20味中药提取物对鸭疫里默氏杆菌体外抑菌效果的研究

20味中药提取物对鸭疫里默氏杆菌体外抑菌效果的研究蔡红;李莉;殷中琼;李曼;代如意;康帅;彭练慈;曲径;胡涛【摘要】试验旨在筛选得到对鸭疫里默氏杆菌有良好体外抑菌效果的中药.采用超声波处理、乙醇回流、水浴加热等方法提取杜仲等中药的有效部位,用二倍试管稀释法分别测定其提取物对鸭疫里默氏杆菌的最小抑菌浓度(minimal inhibitory concentration,MIC)和最小杀菌浓度(minimal bactericidal concentration,MBC),并通过棋盘法测定中药提取物对鸭疫里默氏杆菌的联合抑菌效果.结果表明,杜仲等中药提取物对鸭疫里默氏杆菌的MIC值范围为15.60～250.00 mg/mL,其中杜仲、大黄、板蓝根、佛手、秦皮和大青叶的MIC值均为15.60 mg/mL,而金银花、姜黄、黄芩、黄芪和紫草MIC值均大于125.00 mg/mL;通过联合抑菌研究,结果发现杜仲和秦皮联合具有相加作用,白头翁、杜仲和秦皮联合均表现无关作用,秦皮与大黄联合表现相加作用,白头翁与大黄联合表现颉颃作用.提示,杜仲、大黄、板蓝根、佛手、秦皮和大青叶对鸭疫里默氏杆菌的体外抑菌作用较好,而金银花、姜黄、黄芩、黄芪和紫草对鸭疫里默氏杆菌的体外抑菌作用较差,杜仲、秦皮和白头翁可组成一个具有抑制鸭疫里默氏杆菌作用的中药组方.【期刊名称】《中国畜牧兽医》【年(卷),期】2013(040)008【总页数】5页(P101-105)【关键词】中药;鸭疫里默氏杆菌;体外抑菌【作者】蔡红;李莉;殷中琼;李曼;代如意;康帅;彭练慈;曲径;胡涛【作者单位】四川农业大学动物医学院,四川雅安 625014;四川农业大学动物医学院,四川雅安 625014;四川农业大学动物医学院,四川雅安 625014;四川农业大学动物医学院,四川雅安 625014;四川农业大学动物医学院,四川雅安 625014;四川农业大学动物医学院,四川雅安 625014;四川农业大学动物医学院,四川雅安 625014;四川农业大学动物医学院,四川雅安 625014;四川农业大学动物医学院,四川雅安625014【正文语种】中文【中图分类】S853.73鸭疫里默氏杆菌病是由鸭疫里默氏杆菌（Riemerell a anatipestfer，RA）引起的接触性、传染性疾病，又称为鸭传染性浆膜炎、鸭败血症等，多见于1～8周龄的雏鸭，呈急性或慢性败血症，临床上主要表现为眼和鼻分泌物增多、喘气、咳嗽、下痢、头颈震颤或歪斜等症状，易引起雏鸭的大批发病和死亡，雏鸭发病死亡率可达40%（郑铁锁等，2012）。

鸭疫里默氏杆菌病一年四季均可发生，并能发生与其他细菌混合感染。

鸭疫里默氏杆菌对氟苯尼考及头孢类药物很敏感，对盐酸环丙沙星及庆大霉素次之，对四环素及复方新诺明不敏感（孙静等，2011）。

在现代化鸭养殖生产中，持续使用这些抗生素类药物极易诱导细菌产生抗药性，使养殖中抗菌成本增加，并引起鸭消化道菌群失调，产品药物残留，进入人体后产生药物蓄积、中毒等问题。

目前，新抗生素的产生不及耐药菌株形成的速度，研制一个新的抗生素所花费的时间和成本较大，寻找并研制新型抗菌药是最为理想的解决途径。

中药在现代预防和控制细菌性感染疾病方面发挥了积极作用，某些中药的抑菌活性高，且不易诱导细菌产生耐药性，因此，研究和开发抗菌中药对解决耐药菌株的产生和抗生素短缺问题具有重要意义。

本研究拟选择杜仲等20余味中药作为研究对象，根据其有效成分的脂溶性，以水或乙醇对其有效部位进行提取，通过测定其最小抑菌浓度（minimal inhibitory concentration，MIC）和最小杀菌浓度（mini mal bactericidal concentration，MBC）评价中药对鸭疫里默氏杆菌的体外抑菌活性，从而筛选得到具有较好抗菌活性的中药，并通过体外联合抑菌试验确定较好的中药组方。

1 材料与方法1.1 材料1.1.1 中药杜仲、大黄、板蓝根、佛手、栀子、白头翁、何首乌、荆芥、金银花、姜黄、黄柏、黄芩、黄芪、连翘、秦皮、紫草、青蒿、大青叶、苦参和夏枯草均购于成都市荷花池中药材市场。

1.1.2 菌种与培养基鸭疫里默氏杆菌由四川农业大学动物医学院微生物实验室惠赠；鲜血琼脂平板、大豆胰酶肉汤和营养琼脂平板均按照日常规格配制。

1.1.3 仪器和试剂中草药粉碎机购自天津市泰斯特仪器有限公司；手提式高压灭菌器Y WQ.SG41.280购自海益恒试验仪器有限公司；电热恒温培养箱PYX－DHS－40X－50购自上海跃进医疗器械厂；SW－CJ－IB型超净工作台购自苏州净化设备有限公司；恒温水浴锅购自巩义市英峪高科仪器厂；旋转蒸发仪R502B购自上海亚荣生化仪器厂；SHB－循环水多用真空泵购自郑州杜甫仪器厂；BS－210S电子天平购自北京赛多利斯天平有限公司；HS－120D超声波清洗机购自上海新芝生物技术研究所；微量进样器、二甲亚砜、无水乙醇、石油醚、丙酮、乙醚、T 型涂布棒、90 mm玻璃培养皿。

1.2 方法1.2.1 中药提取物的制备将20味中药按照金波等（2005）方法提取，最后将提取物浓缩得到提取物浸膏，编号后置于4℃中保存。

1.2.2 菌悬液的制备将鸭疫里默氏杆菌接种于鲜血琼脂平板上，置于烛缸中，37℃培养24 h。

细菌培养后，接种于无菌大豆胰酶肉汤中，涂板计数，制备所需浓度菌液。

取灭菌试管，用无菌生理盐水将已知浓度的菌液作倍比稀释，使菌液浓度达到108 CFU/mL，备用。

1.2.3 体外抑菌试验1.2.3.1 最小抑菌浓度的测定以杜仲抗鸭疫里默氏杆菌为例，取杜仲提取物浸膏2 g，加2 mL二甲亚砜溶解；取灭菌试管12支，编号，每管先加入灭菌大豆胰酶肉汤1 mL，然后于第1管中加入制备好的杜仲提取物浸膏二甲亚砜溶液1 mL，混匀后取出1 mL放入第2管，依此类推至第9管，弃掉1 mL，第10管不加药物，作为阳性对照；第11管加杜仲提取物浸膏溶液1 mL，混匀后取出1 mL弃去，不加细菌，作为阴性对照；第12管加二甲亚砜1 mL，混匀后取出1 mL弃去，不加细菌，作为空白对照。

取制备好的细菌稀释液0.1 mL，分别加入上述1～10管中混匀，第11和12管加灭菌生理盐水0.1 mL，使得第1～9管药物浓度分别为500.00、250.00、125.00、62.50、31.25、15.60、7.80、3.90、1.95 mg/mL。

各管置于恒温培养箱中37℃培养24 h，观察结果。

阳性对照细菌生长，呈均匀浑浊状，阴性对照管和空白对照管无细菌生长，呈澄清、透明状时，试验成立，观察其他各管情况。

如试管内液体澄清、透明，则无菌生长。

以无菌生长的最低稀释度即为MIC。

1.2.3.2 最小杀菌浓度的测定观察药物MIC以上未见细菌生长的各管培养物，分别各取0.1 mL移种至不含药的营养琼脂平皿上，轻轻推开药液，置37℃培养过夜，观察有无细菌生长。

按一般规定，平皿培养基中，计数少于5个菌落者则作为该药的MBC。

1.2.3.3 结果判定参考刘忠义等（1996）介绍的判断标准，MIC＜7.80 mg/mL，为高度敏感，7.80 mg/mL＜MIC＜250.00 mg/mL，为中度敏感，MIC＞250.00 mg/mL，为不敏感。

1.2.4 中药提取物对鸭疫里默氏杆菌体外联合抑菌试验通过以上单味中药材的体外抑菌活性结果，选择其中抑菌活性较强的中药，采用棋盘法进行体外联合抑菌试验，根据测得各药物单独对鸭疫里默氏杆菌的MIC，分别以其中2味药MIC的2和1倍，以及1/2、1/4和1/8倍分别进行联合，结果以联合抑菌指数（fractiona inhibitory concentration index，FICI）来判断两者的联合效应。

FICI为联合用药时，各药的MIC值分别除以单独用药时MIC值的商的和：FICI＝甲药联合时的MIC/甲药单测时MIC＋乙药联合时的 MIC/乙药单测时的 MIC。

FICI指数≤0.5，为协同作用；0.5＜FICI指数≤1，为相加（累加）作用；1＜FICI指数≤2，为无关作用；FICI指数＞2，为颉颃作用（洪秀华，2002）。

2 结果与分析2.1 20 味中药提取物对鸭疫里默氏杆菌的体外抑菌活性研究 20味中药提取物抗鸭疫里默氏杆菌的体外抑菌结果见表1。

由表1可知，杜仲等中药提取物对鸭疫里默氏杆菌的MIC范围为15.60～250.00 mg/mL，其中大黄、白头翁、板蓝根、佛手、杜仲、秦皮和大青叶抑菌效果好，MIC值均为15.60 mg/mL，栀子、何首乌、荆芥、黄柏、连翘、青蒿、苦参和夏枯草抑菌效果较好，MIC值均为31.25mg/mL，而金银花、姜黄、黄芩、黄芪和紫草的抑菌效果差，MIC值在125.00 mg/mL以上。

杜仲等中药提取物对鸭疫里默氏杆菌的MBC值范围为31.25～250.00 mg/mL，其中板蓝根、佛手、何首乌、杜仲、秦皮和大青叶杀菌效果好，MBC值均为31.25 mg/mL，大黄、栀子、白头翁、黄柏、连翘、青蒿、苦参和夏枯草杀菌效果次之，均为62.50 mg/mL，荆芥、金银花、姜黄、黄芩、黄芪和紫草杀菌效果差，均为250.00 mg/mL。

表1 20味中药提取物对鸭疫里默氏杆菌的体外抑菌活性结果（mg/mL）中药提取物 MIC MBC 中药提取物 MIC MBC大黄 15.60 62.50 黄柏 31.25 62.50板蓝根 15.60 31.25 黄芩 125.00 250.00佛手 15.60 31.25 黄芪 125.00 250.00栀子31.25 62.50 连翘 31.25 62.50白头翁 15.60 62.50 秦皮 15.60 31.25何首乌31.25 31.25 紫草 250.00 250.00杜仲 15.60 31.25 青蒿 31.25 62.50荆芥 31.25 250.00 大青叶 15.60 31.25金银花 125.00 250.00 苦参 31.25 62.50姜黄250.00 250.00 夏枯草 31.25 62.502.2 杜仲等4味中药提取物对鸭疫里默氏杆菌的体外联合抑菌活性研究通过以上的单味药体外抑菌结果分析，因此选择杜仲、大黄、白头翁和秦皮进行体外联合抑菌试验，结果见表2。

由表2可知，杜仲提取物（A）与秦皮提取物（B）对鸭疫里默氏杆菌的FICI值为0.75，秦皮提取物（B）与大黄提取物（D）对鸭疫里默氏杆菌的FICI值为1，杜仲提取物（A）与白头翁提取物（C）、秦皮提取物（B）与白头翁提取物（C）对鸭疫里默氏杆菌的FICI值均为2，杜仲提取物（A）与大黄提取物（D）、白头翁提取物（C）与大黄提取物（D）对鸭疫里默氏杆菌的FICI值均为2.5。