生物样品中药物定量分析的指导原则与实验实施

2.1.8 基质效应 2.1.9 稳定性 2.2 部分验证 2.3 交叉验证 3. 试验样品分析 3.1 分析批 3.2 分析批的接受标准 3.3 校正范围 3.4 试验样品的重新分析和报告值选择 3.5 完整性 3.6 用于评价方法重现性的试验样品再分析
EMEA
2.1.1 选择性 2.1.2 残留 2.1.3 定量下限 2.1.4 标准曲线 2.1.5 准确度 2.1.6 精密度 2.1.7 稀释可靠性 2.1.8 基质效应 2.1.9 稳定性
14.05 ng/ml
C. Wang et al. / J. Chromatogr. B 854 (2007) 48–56
前一针进样的残留对后一针进样的干扰。 一般多发生在高浓度进样后。 先进一针工作曲线的最高浓度，再紧接着进一针空
白，观察是否有干扰，干扰峰面积小于LLOQ的峰 面积的20%，小于内标峰面积的5%，可以接受。 如干扰，需要消除。
稳定性的考察时间尺度应该不小于试验样品的储存时间及 相应条件下的处理方式或时间。
分析物和内标的储备液和工作溶液的稳定性。 基质中分析物冷冻和融化稳定性。 基质中分析物在冰箱储存的长期稳定性。 处理过的样品在室温下或在试验过程储存条件下的稳定性。 处理过的样品在自动进样器温度下的稳定性。 储存前预处理的基质中分析物的稳定性。
基质因子 变异系数<15%
Set 1 纯净溶液
浓度C
Set 2 空白血浆沉淀蛋白
＋ 标准溶液
浓度C
Set 3 QC血浆沉淀蛋白
浓度C
最终进样检测浓度相同
Set 2
基质因子＝
×100%
Set 1
分析物基质因子
内标基质因子
内标归一化基质因子
J. Wen et al. / J. Chromatogr. B 867 (2008) 153–159
6个不同来源的空白基质分别分析。 如有干扰，则干扰的峰面积小于LLOQ的峰面积的
20%，小于内标峰面积的5%，可以接受。
在新药研究中需要按照要求在报告上提供相应数 量的典型色谱图
J. Wen et al. / Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis 43 (2007) 655–658
选择结构类似的化 合物为内标可以很 好的消除基质效应 的影响，应用峰面 积比值进行定量， 其基质效应约为 100%
选择低浓度和高浓度质控样品进行验证。 预处理后或者在相应条件储存后立即分析得到该条
件下数据。 制备随行标准曲线，求算上述质控样品的浓度，与
标示浓度比较，均值应与标示浓度的偏差在+/15%之内。【不是比较色谱峰面积】
定浓度+初始浓度）/2]*100%
至少67%的复测样品的结果在+/-20%之内。 以下情况需要再分析：
◦ 毒代动力学，每个物种1次 ◦ 关键性的生物等效性试验 ◦ 首次用于人体或者患者的药物试验 ◦ 首次用于肝肾功能不全患者的药物试验
指定浓度范围内评价仪器对分析物的响应程度。
制备各个浓度的校正标样——基质相同。
每个分析批都应该有一条标准曲线。
6个校正浓度水平+空白样品+零浓度样品（空白+内标）
绘制工作曲线
评价干扰
验证中需要评价3条标准曲线。
回算浓度应该在标示值的+/-15%，LLOQ+/-20%之内
回算浓度偏差=【（实测值－标示值）/标示值】X100%
主要理由：
◦ 校正标样或质控样品不合格
◦ 内标的响应与校正标样和质控样品的内标响应差异显著
◦ 仪器功能异常或者进样不当 ◦ 高于定量上限或者低于定量下限 ◦ 空白或安慰剂样品中测到分析物
不接受由于药
动学行源自文库不佳
而重新分析的 理由
◦ 色谱图难看
在SOP中应该对色谱的积分和重新积分进行规定。 任何偏移SOP的色谱积分都应该在报告中讨论。 色谱积分参数、重新积分参数、初始积分结果和调
+/-20% +/-15%
批内准确度：1个分析批进行验证，每个浓度至少5 个样品。
批间准确度：3个分析批进行验证，且至少进行两 天，每个浓度至少5个样品。
分析物重复测定的接近程度。 测量值的相对标准偏差（变异系数）。 采用与准确度验证相同的分析批结果进行计算。 4个浓度验证。 定量下限变异系数不超过20%。 其余浓度点不超过15%。
同一份质控或者试验样品被两种分析方法测定，评 价均值的差异。
质控样品：+/-15%以内 试验样品：+/-20%以内
3.1 分析批 空白样品 零浓度样品 校正标样——至少6个（与验证相同） 质控样品——低、中、高3个浓度，各2份（不少于
试验样品总数的5%）-分散处理 试验样品
校正标样：
判断样品稀释后是否会影响定量的准确度和精密度。 配制高于定量上限浓度的样品。 用空白基质稀释该样品。 每个稀释因子至少测定5个数据，其准确度和精密
度应在+/-15%之内。
质谱方法应该考察基质效应。 采用至少6批来自不同供体的基质，不可以合并基
质。 选择高、低两个质控浓度进行。 求算不同浓度的基质因子。 计算内标归一化基质因子=分析物基质因子/内标
◦ 调整标准曲线范围和质控样品浓度 ◦ 或者加入新的质控样品浓度
试验样品分析浓度高于定量上限
◦ 延伸标准曲线范围，增加额外浓度的质控样品 ◦ 或者改变试验样品浓度（稀释）
至少应该有2个质控样品浓度落在试验样品的浓度范围内 改变标准曲线，需要重新进行方法学验证（部分验证）
事先制定SOP确定重新分析的理由和选择报告值的 标准，并在报告中提供重新分析的样品数目及比例。
CFDA：并未给出如何部分验证， 究竟应该选择哪些部分验证，因
此需要自行判断并说明理由。
EMEA：部分验证可以少到测定 批间精密度和准确度，也可以至
几乎全部验证内容。
应用不同的方法从一项或多项试验获得数据，或者 应用同一方法从不同试验地点获得数据时，需要互 相比较数据，应该进行分析方法的交叉验证。
添加MQC浓度
1. 证明处理溶剂（包括流动相）中 未有需要测定的成分
2. 证明内源性成分存在测定成分
3. LLOQ添加图谱显示添加测定成 分后，峰面积增加，并辅以数据说 明（标准曲线）
Lijun Cui et al./ Biomed. Chromatogr. 2009; 23: 1151–1159
如果存在外源性非测定成分影响？（例如中西药合并给药）
整后的积分结果都需要在实验室存档，并备查。
在过了若干天后，对试验样品在另外一个分析批进 行重新分析，评价实际样品测定的准确度。
一般重新分析10%的样品。 如果样品总数超出1000，则超出部分重新分析5%。 建议选择消除相和Cmax附近的样品再分析。 评价指标=（重新测定浓度-初始浓度）/[（重新测
当线性范围较宽 浓度 的时候，推荐采 10
用加权的方法对 20 标准曲线进行计 50
100
算，以使低浓度 200 点计算得比较准 500 确。即低浓度点 1000
满足回算的要求。
峰面积比 0.102 0.139 0.241 0.443 0.862 2.284 4.309
INTERCEPT SLOPE
如果待测组分是内源性成分？
空白生物样品中的I属 于内源性物质
样品处理用的水及流动相中不含有I
Lijun Cui et al./ Biomed. Chromatogr. 2009; 23: 1151–1159
空白生物样品标准添 加I依旧可以测定
如果待测组分是内源性成分？
添加LLOQ浓度
实测样品
准确度是指在确定的分析条件下，测得的生物样品 浓度与真实浓度的接近程度。
校正标样——绘制工作曲线。 二者需要分别配制，
质控样品——评估准确度。
即储备液不相同
用4个浓度评价
◦ 定量下限 ◦ 低浓度QC～～LLOQ的3倍以内 ◦ 中浓度QC～～标准曲线中间浓度 ◦ 高浓度QC～～标准曲线上限的75%
2015.6.30
方法学确证是整个药代动力学研究的基础。 所有药代动力学研究结果，都依赖于生物样品的测
定，只有可靠的方法才能得出可靠的结果。
通过准确度、精密度、特异性、灵敏度、重现性、 稳定性等研究建立了测定方法，得到了标准曲线后， 在检测过程中还应进行方法学质控，制备随行标准 曲线并对质控样品进行测定，以确保检测方法的可
◦ 回算浓度偏差在标示值的+/-15%以内。 ◦ 定量下限+/-20%以内 ◦ 不少于6个标样符合上述要求。校正标样越多，需要75%的标样
符合
质控样品：
◦ 准确度+/-15%以内 ◦ 67%的质控样品符合 ◦ 不符合的应该不在同一个浓度水平
如不符合，重新测试。
试验样品分析浓度范围比验证时候工作曲线窄
苯丙胺 空白血浆 盐酸伪麻黄碱
苯海拉明
空白血浆+生姜提取物 充分考察同时给药的成分是否会影 响待测成分的专一检测
C. Wang et al. / J. Chromatogr. B 854 (2007) 48–56
0.5ng/ml 空白血浆+标准样品 1.0ng/ml 4.10 ng/ml 给药速效抗晕胶囊后24h血样浓度
犬血浆中的盐 酸克伦特罗的 测定
A. 空白样品；
B. B. 0.1 ng/ml标准
血浆；
C. 进样10 ng/ml标
准血浆样品后进
残留
样的空白样品
洗针的溶剂、次数；提取溶 剂；复溶比例等重新优化
能够被可靠定量的样品中分析物的最低浓度，具有 可接受的准确度和精密度。
是标准曲线的最低点。 应该满足预期的浓度与实验目的。 准确度应在标示值的+/-20%范围内。 变异系数不得超过20%。
FDA
1. 范围 测定对象确定——生物基质中的药物浓度。 适合于非临床或临床试验样品实际分析的基本要求。 规定部分验证或交叉验证的适用范围。
2.1 完整验证 每个物种和每种基质进行完整验证。 难以获得相同基质，可以采用适当基质替代并给出
理由。 完整验证包括：选择性、定量下限、响应函数和校
R2
1 139.7 112.9 92.6 93.3 95.3 104.3 99.2 0.0419 0.004301 0.9991
权重 1/x
117.7 102.3 88.7 91.7 95.0 104.7 99.8 0.05178 0.004265 0.9991
1/x2 103.6 97.6 89.5 94.8 99.2 110.1 105.2 0.06014 0.00404 0.9942
正范围、准确度、精密度、基质效应、分析物的稳 定性。
对照标准物质
对照标准物质的溶液+空白生物基质=校正标样
色谱法需要使用内标
对照标准物质需要提供：
分析证书、储存条件、失效日期、批号。
内标： 证明可适用，即无干扰。
质谱分析推荐使用 同位素内标
区分目标分析物和内标与基质的内源性组分或样品 中其他组分（代谢产物或共同服用的其他药物）。
FDA：Guidance for Industry Bioanalytical
Method Validation
2013年修订版本
EMEA：Guideline on bioanalytical method
validation
2012年版本
CFDA
1. 范围 2. 生物分析方法验证 2.1 分析方法的完整验证 2.1.1 选择性 2.1.2 残留 2.1.3 定量下限 2.1.4 标准曲线 2.1.5 准确度 2.1.6 精密度 2.1.7 稀释可靠性
靠性。
CFDA关于相关生物样品定量分析的要求
化学药物非临床药代动力学研究技术指导原则 化学药物临床药代动力学研究技术指导原则 化学药物制剂人体生物利用度和生物等效性研究技术指导原则
2005年陆续在相 关研究中颁布
9012 生物样品定量分析方法验证指导原则
《中国药典》 2015年版四部
国外相关指导原则
储备液稳定性：4度冰箱或者-20度冰箱 长期冷冻稳定性：-20度或者-80度冰箱 冻融稳定性：3个冻融循环（冷冻8h以上） 自动进样器稳定性：预处理后放置自动进样器上，
时间长短与分析批有关 室温稳定性：室温放置的稳定性，与前处理一个分
析批有关 采血后全血稳定性：与药物是否易降解有关
分析方法的转移 仪器的改变 校正浓度范围的改变 样品体积的改变 改变基质或者物种 改变抗凝剂 改变样品处理步骤 改变储存条件