克隆载体与表达载体
克隆载体与表达载体
克隆载体：大多是高拷贝的载体，一般是原核细菌，将需要克隆的基因与克隆载体的质粒相连接，再导入原核细菌内，质粒会在原核细菌内大量复制，形成大量的基因克隆，被克隆的基因不一定会表达，但一定被大量复制。
克隆载体只是为了保存基因片段，这样细胞内不会有很多表达的蛋白质而影响别的工作。
克隆载体（Cloning vector ）：携带插入外源片段的质粒或噬菌体，从而产生更多物质或蛋白质产物。
（这是为携带”感兴趣的外源DNA实现外源DNA勺无性繁殖或表达有意义的蛋白质所采用的一些DNA分子。
）其中，为使插入的外源 DNA序列可转录、进而翻译成多肽链而设计的克隆载体又称表达载体。
是否含有表达系统元件，即启动子 -- 核糖体结合位点 -- 克隆位点 -- 转录终止信号，这是用来区别克隆载体和表达载体的标志。
表达载体：有的是高拷贝的，有的是低拷贝的，各有各的用处，是一些用于工程生产的细菌，被导入的目标基因会在此类细菌中得到表达，生产出我们需要的产物，导入的基因是由克隆载体产出的。
表达载体具有较高的蛋白质表达效率，一般因为具有强的启动子。
表达载体（ Expression vectors ）就是在克隆载体基本骨架的基础上增加表达元件（如启动子、RBS、终止子等），是目的基因能够表达的载体。
如表达载体 pKK223-3 是一个具有典型表达结构的大肠杆菌表达载体。
其基本骨架为来自pBR322和pUC的质粒复制起点和氨苄青霉素抗性基因。
在表达元件中，有一个杂合tac强启动子和终止子，在启动子下游有RBS位点（如果利用这个位点，要求与ATG之间间隔5-13bp），其后的多克隆位点可装载要表达的目标基因。
（RBS位点：1974年Shine和Dalgarno首先发现，原核生物，在 mRNAk有核糖体的结合位点，它们是起始密码子AUG和一段位于AUG上游3〜10 bp处的由3 —9bp组成的序列。
这段序列富含嘌吟核苷酸，刚好与16S rRNA 3，末端的富含嘧啶的序列互补，是核糖体 RNA的识另U与结合位点。
(整理)克隆载体与表达载体
一部分：概念解析二部分：问题解答克隆载体：大多是高拷贝的载体，一般是原核细菌，将需要克隆的基因与克隆载体的质粒相连接，再导入原核细菌内，质粒会在原核细菌内大量复制，形成大量的基因克隆，被克隆的基因不一定会表达，但一定被大量复制。
克隆载体只是为了保存基因片段，这样细胞内不会有很多表达的蛋白质而影响别的工作。
克隆载体(Cloning vector )：携带插入外源片段的质粒或噬菌体，从而产生更多物质或蛋白质产物。
(这是为“携带”感兴趣的外源DNA、实现外源DNA的无性繁殖或表达有意义的蛋白质所采用的一些DNA分子。
) 其中，为使插入的外源DNA序列可转录、进而翻译成多肽链而设计的克隆载体又称表达载体。
是否含有表达系统元件，即启动子--核糖体结合位点--克隆位点--转录终止信号，这是用来区别克隆载体和表达载体的标志。
表达载体：有的是高拷贝的，有的是低拷贝的，各有各的用处，是一些用于工程生产的细菌，被导入的目标基因会在此类细菌中得到表达，生产出我们需要的产物，导入的基因是由克隆载体产出的。
表达载体具有较高的蛋白质表达效率，一般因为具有强的启动子。
表达载体（Expression vectors）就是在克隆载体基本骨架的基础上增加表达元件（如启动子、RBS、终止子等），是目的基因能够表达的载体。
如表达载体pKK223-3是一个具有典型表达结构的大肠杆菌表达载体。
其基本骨架为来自pBR322和pUC的质粒复制起点和氨苄青霉素抗性基因。
在表达元件中，有一个杂合tac强启动子和终止子，在启动子下游有RBS位点（如果利用这个位点，要求与ATG之间间隔5-13bp），其后的多克隆位点可装载要表达的目标基因。
（RBS位点：1974年Shine和Dalgarno首先发现，原核生物，在mRNA上有核糖体的结合位点，它们是起始密码子AUG和一段位于AUG上游3～10 bp处的由3—9bp组成的序列。
这段序列富含嘌呤核苷酸，刚好与16S rRNA 3，末端的富含嘧啶的序列互补，是核糖体RNA的识别与结合位点。
克隆载体与表达载体
克隆载体与表达载体
1. T载体是克隆载体，你的基因通过TA克隆法插入载体，这一步的目的是扩增基因，得到大量你要的目的基因片段，以便进行下一步表达载体的构建；DH5α是克隆菌株，不能用来做表达；
2. 欲在大肠杆菌中表达外源基因，需要首先构建原核表达载体，如可将构建至T 载体的目的通过双酶切切下来然后连接到表达载体上，如PET系列的载体等，构建成原核表达载体后，可将此载体转化表达菌株，如BL21(DE3,)等，如果你的目的基因含有稀有密码子，也可以转化Rosetta系列的表达菌株。
最后将构建成功的基因工程菌进行诱导表达。
1、T载体常用于克隆，一般来讲都会再把目的基因亚克隆到表达载体上。
但是并非T载体不能用来表达。
常见的pMD18-T，含有lacZ操纵子，可以IPTG诱导表达。
pGEM-T则含有T7和SP6启动子。
2、为了能够顺利地使用T7系统来表达蛋白，在如BL21（DE3）一类的大肠杆菌菌株中，编码T7RNA聚合酶的基因被整合到其染色体上，并位于lacUV5启动子的下游，受乳糖操纵子调控。
而目标蛋白的编码序列则被构建到含T7启动子序列的质粒上，并受T7RNA聚合酶调控转录。
3、构建质粒、基因表达看似比较成熟，也比较简单。
其实这里面大有学问。
学会看菌株和质粒的相关文档，答案就在其中。
克隆载体与表达载体
克隆载体：大多是高拷贝的载体，一般是原核细菌，将需要克隆的基因与克隆载体的质粒相连接，再导入原核细菌内，质粒会在原核细菌内大量复制，形成大量的基因克隆，被克隆的基因不一定会表达，但一定被大量复制。
克隆载体只是为了保存基因片段，这样细胞内不会有很多表达的蛋白质而影响别的工作。
克隆载体(Cloning vector )：携带插入外源片段的质粒或噬菌体，从而产生更多物质或蛋白质产物。
(这是为“携带”感兴趣的外源DNA、实现外源DNA的无性繁殖或表达有意义的蛋白质所采用的一些DNA 分子。
)其中，为使插入的外源DNA序列可转录、进而翻译成多肽链而设计的克隆载体又称表达载体。
是否含有表达系统元件，即启动子--核糖体结合位点--克隆位点--转录终止信号，这是用来区别克隆载体和表达载体的标志。
表达载体：有的是高拷贝的，有的是低拷贝的，各有各的用处，是一些用于工程生产的细菌，被导入的目标基因会在此类细菌中得到表达，生产出我们需要的产物，导入的基因是由克隆载体产出的。
表达载体具有较高的蛋白质表达效率，一般因为具有强的启动子。
表达载体（Expression vectors）就是在克隆载体基本骨架的基础上增加表达元件（如启动子、RBS、终止子等），是目的基因能够表达的载体。
如表达载体pKK223-3是一个具有典型表达结构的大肠杆菌表达载体。
其基本骨架为来自pBR322和pUC的质粒复制起点和氨苄青霉素抗性基因。
在表达元件中，有一个杂合tac强启动子和终止子，在启动子下游有RBS位点（如果利用这个位点，要求与ATG之间间隔5-13bp），其后的多克隆位点可装载要表达的目标基因。
（RBS位点：1974年Shine和Dalgarno首先发现，原核生物，在mRNA上有核糖体的结合位点，它们是起始密码子AUG和一段位于AUG上游3～10 bp处的由3—9bp组成的序列。
这段序列富含嘌呤核苷酸，刚好与16S rRNA 3，末端的富含嘧啶的序列互补，是核糖体RNA的识别与结合位点。
克隆载体表达载体构建详细版
克隆载体表达载体构建详细版一、稀释引物1、4℃，15min、13000转离心（先等离心机降温）2、根据OD值加DD水。
3、静置30min（冰上）4、准备1.5毫升EP管，并加90ulDD水。
5、向EP管中加10ul引物，震荡离心，-20℃保存。
二、跑MIX检测引物（20ul体系）、上引物0.8ul下引物0.8ulMix 10ulDNA（日本晴）1ulDD水7.4ul三跑高保真酶（50ul体系）DNAorCDNA 2ul上引物2ul下引物2ul5*buffer 10uldNTPs 5ulDD水28ulPfu（最后加）1ul四胶回收流程1、在紫外线下切胶，用牙签装入2ml的EP管中。
2、按量加XP2，放在55℃水浴锅中10min，每2min摇匀1次，涡旋，短离。
3、将液体冷却到室温，转移到平衡住中，离心10000转，1min30s，倒掉滤液。
4、加入xp2 300ul，离心10000r，1min30s，倒掉滤液。
5、加入spw700ul，离心10000r，1min，倒掉滤液（重复一次）6、空转2min，13000r，之后换1.5mlEP管。
7、套上保鲜膜放入37℃烘箱中，30min。
8、加入DD水10ul，静置2min，离心2min，13000r，重复3次，-20℃保存。
五、胶回收产物检测（10ul）体系上引物0.4ul下引物0.4ulMix 5ul回收产物1ulDD水 3.2ul六、构建blunt cloning 载体（克隆载体）（4ul 体系）胶回收产物 3.5ulBlunt cloning 0.5ul混匀后，PCR：25℃15min 盖子温度50℃之后转化1、提前5min从-70℃冰箱中拿出大肠杆菌感受态，冰上解冻5min。
2、将样品（4ul）加入感受态的大肠杆菌中，冰上30min，大约剩5min左右，打开水浴锅预热到42℃，并拿出SDC 培养基解冻（室温解冻）。
3、水浴锅42℃，60-90s迅速转移到冰浴2min，该过程中不要摇动离心管。
酵母基因克隆与表达载体
Gal4蛋白有一个非常突出的特性，它的二个结构域在其适当的连接区被打断后仍具有各自的功能，而且这两个不同的结构域可以重建继续发挥转录激活作用。这一特性使得研究者可以构建两个载体来研究蛋白质与蛋白质之间的相互作用。具体方法是：将A基因与DB融合构建一个表达质粒（通常带Trp标志基因，以下简称Trp质粒）在酵母中表达Gal4-BD-A，将B基因与AD融合构建另一个表达质粒（通常带Leu标志基因）表达Gal4-AD-B，然后将者两个质粒转化酵母，在泛基诺SD/-Trp-Leu双缺培养基上筛选转化克隆（备注：两个质粒共转化的效率一般很低，也可先后逐个转化，即先转化Trp质粒，在泛基诺SD/-Trp的培养平皿中筛选阳性克隆后再转化Leu质粒。如果A蛋白和B蛋白之间存在相互作用，那么Gal4-BD和Gal4-AD通过A和B的桥接作用被聚集在一起而重建转录因子的活性，启动下游报告基因的转录。早期的报告基因选用LacZ，后来为减少非特异性激活而产生的假阳性，增加了双报告基因和三报告基因(LacZ,His3,Ade2)。
此类质粒在细胞内以附加体的形式高度复制, 每个细胞高达200-400个拷贝贝
用途: 用于外源基因的表达
(二). 表达载体
1、GAL1启动子表达载体-----半乳糖诱导的表达载体
(1).Trp筛选标志 (2).Ura筛选标志 (3).Leu筛选标志 (4).His筛选标志 (5).G418筛选标志
此类质粒在细胞内可自主复制,且由于含有中心粒复制序列,因此每个细胞近乎只有一个拷贝。
用途: 由于每个细胞平均只有一个拷贝,避免了目的基因的盈余表达,因而特别适用于基因功能的研究
3、酵母附加体质粒(Yeast episomal plasmid, YEP)
(1).Trp筛选标志 (2).Ura筛选标志 (3).Leu筛选标志 (4).His筛选标志 (5).G418筛选标志
克隆载体与表达载体教程文件
克隆载体：大多是高拷贝的载体，一般是原核细菌，将需要克隆的基因与克隆载体的质粒相连接，再导入原核细菌内，质粒会在原核细菌内大量复制，形成大量的基因克隆，被克隆的基因不一定会表达，但一定被大量复制。
克隆载体只是为了保存基因片段，这样细胞内不会有很多表达的蛋白质而影响别的工作。
克隆载体(Cloning vector )：携带插入外源片段的质粒或噬菌体，从而产生更多物质或蛋白质产物。
(这是为“携带”感兴趣的外源DNA、实现外源DNA的无性繁殖或表达有意义的蛋白质所采用的一些DNA 分子。
)其中，为使插入的外源DNA序列可转录、进而翻译成多肽链而设计的克隆载体又称表达载体。
是否含有表达系统元件，即启动子--核糖体结合位点--克隆位点--转录终止信号，这是用来区别克隆载体和表达载体的标志。
表达载体：有的是高拷贝的，有的是低拷贝的，各有各的用处，是一些用于工程生产的细菌，被导入的目标基因会在此类细菌中得到表达，生产出我们需要的产物，导入的基因是由克隆载体产出的。
表达载体具有较高的蛋白质表达效率，一般因为具有强的启动子。
表达载体（Expression vectors）就是在克隆载体基本骨架的基础上增加表达元件（如启动子、RBS、终止子等），是目的基因能够表达的载体。
如表达载体pKK223-3是一个具有典型表达结构的大肠杆菌表达载体。
其基本骨架为来自pBR322和pUC的质粒复制起点和氨苄青霉素抗性基因。
在表达元件中，有一个杂合tac强启动子和终止子，在启动子下游有RBS位点（如果利用这个位点，要求与ATG之间间隔5-13bp），其后的多克隆位点可装载要表达的目标基因。
（RBS位点：1974年Shine和Dalgarno首先发现，原核生物，在mRNA上有核糖体的结合位点，它们是起始密码子AUG和一段位于AUG上游3～10 bp处的由3—9bp组成的序列。
这段序列富含嘌呤核苷酸，刚好与16S rRNA 3，末端的富含嘧啶的序列互补，是核糖体RNA的识别与结合位点。
简述基因克隆载体的主要类型
简述基因克隆载体的主要类型
基因克隆载体是指一类可以携带外源DNA片段并能够被复制的DNA分子。
常用于基因工程中，将特定基因序列克隆到载体DNA上，进而进行转化和表达。
根据不同的功能和应用，基因克隆载体可以分为多种类型，以下是主要的几种：
1. 质粒（Plasmid）：质粒是最常用的基因克隆载体之一，通常起源于细菌，具有自主复制的能力，易于操作和扩增。
质粒通常被用于基因表达、基因敲除和基因突变等领域。
2. 病毒载体（Viral Vector）：病毒载体是一类通过改造病毒而成的基因克隆载体，具有高度的转染效率和生物安全性。
病毒载体通常被用于基因治疗、免疫治疗和癌症治疗等领域。
3. 人工染色体（Artificial Chromosome）：人工染色体是一种可以模拟天然染色体结构和功能的基因克隆载体，通常具有高度的稳定性和扩增性能。
人工染色体通常被用于基因组学研究和治疗复杂遗传病等领域。
4. 原核表达载体（Prokaryotic Expression Vector）：原核表达载体是一类专门用于大肠杆菌等原核生物中进行基因表达的基因克隆载体。
原核表达载体通常具有高度的表达效率和易于操作的特点，被广泛应用于蛋白质制备和生物技术研究等领域。
基因工程中克隆载体和表达载体
D.位于基因的尾端，是转录停止的信号
解析：
复制原点是在基因组上复制起始的一段序列。双链DNA碱基对A+T之间由两个氢键相连，C+G之间由三个氢键相连，因此在相同条件下，A+T更容易被作用于氢键从而打开双链，所以A+T的比例高时，容易打开双链，故A项正确，B项错误；启动子位于基因的首段，是RNA聚合酶识别和结合的部位，C项错误；终止子位于基因的尾端，是转录停止的信号，D错误。综上所述，本题正确答案为A。
标记基因：一般是运载体上的一段特殊DNA序列，能表达特定形状便于检测运载体是否导入受体（如抗氨苄青霉素基因，绿色荧光基因）。
启动子：转录起始位点，即RNA聚合酶结合位点。注意和起始密码子不同，起始密码子是mRNA上翻译起始的位置，通常为AUG，对应甲硫氨酸,少数细菌（属于原核生物）以GUG(缬氨酸)或UUG为起始密码，线粒体和叶绿体以AUG、AUU、AUA为起始密码子。
基因工程中克隆载体和表达载体
基因工程的载体有两种常见的类型，基因克隆载体和基因表达载体。两者都有标记基因和复制原点两部分DNA序列。表达载体在载体基础上增加了目的基因、启动子和终止子三部分结构。
试题解析
试题：已知基因表达载体中的复制原点处比较容易打开双链，可以推断该处（
作为基因克隆载体至少必须具备3个条件：
1）具有能使外源DNA片段插入的克隆位点；
2）能携带外源DNA进入受体细胞，或游离在细胞质中进行自我复制，或整合到染色体DNA上随染色体DNA的复制而复制；
3）必须具有选择标记，承载外源DNA的载体进入受体细胞后，以便筛选克隆子。
（2）表达载体
能在受体细胞中表达（转录和翻译）的外源基因的载体。这类载体除了克隆载体所具备的性质以外，还带有表达构件－转录和翻译所需要的DNA序列。
克隆载体与表达载体
克隆载体
基因间隔区（intergenic region, IG 区）基因II与基因IV之间存在一段507bp的基因间隔区，内含有复制起始位点，是实施改造、构建人工载体的重点区域。
② IG区内只有一个Bsu I 切点。
（2）加入酶切位点，在IG区内加入单一内切酶位点。
M13mp1 在IG区内插入一个大肠杆菌的LacZ’（-肽序列)。
使克隆的DNA片段以特定单链的形式输出受体细胞外，M13重组分子筛选简便，被M13噬菌体感染的受体细胞生长缓慢，形成混浊斑，易于辨认挑选。
而且重组分子越大，混浊斑的混浊度亦越大但M13-DNA载体的最大缺陷是装载量小，只有 kb
考斯质粒是一类人工构建的含有λ-DNA cos序列和质粒复制子的的特殊类型载体。
能像
-DNA那样进行体外包装，并高效转染受体细胞；能像质粒那样在受体细胞中自主复制具有较高容量的克隆能力：45kb；具有与同源性序列的质粒进行重组的能力粘粒（cosmid）是带有 cos 序列的质粒。
cos序列是噬菌体 DNA 中将DNA 包装到噬菌体颗粒中所需的 DNA 序列。
黏粒的组成包括质粒复制起点（colE1），抗性标记（amp r），cos 位点，因而能象质粒一样转化和增殖。
克隆的最大 DNA 片段可达 45kb 。
有的粘粒载体含有两个cos 位点，在某种程度上可提高使用效率。
质粒载体总结
λ噬菌体载体
表达载体。
克隆载体与表达载体介绍
（二）质粒载体的构建
天然质粒载体不易直接作为克隆载体，需要改造：
（1）选择合适的复制起始位点，松散型质粒复制起始位点； （2）加入合适的选择标记基因，主要有LacZ基因和抗生素抗性基因； （3）增加或减少酶切位点，组装多个单一的限制酶切位点即多克隆位点
（MCS); （4）缩短长度，通常重组DNA分子越小，转化效率越高。
（三）常用的质粒载体
1. pBR322质粒载体
2. pUC18和pUC19质粒载体
3. TA载体
二、噬菌体载体
（一） λ 噬菌体载体 1 λ 噬菌体的性质
λ噬菌体Βιβλιοθήκη 外壳蛋白 线性，全长48502bp
λDNA 5’端含12bp的黏性末端
2 λ 噬菌体的构建 构建λ 噬菌体的依据：
a.λ 噬菌体能够包装原λDNA长度的75%－105%的DNA片段 （36.4~51kb） b.有20kb的区域对λ噬菌体生长非必需。
该λ 噬菌体载体的最大装载容量为: 4.9+5.5+2.6+(51-48.5)=15.5kb
2.6kb
3 代表性λ 噬菌体
(1) 插入型载体
装载容量为：0-10.18kb
(2) 置换型噬菌体载体载体 克隆外源DNA片段范围为：9-23kb
（二） M13 噬菌体载体
1.M13噬菌体的增值
M13噬菌体是单链丝状噬菌体； 长6407bp， 507bp基因间隔区，含复制起始位点，同时可用于改造； M13 DNA在宿主细胞中以双链或单链形式存在，但释放到细胞外的 M13 噬菌体颗粒以单链形式存在。
2.M13噬菌体载体 1) 插入选择标记基因； 2) 组装合适的多克隆位点。
三、噬菌体-质粒杂合载体
基因工程的载体种类
基因⼯程的载体种类基因⼯程的载体对于外源基因的复制、扩增、传代乃⾄表达⾄关重要，其必需具备以下条件：①具有有效运载能⼒，能够进⼊宿主细胞；②对多种限制酶有单⼀或较少的切点，最好是单⼀切点，即本⾝是⼀个复制⼦，携带外源基因前后均能在宿主细胞内⾃主复制，或者能够整合到宿主细胞中；③在宿主中能控制外源基因的表达活动；④要有筛选标记，鉴定⽅便，装卸⼿续简单；⑤容易控制，安全可靠。
在基因⼯程（DNA重组）中，使⽤的载体有：①克隆载体（clone vector），即以繁殖DNA分⼦为⽬的的载体；②穿梭载体（shuttle vecto），⽤于真核⽣物DNA⽚段在原核⽣物中增殖，然后在转⼊真核⽣物细胞宿主表达；③表达载体（express vector），⽤于⽬的基因的表达。
现在对载体提出了更⾼的要求，如：⾼拷贝数、具有强启动⼦和稳定的mRNA、具有⾼的分离稳定性和结构稳定性、转化频率⾼、宿主范围⼴、插⼊外源基因容量⼤且可以重新完整地复制与转录、和宿主细胞匹配等。
此外，载体在宿主不⽣长或低⽣长速率时仍能⾼⽔平地表达⽬的基因。
但达到上述要求的载体很少，尤其是当动物细胞作为宿主细胞时，⽬前能⽤的主要时病毒，进⼊宿主的⽬的基因⼀般只能是⼀个基因，⽽以基因组或多个基因同时进⾏重组还有⼀定困难。
⼀、质粒克隆载体除酵母杀伤质粒（killer plasmid）为RNA外，其他质粒多位环状DNA分⼦，每个质粒都有⼀段DNA复制起始点的序列，帮助实现质粒的复制。
质粒⼀般决定抗⽣素的抗性、产⽣抗⽣素酶系、糖酵解酶系、降解芳⾹族化合物酶系、肠毒素及限制-修饰酶系等。
其中严紧型复制控制质粒的复制与宿主染⾊体同步，并与宿主蛋⽩质合成有关，与DNA聚合酶I活性⽆关，蛋⽩质合成停⽌，质粒与宿主染⾊体复制亦停⽌，故只有1个或少数⼏个拷贝；⽽松弛型复制控制质粒的复制与宿主染⾊体复制不同步，与蛋⽩质合成⽆关，与DNA聚合酶I活性有关，蛋⽩质合成停⽌，质粒仍可复制，故可以在宿主有10—206个拷贝。
大二基因工程复习资料
基因载体和工具酶：基因载体可分为克隆载体和表达载体两种，其中克降载体必需具备如下条件：①具有复制原点，在宿主细胞内必需能够自主复制；②有一条或多条用于筛选的选择标记，易于识别和筛选；③具备合适的限制性核酸内切醐的单一识别位点，便于外源DNA片段的插入，同时不影响其复制；④有较高的拷贝数，便于目的基因的大量制备；⑤具有较大的外援DNA片段装载容量，又不影响本身的复制。
表达载体必需具备如下条件：①具备与克隆载体相同的复制起点、多克隆位点和筛选标记基因；②具备掌握目的基因表达的调控序列，包括启动子、转录终止子；③具备完整的起始密码子、终止密码子和核糖体结合位点。
工具酶包括限制性内切酶、DNA连接酶、DNA聚合酶类、碱性磷酸酶、末端脱氧核甘酸转移防以及其他工具的。
基因工程诞生的理论基础：三大理论基础：①发觉了生物的遗传物质是DNA而不是蛋白质；②明确了DNA的双螺旋结构和半保留复制基质；③遗传密码子的破译。
三大技术基础：①采用限制性内切酶和DNA连接酶外切割和连接DNA片段；②质粒改造成载体以携带DNA片段克隆；③逆转转录酶的食用打开真核生物基因工程的一条通道。
胚胎原位杂交技术、Northern杂交、blot的异同点：相同点：①都是用带有标记的核酸探针，与待测核酸（RNA）片段进行杂交；②都要对进行了杂交处理的材料进行漂洗；③都要对杂交信号进行检测。
不同点：①用于标记的核酸探针种类不同：胚胎原位杂交所用探针分为DNA探针、RNA探针、cDNA 探针和寡核甘酸探针等，DNA探针还有双链和单链之分。
依据标记方法的不同也可分为放射性探针和非放射性探针：对于Northern/blot而言，其探针为同位素或生物素标记的DNA或RNA探针对固定于膜上的mRNA进行杂交。
②胚胎原位杂交需要两条恒氨酸单链片段，在相宜条件下，能形成DNA-DNA. DNA-RNA或RNA-RNA双链分子；而Northern、blot则是针对RNA样品。
克隆载体与表达载体
噬菌 粒载 体
M13-DNA 那样体外包 装，并高效转染受体细 胞 装载量比常规的 M13mp 系列要大很多
点、抗生素抗性选择标记和丝状体噬菌 体 DNA 间隔区(含有噬菌体 DNA 复制 起始、终止以及噬菌体颗粒形态发生所 必需的全部顺式作用元件)
个 ampr 基因作为选择记号，便于转化子的选择； 3. 拷贝数含量高 4. 存在着一个多克隆位点区，因 此多种不同类型的外源 DNA 片段，不经修饰便可 直接插入到载体分子上；5.多克隆位点区阻断了大
噬 黏粒 装，并高效转染受体细 位点，因而能象质粒一样转化和增殖。 DNA 可大于 40kb。重组的柯斯质粒可象噬菌体λ
菌 载体 胞；能像质粒那样在受 克隆的最大 DNA 片段可达 45kb 。 一样感染大肠杆菌，并在细菌细胞中复制。
体-
体细胞中自主复制具有 有的粘粒载体含有两个 cos 位点，在
质
M13 噬菌 体的 基 因组 为单链 DNA。噬菌体颗 粒的大小受其 DNA 端 点制约的，不存在包装 限制。只感染雄性大肠 杆菌
(1)基因组大小；去除非必需区，建立外 源 DNA 片段的克隆或替换位点（2）在 DNA 的非必需区插入选择标记：lacZ 基因；基因 cⅠ 失活（cI 基因：溶源 过程控制基因）；Spi 筛选（野生型 λ 噬 菌 体 在 带 有 P2 原 噬 菌 体 的 溶 源 性 E.coli 中 的生长会受到限制的表型， 称作 Spi+ ，即对 P2 噬菌体的干扰敏 感） 基因间隔区（intergenic region, IG 区） 基因 II 与基因 IV 之间存在一段 507bp 的基因间隔区，内含有复制起始 位点，是实施改造、构建人工载体的重 点区域。② IG 区内只有一个 Bsu I 切 点。（2）加入酶切位点，在 IG 区内加 入单一内切酶位点。M13mp1 在 IG 区
克隆载体表达载体(课件)PPT课件
组成型表达载体是将基因整合到宿主细胞的染色体上，使基因在任何生长条件下都能稳定表达。这种 表达载体适用于需要持续稳定表达的基因。
组织特异性表达载体
总结词
在特定的组织或器官中，表达载体才能 启动基因的表达。
VS
详细描述
组织特异性表达载体是将基因与特定的组 织或器官相关的调控序列结合，使基因只 在特定的组织或器官中表达。这种表达载 体适用于需要组织特异性表达的基因。
05
克隆载体和表达载体的未来发展
克隆载体和表达载体的新技术和新方法
基因编辑技术
利用CRISPR-Cas9等基因编辑技术，实现对克隆载体和表达载体的精确修饰，提高基 因治疗的效率和安全性。
人工染色体技术
开发人工染色体技术，实现对大型基因组的克隆和表达，为遗传病研究和治疗提供新的 工具。
克隆载体和表达载体的新应用和新领域
04
克隆载体和表达载体的应用
克隆载体在基因工程中的应用
基因克隆
克隆载体可以将目的基因插入到质粒 或病毒载体中，实现基因的复制和扩 增，为基因工程提供大量目的基因。
基因保存
基因突变
通过将目的基因插入到克隆载体中， 进行定点突变或随机突变，研究基因 功能和蛋白质活性。
克隆载体可以保存和传递目的基因， 为基因工程提供长期稳定的基因来源。
01
02
03
基因治疗
利用克隆载体和表达载体， 开发新型基因治疗策略， 针对遗传性疾病、肿瘤等 进行有效治疗。
生物制药
通过克隆载体和表达载体， 实现高效、大规模的蛋白 质药物生产，推动生物制 药产业的发展。
农业育种
利用克隆载体和表达载体， 培育抗逆、抗病、高产的 农作物新品种，提高农业 生产效益。
为什么要先构建克隆载体再用表达载体 甄选
为什么要先构建克隆载体再用表达载体（优选.)为什么要先构建克隆载体再用表达载体构建克隆载体是大量扩增DNA片段，用以测序、酶切和改造等对DNA实施的后续操作，构建表达载体是大量得到翻译产物——蛋白质。
为什么要先构建克隆载体，再用表达载体，我猜是因为：①得到大量的DNA，虽然PCR也可以，但PCR扩增有出错率、但你每做一次常规的PCR，而且每次都要重新提DNA和RNA才行，而且，PCR反应的试剂盒又不便宜，用PCR来制备大量DNA有点得不偿失。
尽管构建克隆载体也存在操作复杂（相对于PCR），成功率不是极高，而且还要筛选，但一旦你重组成功并转入了大肠杆菌，你就可以保存了，你想什么时候用，摇个菌，就可以制备到大量的DNA。
②测序需要。
你想转表达，你首先得确定你扩增的目的片段是不是你要的，不要以为你设计了个特异性引物，然后跟你mark的长度就可以确定了，这也只是推测，在科学上不严谨。
扩增出的基因片段保险起见或者经费允许，要拿去测序，而一般送测的序列都是构建到载体上的序列，克隆载体上一般也都带有测序引物，已确定这就是你要的那条序列。
你要写论文必须要给人真凭实据。
先构建克隆载体再构建表达载体并不是一个必须的选择，如果你的扩增PCR目的条带很亮，而且单一性很好，我建议你可以直接克隆进入表达载体。
很多人选择先构建克隆载体，是因为在扩增基因时目的条带模糊，特异性不好，这样将基因连接到克隆载体上就可以便于挑去单克隆进行测序，增加测序的准确度，从而确认自己克隆基因序列的正确性。
单纯的PCR产物往往是一些各种PCR片段的混合物，直接送过去测序，往往导致测序信号峰很杂，有时候并不能测出想要的信号序列。
同时保存的PCR片段比较容易降解，而构建好克隆载体后形成的质粒是很容易扩增和保存的。
先构建克隆载体，一是为了便于测序，确认克隆序列正确，二是为了便于基因PCR片段的保存。
怎么构建克隆载体和表达载体？首先根据你的实验需要选择相应的载体。
基于大肠杆菌表达系统的制备多肽的方法与流程
基于大肠杆菌表达系统的制备多肽的方法与流程在大肠杆菌表达系统中，制备多肽已成为生物技术领域的一个重要研究方向。
该系统具有操作简便、成本较低、表达量高等优点，被广泛应用于多肽类药物的研发和生产。
本文将详细介绍基于大肠杆菌表达系统的制备多肽的方法与流程。
一、选择表达载体1.克隆载体：常用的克隆载体有pET、pGEX等，可根据实验需求选择适合的载体。
2.选择适当的启动子：大肠杆菌表达系统中，T7、lac、trc等启动子均可用于驱动多肽的表达。
3.引入合适的终止子和标签：为了提高表达效率和便于纯化，可在目的基因后引入终止子和标签，如His标签、GST标签等。
二、构建表达质粒1.提取模板DNA：以含有目的多肽基因的DNA为模板，进行PCR扩增。
2.双酶切：将PCR产物和表达载体进行双酶切，获得粘性末端。
3.连接：将酶切后的目的基因与表达载体连接，构建表达质粒。
4.转化：将构建好的表达质粒转化至大肠杆菌感受态细胞。
三、诱导表达1.挑选阳性克隆：将转化后的细胞进行培养，挑选生长良好的克隆进行验证。
2.诱导表达：在适当的诱导剂（如IPTG）作用下，诱导目的多肽的表达。
3.收集菌体：诱导表达一定时间后，收集菌体进行后续实验。
四、多肽纯化1.细胞破碎：采用超声波、高压破碎等方法，将细胞破碎，释放多肽。
2.离心：将破碎后的细胞离心，分离上清和沉淀。
3.蛋白质纯化：采用亲和层析、离子交换层析、凝胶过滤等方法，对多肽进行纯化。
4.浓缩：对纯化后的多肽进行浓缩，获得较高浓度的目标产物。
五、多肽鉴定与分析1.SDS-PAGE：通过SDS-PAGE电泳，观察多肽的表达和纯化情况。
2.Western blot：利用特异性抗体，对多肽进行定性分析。
3.质谱分析：对纯化后的多肽进行质谱分析，确定其氨基酸序列。
4.生物活性检测：对多肽进行生物活性检测，验证其功能。
六、总结基于大肠杆菌表达系统制备多肽的方法与流程主要包括：表达载体的选择、构建表达质粒、诱导表达、多肽纯化、多肽鉴定与分析等步骤。
克隆载体与表达载体
克隆载体：大多是高拷贝的载体，一般是原核细菌，将需要克隆的基因与克隆载体的质粒相连接，再导入原核细菌内，质粒会在原核细菌内大量复制，形成大量的基因克隆，被克隆的基因不一定会表达，但一定被大量复制。
克隆载体只是为了保存基因片段，这样细胞内不会有很多表达的蛋白质而影响别的工作。
克隆载体(Cloning vector )：携带插入外源片段的质粒或噬菌体，从而产生更多物质或蛋白质产物。
(这是为“携带”感兴趣的外源DNA、实现外源DNA的无性繁殖或表达有意义的蛋白质所采用的一些DNA分子。
)其中，为使插入的外源DNA序列可转录、进而翻译成多肽链而设计的克隆载体又称表达载体。
是否含有表达系统元件，即启动子--核糖体结合位点--克隆位点--转录终止信号，这是用来区别克隆载体与表达载体的标志。
表达载体：有的是高拷贝的，有的是低拷贝的，各有各的用处，是一些用于工程生产的细菌，被导入的目标基因会在此类细菌中得到表达，生产出我们需要的产物，导入的基因是由克隆载体产出的。
表达载体具有较高的蛋白质表达效率，一般因为具有强的启动子。
表达载体（Expression vectors）就是在克隆载体基本骨架的基础上增加表达元件（如启动子、RBS、终止子等），是目的基因能够表达的载体。
如表达载体pKK223-3是一个具有典型表达结构的大肠杆菌表达载体。
其基本骨架为来自pBR322与pUC的质粒复制起点与氨苄青霉素抗性基因。
在表达元件中，有一个杂合tac强启动子与终止子，在启动子下游有RBS位点（如果利用这个位点，要求与ATG之间间隔5-13bp），其后的多克隆位点可装载要表达的目标基因。
（RBS位点：1974年Shine与Dalgarno首先发现，原核生物，在mRNA上有核糖体的结合位点，它们是起始密码子AUG与一段位于AUG上游3～10 bp处的由3—9bp组成的序列。
这段序列富含嘌呤核苷酸，刚好与16S rRNA 3，末端的富含嘧啶的序列互补，是核糖体RNA的识别与结合位点。
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染色体具有复制功能，利用染色体的复制元件来驱动外源DNA片段复制的载体称为人工染色体载体
其装载外源DNA的容量比质粒、噬菌体和噬菌体-质粒杂合载体等有很大的拓展，甚至可以跟染色体的大小相媲美。
人工染色体载体拷贝数少，制备困难，通常采取“穿梭载体”的策略来解决
含有质粒载体所必备的第一受体(大肠杆菌)质粒复制起始位点，这样的载体在大肠杆菌内可以按质粒复制形式进行高拷贝复制，含有第二受体(如酵母)端粒(TEL)、DNA复制起始位点(ARS)和着丝粒(CEN)以及合适的选择标记。载体在体外与目的DNA重组后转化到第二受体细胞，按照染色体复制的形式进行复制和传递。筛选第一受体的克隆子一般采用抗生素抗性选择标记；筛选第二受体的克隆子常用与受体互补的营养缺陷型。
克隆载体
基本性质
基本特征（或载体的构建）
原理机制
常用的载体
克隆载体
质粒载体
质粒能利用寄主细胞的DNA复制系统进行自主复制；不相容性；可转移性（基因工程中采用非接合性质粒）
（1）具有合适的复制起始位点（ORI）（2）具有合适的选择性标记基因（3）若干限制性内切酶的单一位点（4）具有较小的分子量和较高的拷贝数。
M13噬菌体产生单双链DNA的机制）
LacZ’ 5’端的第13个核苷酸G突变成A，产生了一个EcoR I切点
一类人工构建的含有λ-DNA cos序列和质粒复制子的的特殊类型载体。能像l-DNA那样进行体外包装，并高效转染受体细胞；能像质粒那样在受体细胞中自主复制具有较高容量的克隆能力：45kb；具有与同源性序列的质粒进行重组的能力
当带有抗菌素抗性基因的载体进入受体菌后，受体菌才能生长。不带有抗菌素抗性基因的受体菌不能在含有抗菌素的培养基（选择培养基）中生长。（抗菌素选择原理）
pSC101
ColE1
pBR322
pUC18
pUC19
TA载体
噬菌体载体
λ噬菌体
其DNA两端的5′末端各带有12个碱基的互补单链，即cos位点。有可替代区，即非必需区。用外源DNA片段替代这个区域，不会影响噬菌体颗粒的形成。
方法1：先采用限制性内切核酸酶酶切使质粒载体线性化，再通过K1enow片段将酶切的线性载体末端补平
方法2：利用产生平末端的限制性内切核酸酶酶切产生平末端，最后将线性化钝末端质粒载体加T反应形成。目前有很多公司推出了TA质粒载体。
λ噬菌体载体
λ噬菌体
载体
分类
插入式载体
一种只具有一个可供外源DNA插入的克隆位点的派生载体
螺旋状态存在，从大肠杆菌中提取质粒较方便，而从酵母中分离DNA较困难；
③BAC的复制子来源于F因子，可稳定遗传，嵌合及重组现象少；④可以通过菌落原位杂交来筛选目的基因，方便快捷；⑤BAC载体在克隆位点的两侧具有T7和Sp6聚合酶启动子，可以用于转录获得RNA探针或直接用于插入片段的末端测序。
MB1系列（来源于ColE1）的高拷贝型复制起点②Ampr基因pSP2124质粒的Ampr基因③Tetr基因pSC101的Tetr基因。
4363bp
氨苄青霉素和四环素抗性
24个克隆位点。
其中9个会导致Tetr基因失活（如BamH I、HindⅢ、Sal I）；
3个会导致Ampr基因失活（Sca I、PvuI、Pst I）。
2.7kb
Ampicillin抗性和lacZ的α肽互补（蓝白斑）相结合。
10个连续的单一限制酶切位点，位于lacZ’基因的5’端。
TA载体
耐热聚合酶可在PCR产物的3’端加上一个非配对的脱氧腺嘌呤核苷(A)。根据这一特点研制出线性
TA载体构建：
在一般质粒载体的基础上构建。
TA质粒载体，其5’端各带有一个不配对的脱氧胸腺嘧啶(T)，用该载体可进行PCR产物的直接克隆。
λ噬菌体载体相对于质粒载体失活：如λgt10、λNM1149等载体，在cI基因上有EcoR I及Hind III的酶切位点。外源基因插入后将导致cI基因的失活。cI基因失活后将导致噬菌体不能溶原化，产生清晰的噬菌斑。相反，产生混浊的噬菌斑。
插入式载体
置换型载体（取代型载体）
M
13噬菌体载体
M13噬菌体的基因组为单链DNA。噬菌体颗粒的大小受其DNA端点制约的，不存在包装限制。只感染雄性大肠杆菌
基因间隔区（intergenic region, IG区）基因II与基因IV之间存在一段507bp的基因间隔区，内含有复制起始位点，是实施改造、构建人工载体的重点区域。②IG区内只有一个BsuI切点。（2）加入酶切位点，在IG区内加入单一内切酶位点。M13mp1在IG区内插入一个大肠杆菌的LacZ’（a-肽序列)。
酵母人工染色体载体YAC
细菌人工染色体载体BAC
P1噬菌体人工染色体载体PAC
质粒载体总结
质粒载体
类型
长度
选择标记
克隆位点
pSC101
天然质粒，属严紧型、低拷贝型
9.09 kb
四环素抗性Tetr
7个克隆位点：EcoR I、Xho I、Pvu I、Hind III、BamH I、Sal I、Sam I
粘粒（cosmid）是带有cos序列的质粒。cos序列是l噬菌体DNA中将DNA包装到噬菌体颗粒中所需的DNA序列。黏粒的组成包括质粒复制起点（colE1），抗性标记（ampr），cos位点，因而能象质粒一样转化和增殖。克隆的最大DNA片段可达45kb。有的粘粒载体含有两个cos位点，在某种程度上可提高使用效率。
YAC
是最常用来克隆很大DNA片段（2Mb）的系统。
为构建YAC需要结合四个短序列：即二个端粒、一个着丝粒和一个ARS元件，并将一适当大小的外源DNA连接成一线性DNA分子，而端粒序列位于正确的末端。
YAC的构建有比在细菌中克隆的一些优点，因为某些真核细胞的序列，特别是重复序列是难以甚至不可能在细菌中繁殖的，酵母细胞却具有这样的能力
(1)基因组大小；去除非必需区，建立外源DNA片段的克隆或替换位点（2）在DNA的非必需区插入选择标记：lacZ基因；基因cⅠ失活（cI基因：溶源过程控制基因）；Spi筛选（野生型λ噬菌体在带有P2原噬菌体的溶源性E.coli中的生长会受到限制的表型，称作Spi+，即对P2噬菌体的干扰敏感）
1)通过裂解过程增殖载体2)载体与外源DNA的酶切3)外源DNA与载体的连接4)重组噬菌体的体外包装5)包装噬菌体颗粒的感染6)筛选（λ噬菌体载体的克隆原理）
噬菌粒载体
能像质粒那样在受体细胞中自主复制能像M13-DNA那样体外包装，并高效转染受体细胞装载量比常规的M13mp系列要大很多（10kb通过克隆双链DNA能获得同等长度的单一单链DNA
噬菌粒载体综合了质粒载体和M13噬菌体载体优点，含有ColEl复制起始位点、抗生素抗性选择标记和丝状体噬菌体DNA间隔区(含有噬菌体DNA复制起始、终止以及噬菌体颗粒形态发生所必需的全部顺式作用元件)
细菌人工染色体载体
BAC
是基于大肠杆菌的F质粒构建的，高通量低拷贝的质粒载体
每个环状DNA分子中携带一个抗生素抗性标记，一个来源于大肠杆菌F因子（致育因子）的严谨型控制的复制子oriS（Shizuya et al. 1992），一个易于DNA复制的由ATP驱动的解旋酶（（RepE）以及三个确保低拷贝质粒精确分配至子代细胞的基因座（parA,parB,和parC）
主要使用EcoR I
ColE1
天然质粒，属松弛型多拷贝型
6.3 kb
大肠杆菌素（colicin）E1和对E1免疫的基因（immE1）
EcoR I位于E1内部，插入外源DNA会导致E1失活，使受体菌不能合成E1（ColE1-），但仍然表现出对E1免疫型（ImmE1+）
pBR322
元件来源①复制起点orip
表达载体
分类
结构组成及表达元件
特点或优点
备注
质粒表达载体
原核表达载体
1启动子、
2转录终止子（防止克隆的外源基因表达干扰载体的稳定性）
3核糖体结合位点
表达方式有：
组成型表达，
诱导型表达。
融合型表达，
分泌型表达。
启动子类型：根据作用方式及功能分类①组成型启动子
②组织特异启动子又称器官特异性启动子。
③诱导型启动子
Lac Z基因插入失活：如charon16A载体，在非必须区段引入lac Z基因，在lac Z基因上有EcoR I位点，插入失活后利用X-gal法筛选（蓝白筛选）
置换型载体（取代型载体）
具有成对的克隆位点，在这两个位点之间的λDNA区段可以被外源DNA片段所取代。
野生型噬菌体染色体的中段对于噬菌体的感染和复制是非必要的，外源DNA可以取代这一片段
它具有质粒的复制起点、选择性标记、多克隆位点等，方便DNA的操作，可在细胞内稳定存在；又具有单链噬菌体的复制起点，在辅助噬菌体的存在下，可进行噬菌体的繁殖，产生单链的子代噬菌体
1.具有较小分子量基因组DNA，可克隆10kb的外源DNA片段，并易于进行分离与操作；2.编码一个ampr基因作为选择记号，便于转化子的选择；3.拷贝数含量高4.存在着一个多克隆位点区，因此多种不同类型的外源DNA片段，不经修饰便可直接插入到载体分子上；5.多克隆位点区阻断了大肠杆菌lacZ基因的5’-端编码区，可按照IPTG显色反应试验筛选6. lacZ基因是置于lac启动子的控制之下，插入的外源基因便会以融合蛋白质的形式表达；
pUC系列
（i）来自pBR322质粒的复制起点（ori）；（ii）氨苄青霉素抗性基因（ampr），但它不再含有原来的核酸内切限制酶的单识别位点；（iii）大肠杆菌β-半乳糖酶基因（lacZ）的启动子及其编码α-肽链的DNA序列，此结构特称为lacZ′基因；（iv）位于lacZ′基因中的靠近5′-端的一段多克隆位点（MCS）区段，但它并不破坏该基因的功能
设计构建的柯斯质粒一般长4～6kb。其上的cos位点的一个重要作用是识别噬菌体的外壳蛋白。凡具有cos位点的任何DNA分子只要在长度相当于噬菌体基因组，就可以同外壳蛋白结合而被包装成类似噬菌体λ的颗粒。因此，插入柯斯质粒的外源DNA可大于40kb。重组的柯斯质粒可象噬菌体λ一样感染大肠杆菌，并在细菌细胞中复制。