分子生物学分子克隆技术
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获得需要的目的基因常用的方法： （1）直接从生物体中提取总DNA，构建基因文库(gene library)，从中调用
目的基因； （2）以mRNA为模板，反转录合成互补的DNA片段； （3）利用聚合酶链式反应（PCR）特异性地扩增所需要的目的基因片段，
等等。
细胞内总DNA的提取分离与基因文库的构建
细胞内总DNA的提取分离程序
紫外分光光度计测定DNA溶液的纯度和浓度。
基因工程的工具酶
“手术刀” “缝纫针” “复印机”
专司切割之职，内切酶 具有连接之功，连接酶 行使复制之责，DNA聚合酶
(“交通工具车子”)——载体
有了切割与缝合（ligase）基因DNA的工具，还得 有一个“车子”将重组DNA送到宿主细胞中去。
目的基因的高效分泌表达
概念：目的蛋白分泌到细胞周质和目的蛋白转运到细胞周质后再 分泌到细胞外
优点：① 防止宿主菌对表达产物的降解；②有利于蛋白质正确折 叠，形成天然构象③减轻宿主细胞代谢负荷④有利于分离
内切酶
“手术刀” “缝纫针” “复印机”
专司切割之职 具有连接之功 行使复制之责
内切酶 连接酶 聚合酶
内切酶
同裂酶(Isoschizomers）
同尾酶
星活性*
所谓星活性又称Star活性。是指由于反应条件不同而产生的切断 与原来认识序列不同的位点的现象，也就是说产生Star活性后， 不但可以切断特异性的识别位点，还可以切断非特异性的位点。 产生Star活性的结果是酶切条带增多。
分离工程
分
离
酶
工
程
酶工程
野生细胞
基因工程 蛋白质工程 途径工程
工程细胞
发酵工程 细胞工程
生物活性物质
用携带了外源基因的农杆菌Ti质粒转化植物原生 质体，发育成具有新性状的完整植株——转基因植物。
基因工程的工具酶
“手术刀” “缝纫针” “复印机”
专司切割之职 具有连接之功 Βιβλιοθήκη Baidu使复制之责
内切酶 连接酶 聚合酶
分子克隆
基因工程
基因工程是指在微观领域（分子水 平）中，根据分子生物学和遗传学 原理，设计并实施一项把一个生物 体中有用的目的DNA(遗传信息)转 入另一个生物体中，使后者获得新 的需要的遗传性状或表达所需要的 产物，最终实现该技术的商业价值。
基因工程的基本特点是，分子水平 操作，细胞水平表达。
➢ 重组DNA操作一般步骤：
（1）获得目的基因； （2）与克隆载体连接，形成新的重组
DNA分子； （3）用重组DNA分子转化受体细胞，
并能在受体细胞中复制和遗传； （4）对转化子筛选和鉴定； （5）对获得外源基因的细胞或生物体
通过培养，获得所需的遗传性状或 表达出所需要的产物。
获得需要的目的基因（外源基因）
四、分子克隆的技术支撑
核酸凝胶电泳技术 核酸分子连接技术 细菌转化技术 DNA序列分析技术 寡核苷酸合成技术 基因定点突变技术 聚合酶链反应（PCR）技术 DNA序列测定技术
核酸凝胶电泳
细菌转化技术 （包括感受态细胞制备）
聚合酶链反应（PCR）技术
大规模生产生物活性物质
野生细胞
表达型基因工程的载体----以PET32为例
多克隆位点
宿主
要考虑宿主菌对密码子的偏爱性 大肠杆菌不同密码子的偏爱性问题，将64组密码子分为强、中
、弱密码子
目的产物
目的基因不溶性的高效表达 过程：目的基因编码的真核蛋白质与宿主基因编码的原核多肽或或其
它基因编码的具有其它功能的多肽和结合在一起，这种结合在一起的 形成的不溶性无活性的包涵体，又叫为融合蛋白。 举例：胰岛素与β-半乳糖苷酶形成包涵体 优点：避免细菌蛋白酶破坏，提高目的基因表达产物产量。 缺点：需要经过溶解和复性才能获得有活性的 适合：不需要翻译后修饰的蛋白质产物
基因工程与建筑工程
基因工程的核心技术是DNA重组技术
重组DNA技术的重大突破带动了现代生物技术的兴起，并 很快产生了许多生命科学的高技术产业。
重组DNA技术，又称为基因或分子克隆技术，是基因工程 的核心技术。该技术包括了一系列的分子生物学操作步骤。
分子克隆技术
又称为重组DNA技术，是指将一种生物体（供体）的基因与载体在 体外进行拼接重组，然后转入另一种生物体（受体）内，使之按照人 们的意愿稳定遗传并表达出新产物或新性状的DNA体外操作程序。 供体、受体、载体是重组DNA技术的三大基本元件。
DNA聚合酶
Taq酶
用Taq酶扩增DNA时常使片段3‘端凸出一个A。
Pfu酶
产生平末端产物。
连接酶
T4 DNA Ligase (invitrogen) 16°C过夜或者室温1-2个小时了连接即可。
基因工程的载体---用于扩增
克隆载体必备条件
（1）具有复制起点 （2）具有抗菌素抗性基因 （3）具有若干限制酶单一识别位点 （4）具有较小的相对分子质量和较高的拷贝数。
逆转录酶
使真核基因的制备成为可能。
（1）真核基因组庞大而复杂，不易制得基因图谱。
（2）即使有了基因图谱，因为真核基因有内含子，不能 在原核表达系统剪接出mRNA，没有成熟的mRNA就不 能得到相应得产物。
（3）经过逆转录mRNA→cDNA (complementory DNA)得 到的cDNA文库要比基因组文库小得多，所以筛选阳性克 隆就方便得多。
Differences which can lead to star activity include low ionic strength, high pH, and high (> 5% v/v) glycerol concentrations.
High Fidelity (HF) Restriction Enzymes can be used to reduce star activity.
基因操作技术及其应用
参考书目资料
《分子克隆实验指南》（第三版）：美J.萨姆布鲁克等著, 黄培堂等译 ，科学出版社，2008.
《Gene IX》：Benjamin Lewin编著. 《基因工程原理》：吴乃虎，科学出版社，1998. 《分子生物学实验指导》：郜金荣，叶林柏，武汉大学出版社，2007. 《基因工程》：张惠展，华东理工大学出版社，2005.
目的基因； （2）以mRNA为模板，反转录合成互补的DNA片段； （3）利用聚合酶链式反应（PCR）特异性地扩增所需要的目的基因片段，
等等。
细胞内总DNA的提取分离与基因文库的构建
细胞内总DNA的提取分离程序
紫外分光光度计测定DNA溶液的纯度和浓度。
基因工程的工具酶
“手术刀” “缝纫针” “复印机”
专司切割之职，内切酶 具有连接之功，连接酶 行使复制之责，DNA聚合酶
(“交通工具车子”)——载体
有了切割与缝合（ligase）基因DNA的工具，还得 有一个“车子”将重组DNA送到宿主细胞中去。
目的基因的高效分泌表达
概念：目的蛋白分泌到细胞周质和目的蛋白转运到细胞周质后再 分泌到细胞外
优点：① 防止宿主菌对表达产物的降解；②有利于蛋白质正确折 叠，形成天然构象③减轻宿主细胞代谢负荷④有利于分离
内切酶
“手术刀” “缝纫针” “复印机”
专司切割之职 具有连接之功 行使复制之责
内切酶 连接酶 聚合酶
内切酶
同裂酶(Isoschizomers）
同尾酶
星活性*
所谓星活性又称Star活性。是指由于反应条件不同而产生的切断 与原来认识序列不同的位点的现象，也就是说产生Star活性后， 不但可以切断特异性的识别位点，还可以切断非特异性的位点。 产生Star活性的结果是酶切条带增多。
分离工程
分
离
酶
工
程
酶工程
野生细胞
基因工程 蛋白质工程 途径工程
工程细胞
发酵工程 细胞工程
生物活性物质
用携带了外源基因的农杆菌Ti质粒转化植物原生 质体，发育成具有新性状的完整植株——转基因植物。
基因工程的工具酶
“手术刀” “缝纫针” “复印机”
专司切割之职 具有连接之功 Βιβλιοθήκη Baidu使复制之责
内切酶 连接酶 聚合酶
分子克隆
基因工程
基因工程是指在微观领域（分子水 平）中，根据分子生物学和遗传学 原理，设计并实施一项把一个生物 体中有用的目的DNA(遗传信息)转 入另一个生物体中，使后者获得新 的需要的遗传性状或表达所需要的 产物，最终实现该技术的商业价值。
基因工程的基本特点是，分子水平 操作，细胞水平表达。
➢ 重组DNA操作一般步骤：
（1）获得目的基因； （2）与克隆载体连接，形成新的重组
DNA分子； （3）用重组DNA分子转化受体细胞，
并能在受体细胞中复制和遗传； （4）对转化子筛选和鉴定； （5）对获得外源基因的细胞或生物体
通过培养，获得所需的遗传性状或 表达出所需要的产物。
获得需要的目的基因（外源基因）
四、分子克隆的技术支撑
核酸凝胶电泳技术 核酸分子连接技术 细菌转化技术 DNA序列分析技术 寡核苷酸合成技术 基因定点突变技术 聚合酶链反应（PCR）技术 DNA序列测定技术
核酸凝胶电泳
细菌转化技术 （包括感受态细胞制备）
聚合酶链反应（PCR）技术
大规模生产生物活性物质
野生细胞
表达型基因工程的载体----以PET32为例
多克隆位点
宿主
要考虑宿主菌对密码子的偏爱性 大肠杆菌不同密码子的偏爱性问题，将64组密码子分为强、中
、弱密码子
目的产物
目的基因不溶性的高效表达 过程：目的基因编码的真核蛋白质与宿主基因编码的原核多肽或或其
它基因编码的具有其它功能的多肽和结合在一起，这种结合在一起的 形成的不溶性无活性的包涵体，又叫为融合蛋白。 举例：胰岛素与β-半乳糖苷酶形成包涵体 优点：避免细菌蛋白酶破坏，提高目的基因表达产物产量。 缺点：需要经过溶解和复性才能获得有活性的 适合：不需要翻译后修饰的蛋白质产物
基因工程与建筑工程
基因工程的核心技术是DNA重组技术
重组DNA技术的重大突破带动了现代生物技术的兴起，并 很快产生了许多生命科学的高技术产业。
重组DNA技术，又称为基因或分子克隆技术，是基因工程 的核心技术。该技术包括了一系列的分子生物学操作步骤。
分子克隆技术
又称为重组DNA技术，是指将一种生物体（供体）的基因与载体在 体外进行拼接重组，然后转入另一种生物体（受体）内，使之按照人 们的意愿稳定遗传并表达出新产物或新性状的DNA体外操作程序。 供体、受体、载体是重组DNA技术的三大基本元件。
DNA聚合酶
Taq酶
用Taq酶扩增DNA时常使片段3‘端凸出一个A。
Pfu酶
产生平末端产物。
连接酶
T4 DNA Ligase (invitrogen) 16°C过夜或者室温1-2个小时了连接即可。
基因工程的载体---用于扩增
克隆载体必备条件
（1）具有复制起点 （2）具有抗菌素抗性基因 （3）具有若干限制酶单一识别位点 （4）具有较小的相对分子质量和较高的拷贝数。
逆转录酶
使真核基因的制备成为可能。
（1）真核基因组庞大而复杂，不易制得基因图谱。
（2）即使有了基因图谱，因为真核基因有内含子，不能 在原核表达系统剪接出mRNA，没有成熟的mRNA就不 能得到相应得产物。
（3）经过逆转录mRNA→cDNA (complementory DNA)得 到的cDNA文库要比基因组文库小得多，所以筛选阳性克 隆就方便得多。
Differences which can lead to star activity include low ionic strength, high pH, and high (> 5% v/v) glycerol concentrations.
High Fidelity (HF) Restriction Enzymes can be used to reduce star activity.
基因操作技术及其应用
参考书目资料
《分子克隆实验指南》（第三版）：美J.萨姆布鲁克等著, 黄培堂等译 ，科学出版社，2008.
《Gene IX》：Benjamin Lewin编著. 《基因工程原理》：吴乃虎，科学出版社，1998. 《分子生物学实验指导》：郜金荣，叶林柏，武汉大学出版社，2007. 《基因工程》：张惠展，华东理工大学出版社，2005.