寻找规律）。
GBT肥料中粪大肠菌群的测定
G B T肥料中粪大肠菌群的测定集团标准化工作小组 #Q8QGGQT-GX8G08Q8-GNQGJ8-MHHGN#GB/ 肥料中粪大肠菌群的测定1 范围本标准规定了肥料中粪大肠菌群的测定方法。
2 定义粪大肠菌群 fecal coliforms系指一群在℃±℃条件能发酵乳糖、产酸产气、需氧和兼性厌氧的革兰氏阴性无芽胞杆菌。
粪大肠菌群数为每克（毫升）肥料样品中粪大肠菌群的最可能数（MPN）。
3 设备和材料（内容略）4 培养基和试剂培养基：遵照附录A的规定。
革兰氏染色液：遵照附录B的规定（略）。
5 检验步骤样品稀释在无菌操作下称取样品g或吸取样品10mL，加入到带玻璃珠的90 mL无菌水中，置于摇床上200r/min充分振荡30min，即成10-1稀释液。
用无菌移液管吸取 mL上述稀释液加入到45 mL无菌水中，混匀成10-2稀释液。
这样依次稀释，分别得到10-3，10-4等浓度稀释液（每个稀释度须更换无菌移液管）。
乳糖发酵试验选取三个连续适宜稀释液，分别吸取不同稀释液mL加入到乳糖胆盐发酵管内，每一稀释度接种3支发酵管，置℃±℃恒温水浴或隔水式培养箱内，培养24h±2h。
如果所有乳糖胆盐发酵管都不产酸不产气，则为粪大肠菌群阴性；如果有产酸产气或只产酸的发酵管，则按进行。
分离培养从产酸产气或只产酸的发酵管中分别挑取发酵液在伊红美蓝琼脂平板上划线，置36℃±1℃条件下培养18h～24h。
证实试验从分离平板上挑取可疑菌落，进行革兰氏染色。
染色反应阳性者为粪大肠菌群阴性；如果为革兰氏阴性无芽胞杆菌则挑取同样菌落接种在乳糖发酵管中，置℃±℃条件下培养24h ±2h。
观察产气情况，不产气为粪大肠菌群阴性；产气为粪大肠菌群阳性。
结果证实实验为粪大肠菌群阳性的，根据粪大肠菌群阳性发酵管数，查MPN检索表，得出每克（毫升）肥料样品中的粪大肠菌群数。
附录 A（规范性附录）培养基乳糖胆盐发酵培养基蛋白胨g猪胆盐g乳糖g%溴甲酚紫水溶液m L蒸馏水1000m LpH值～制法：将蛋白胨、猪胆盐及乳糖溶解于蒸馏水中，校正pH，加入溴甲酚紫水溶液，然后分装试管，每管9mL，并放入一支倒置的小套管，高压灭菌115℃15min。
粪大肠菌群检测方法作业指导书
粪大肠菌群检测方法作业指导书(多管发酵法)1、方法原理及适用范围多管发酵技术是以最可能数（most probable number，简称MPN）来表示试验结果的。
它是根据统计学理论，通过水样不同稀释浓度多组重复生物培养阳性结果估计水体中被测生物密度的一种方法，具体是通过查MPN表获得结果的。
适用于地表水、地下水及废水中粪大肠菌群的测定。
2、培养液和试剂2.1单倍乳糖蛋白胨培养液2.2三倍乳糖蛋白胨培养液2.3EC培养液2.4氯化钠3、样品测定3.1水样接种量将水样充分混匀后，根据水样污染的程度确定水样接种量。
每个样品至少用三个不同的水样量接种。
同一水样接种量要有五管。
相对未受污染的水样接种量为10ml、1ml、0.1ml。
受污染水样接种量根据污染程度接种1ml、0.1ml、0.01ml或0.1ml、0.01ml、0.001ml等。
使用的水样量可参考下表一。
水样种类检测方法接种量（mL）1005110.110-210-310-410-5井水多管发酵法×××河水、塘水多管发酵法×××湖水、塘水多管发酵法×××城市原污水多管发酵法×××如接种体积为10ml，则试管内应装有三倍乳糖蛋白胨培养液5ml；如接种量为1ml或少于1ml，则可接种于普通浓度的乳糖蛋白胨培养液10ml 中。
3.2初发酵试验将水样分别接种到盛有乳糖蛋白胨培养液的发酵管中。
在37℃±0.5℃下培养24±2h。
产酸和产气的发酵管表明试验阳性。
如有倒管内产气不明显，可轻拍试管，有小气泡升起的为阳性。
3.3复发酵试验轻微震荡初发酵试验阳性结果的发酵管，用3mm 接种环或灭菌棒将培养物转接到EC 培养液中。
在44.5℃±0.5℃温度下培养24h±2h。
接种后所有发酵管必须在30min 内放进水浴中。
水质 粪大肠菌群的测定 滤膜法HJ 347.1-2018
中华人民共和国国家环境保护标准HJ 347.1-2018部分代替HJ/T 347-2007水质粪大肠菌群的测定滤膜法Water quality—Determination of fecal coliform—Membrane filtration（发布稿）本电子版为发布稿。
请以中国环境出版集团出版的正式标准文本为准。
2018-12-26 发布2019-06-01 实施生态环境部发布目次前言 (ii)1适用范围 (1)2规范性引用文件 (1)3术语和定义 (1)4方法原理 (1)5干扰和消除 (1)6试剂和材料 (2)7仪器和设备 (2)8样品 (3)9分析步骤 (3)10结果计算与表示 (5)11精密度和准确度 (6)12质量保证和质量控制 (6)13废物处理 (7)14注意事项 (7)附录A（资料性附录）粪大肠菌群检验记录及报告格式 (8)i前言为贯彻《中华人民共和国环境保护法》和《中华人民共和国水污染防治法》，保护生态环境，保障人体健康，规范水中粪大肠菌群的测定方法，制定本标准。
本标准规定了测定地表水、地下水、生活污水和工业废水中粪大肠菌群的滤膜法。
本标准是对《水质粪大肠菌群的测定多管发酵法和滤膜法（试行）》（HJ/T 347-2007）滤膜法部分的修订。
本标准首次发布于2007年，原起草单位为中国环境监测总站。
本次为第一次修订。
本次修订的主要内容如下：——完善了方法原理的表述；——增加了检出限；——增加了规范性引用文件、术语和定义、干扰和消除、仪器和设备、样品采集、样品保存、精密度和准确度、质量保证和质量控制、废物处理等章节；自本标准实施之日起，《水质粪大肠菌群的测定多管发酵法和滤膜法（试行）》（HJ/T347-2007）废止。
本标准的附录A为资料性附录。
本标准由生态环境部生态环境监测司、法规与标准司组织制订。
本标准起草单位：辽宁省环境监测实验中心。
本标准验证单位：大连市环境监测中心、丹东市环境监测中心站、锦州市环境监测中心站、辽阳市环境监测站、铁岭市环境保护监测站和沈阳市疾病预防控制中心。
大肠菌群测定步骤
食品大肠菌群、粪大肠菌群和大肠杆菌检测步骤一、培养基制备1、生理盐水氯化钠 8.5g蒸馏水 1000.0ml将氯化钠溶于蒸馏水中，搅拌均匀后用量筒量取225ml分装到各个广口瓶中，1210C高压灭菌15min，备用。
2、月桂基硫酸盐胰蛋白胨肉汤称取37克放入烧杯，将各成分溶解于1000ml蒸馏水中，放电炉子上加热并搅拌均匀，分装于装有倒立发酵管的试管中，每管10ml，装完盖帽，1210C高压灭菌15min，双料培养基除蒸馏水不变外，其余成分加倍。
3、样品制备（在无菌室中进行）（1）固体或半固体样品无菌操作称取样品25g置于装有225ml生理盐水的广口瓶中，充分振摇、混匀，制成1：10的样品稀释液备用。
（2）液体样品以无菌吸管吸取样品25g置于装有225ml生理盐水的广口瓶中，充分混匀，制成1：10的样品稀释液备用。
4、样品稀释用1ml无菌吸管或微量移液器吸取1：10样品匀液1ml,沿管壁缓慢注于盛有9ml 生理盐水的无菌试管中（注意吸管或吸头尖端不要触及稀释液面），振摇试管混匀，制成1：100的样品匀液。
按照该操作程序，可制备1：1000，1：10000。
等10倍系列稀释样品匀液，每递增稀释一次，换用1次1ml无菌吸管或吸头。
根据对样品污染状况的估计，选择2-3个适宜稀释度的样品匀液（液体样品可包括原液），在进行10倍递增稀释时，吸取1ml样品匀液于无菌平皿内，每个稀释度做两个平皿。
同时分别吸取1ml空白稀释液加入两个无菌平皿内作空白对照。
二、大肠菌群的测定（MPN法）1、选取适宜的三个连续稀释度的样品匀液，每个稀释度均接种三管月桂基硫酸盐胰蛋白胨（LST）肉汤，每管接种1ml。
360C+10C培养24h-48h后，观察倒管内是否有气泡产生，并记录24h和48h内产气的LST肉汤管数。
对未产气的试管，可以轻敲试管壁的方式观察是否有较细小的气泡从管底逸出，如果所有LST肉汤管均未产气，可按。
报告结果；如果LST管有产气，则按下面步骤作证实试验。
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粪大肠菌群的测定
1、半个月前配好初、复发酵所需培养液
2、采样时用500ml 广口玻璃瓶分开采样，牛皮纸封口
3、操作
（1） 培养液
初发酵 单倍乳糖蛋白胨培养液：
蛋白胨 10 g
牛肉浸膏 3 g
乳糖 5 g
氯化钠 5 g
蒸馏水 1000ml
调节PH 为7.2—7.4（NaOH ）
6%溴甲基紫乙醇溶液 1 ml 充分混匀后 10ml （三倍是5ml ）分装于试管中，盖紧塞于蒸气锅中灭菌20min （0.1—0.5kpa ），冷却后于药品储存箱保存。
单月13个地表水（每个水样需10个单倍，5个三倍），2个创业（每个水样需15个单倍）。
共190个（1900ml ）单倍，65个三倍（325ml ）。
双月10个地表水，2个创业。
共130个（1600ml ）单倍，50个三倍（250ml ）。
创业的水一个月采两次水样
复发酵 EC 培养液
胰胨 20 g
乳糖 5 g
胆盐三号 1.5 g
磷酸氢二钾 4 g
磷酸二氢钾 1.5 g
氯化钠 5 g
蒸馏水 1000ml
充分混匀后 10ml 分装于试管中，盖紧塞于蒸气锅中灭菌20min （0.1—0.5kpa ），冷却后于药品储存箱保存。
三倍乳糖蛋白胨培养液： 蛋白胨 30 g 牛肉浸膏 9 g 乳糖 15 g 氯化钠 15 g 蒸馏水 1000ml 溴甲基紫乙醇溶液 3 ml
（2）做样
初发酵：
地表水15根管为一个水样。
5根为一组。
第一排为5ml三倍培养液，加10ml水样；第二排为10ml单倍培养液，加1ml水样；第三排为10ml单倍培养液，取1ml水样稀释至10ml后再从中取1ml至装有培养液的试管。
（10、1、0.1的取样量）
创业，每个水样15根单倍。
同上逐级稀释，取样量为0.1、0.01、
0.001ml。
将初发酵管放入培养箱中培养，温度为37℃±0.5℃，时间为24h±2h。
观察：产酸产气为阳性，即变色且有气泡产生，可轻击试管查气泡。
复发酵：
呈阳性的试管进行接种后，做复发酵。
将阳性的试管中溶液接种（接种环）到EC培养液中，放在45℃±0.5℃的水浴锅中培养24h±2h。
水浴锅液面应高于管中液面。
观察：产气（有气泡）则证实为阳性。
记录阳性试管数，查表可得MPN值。
结果表示单位为：个/L。