葡聚糖凝胶层析实验报告
葡聚糖凝胶层析法
实验一蛋白质分子量的测定——凝胶层析法；一、实验目的；1.掌握凝胶层析的基本原理；2.学习利用凝胶层析法测定蛋白质相对分子质量的实；二、实验原理；凝胶层析法也称分子筛层析法，是利用具有一定孔径大；将凝胶装在柱后，柱床体积称为“总体积”，以Vt表；式中Ve为洗脱体积，自加入样品时算起，到组分最大；上式中Ve为实际测得的洗脱体积；Vo可用不被凝胶；如果假定蛋白质实验一蛋白质分子量的测定——凝胶层析法一、实验目的1.掌握凝胶层析的基本原理。
2.学习利用凝胶层析法测定蛋白质相对分子质量的实验技能。
二、实验原理凝胶层析法也称分子筛层析法，是利用具有一定孔径大小的多孔凝胶作固定相的层析技术。
当混合物随流动相经过凝胶层析柱时，其中各组分按其分子大小不同而被分离的技术。
该法设备简单、操作方便、重复性好、样品回收率高。
凝胶是一种不带电的具有三维空间的多孔网状结构、呈珠状颗粒的物质，每个颗粒的细微结构及筛孔的直径均匀一致，像筛子，小的分子可以进入凝胶网孔，而大的分子则排阻于颗粒之外。
当含有分子大小不一的蛋白质混合物样品加到用此类凝胶颗粒装填而成的层析柱上时，这些物质即随洗脱液的流动而发生移动。
大分子物质沿凝胶颗粒间隙随洗脱液移动，流程短，移动速率快，先被洗出层析柱；而小分子物质可通过凝胶网孔进入颗粒内部，然后再扩散出来，故流程长，移动速度慢，最后被洗出层析柱，从而使样品中不同大小的分子彼此获得分离。
若分子大小介于上述完全排阻或完全渗入凝胶的物质，则居二者之间从柱中流出。
总之，各种不同相对分子质量的蛋白质分子，最终由于它们被排阻和扩散的程度不同，在凝胶柱中所经过的路程和时间也不同，从而彼此可以分离开来。
将凝胶装在柱后，柱床体积称为“总体积”，以Vt表示。
实质上Vt是由V i与Vg三部分组成，Vo称为“孔隙体积”或“外水体积”，即存在于柱床内凝胶颗粒外面空隙之间的水相体积，相应于一般层析法中柱内流动相的体积；Vi 为内体积，即凝胶颗粒内部所含水相的体积。
葡聚糖层析实验报告
一、实验目的1. 掌握葡聚糖凝胶层析的原理及其在生物大分子分离中的应用。
2. 学习并掌握葡聚糖凝胶层析的基本操作技术。
3. 通过实验，验证葡聚糖凝胶层析对分子量不同的物质具有分离效果。
二、实验原理凝胶层析，又称分子排阻层析或凝胶过滤，是一种基于被分离物质分子量差异的层析分离技术。
该技术利用凝胶颗粒的多孔网状结构，通过分子量差异使不同组分在层析柱中以不同的速度移动，从而达到分离的目的。
葡聚糖凝胶是一种由直链的葡聚糖分子和交联剂3-氯1，2-环氧丙烷交联而成的高分子化合物。
通过调节葡聚糖和交联剂的比例，可以控制凝胶颗粒的孔径大小。
分子量大于允许进入凝胶网孔范围的物质被凝胶排阻，不能进入凝胶颗粒内部，阻滞作用小，随溶剂流动快速流出层析柱；而分子量小的物质可进入凝胶颗粒的网孔内，阻滞作用大，流程慢，后流出层析柱。
三、实验材料与仪器1. 实验材料：- 葡聚糖凝胶（Sephadex）- 标准蛋白质溶液（如牛血清白蛋白、鸡蛋清蛋白等）- 溶剂（如磷酸盐缓冲溶液）- 离心机- 层析柱- 漏斗- 吸管2. 实验仪器：- 电子天平- 移液器- 显微镜四、实验步骤1. 准备层析柱：将葡聚糖凝胶倒入层析柱中，用溶剂冲洗，直至凝胶床均匀。
2. 加载样品：将标准蛋白质溶液加入层析柱中，使其在凝胶床表面形成一薄层。
3. 洗脱：用溶剂缓慢冲洗层析柱，收集不同时间流出的洗脱液。
4. 分析洗脱液：将收集到的洗脱液进行比色分析或电泳分析，确定各组分的位置。
五、实验结果与分析1. 实验结果：- 洗脱液在比色分析或电泳分析中，可观察到不同分子量的蛋白质分别在凝胶层析柱中的位置。
- 小分子量的蛋白质先流出层析柱，大分子量的蛋白质后流出。
2. 结果分析：- 通过实验，验证了葡聚糖凝胶层析对分子量不同的物质具有分离效果。
- 实验结果表明，小分子量的蛋白质在凝胶层析柱中的流动速度较快，大分子量的蛋白质流动速度较慢。
六、实验结论1. 葡聚糖凝胶层析是一种基于分子量差异的层析分离技术，在生物大分子分离中具有广泛的应用。
凝胶层析_实验报告
一、实验目的1. 了解凝胶层析的原理和操作方法。
2. 掌握凝胶层析分离混合物中不同组分的基本技能。
3. 分析实验结果，验证实验原理。
二、实验原理凝胶层析是一种基于分子筛效应的分离技术。
该技术利用凝胶的孔隙结构，使不同分子量的物质在凝胶柱中受到不同的阻滞作用，从而实现分离。
凝胶是一种具有多孔、网状结构的分子筛，分子量不同的物质通过凝胶柱的速度也不同。
在凝胶层析实验中，样品被注入凝胶柱，随着洗脱液的流动，不同分子量的物质会以不同的速度通过凝胶柱，从而实现分离。
三、实验材料与仪器1. 实验材料：混合样品、葡聚糖凝胶、洗脱液（如蒸馏水、乙醇等）。
2. 实验仪器：凝胶层析柱、注射器、恒流泵、收集器、滤纸、烧杯等。
四、实验步骤1. 准备凝胶层析柱：将葡聚糖凝胶倒入层析柱，轻轻敲打柱底，使凝胶均匀分布。
2. 洗脱液平衡：将凝胶层析柱放入盛有洗脱液的烧杯中，使凝胶充分浸泡。
3. 样品制备：将混合样品与洗脱液按一定比例混合，制成样品溶液。
4. 注射样品：将样品溶液注入凝胶层析柱。
5. 收集分离组分：随着洗脱液的流动，不同分子量的物质会以不同的速度通过凝胶柱。
将收集器放置在凝胶柱下方，收集分离组分。
6. 分析实验结果：观察收集到的组分，分析实验结果。
五、实验结果与分析1. 分离效果：通过凝胶层析实验，成功分离出混合样品中的不同组分。
2. 分组情况：根据收集到的组分，分析其分子量大小，确定分离效果。
3. 实验原理验证：实验结果表明，凝胶层析能够有效分离混合物中的不同组分，验证了实验原理。
六、实验讨论1. 凝胶层析的原理：凝胶层析的原理是基于分子筛效应，通过凝胶的孔隙结构，使不同分子量的物质在凝胶柱中受到不同的阻滞作用，从而实现分离。
2. 影响分离效果的因素：实验过程中，洗脱液的种类、流速、凝胶的孔径等因素会影响分离效果。
在实验中，应严格控制这些因素，以确保分离效果。
3. 实验结果分析：通过分析实验结果，可以了解不同组分在混合样品中的含量和分子量大小，为后续研究提供数据支持。
分子凝胶层析实验报告
一、实验目的1. 理解分子凝胶层析的基本原理及其在生物大分子分离中的应用。
2. 掌握分子凝胶层析的操作步骤和注意事项。
3. 通过实验，验证分子凝胶层析对蛋白质分子量的分离效果。
二、实验原理分子凝胶层析，又称凝胶过滤层析或分子筛层析，是一种基于分子量差异进行分离的技术。
其基本原理是利用具有不同孔径的凝胶颗粒作为固定相，根据分子大小和凝胶孔径的选择性，使不同分子量的物质在层析过程中受到不同的阻滞作用，从而实现分离。
在本实验中，我们使用的凝胶为葡聚糖凝胶（Sephadex），它是由直链的葡聚糖分子和交联剂3-氯1，2-环氧丙烷交联而成的具有多孔网状结构的高分子化合物。
通过调节葡聚糖和交联剂的比例，可以控制凝胶颗粒的孔径大小，从而实现对不同分子量物质的分离。
三、实验材料与仪器1. 实验材料：- 蛋白质混合样品- 标准蛋白质混合样品- 葡聚糖凝胶（Sephadex G-75）- 洗脱液（磷酸盐缓冲液，pH 7.4）- 标准分子量蛋白质（如牛血清白蛋白、卵清蛋白等）2. 实验仪器：- 凝胶层析柱- 洗脱液泵- 检测器（如紫外检测器）- 紫外分光光度计- 电子天平- 移液器四、实验步骤1. 准备凝胶层析柱，将葡聚糖凝胶（Sephadex G-75）用洗脱液充分浸泡，使其充分膨胀。
2. 将浸泡好的凝胶颗粒装入层析柱中，注意不要产生气泡。
3. 用洗脱液平衡层析柱，直至流出液清澈。
4. 将蛋白质混合样品和标准蛋白质混合样品分别加入层析柱中，用洗脱液进行洗脱。
5. 收集洗脱液，并使用紫外分光光度计检测蛋白质浓度。
6. 分析洗脱曲线，确定蛋白质的分子量。
五、实验结果与分析1. 通过实验，我们得到了蛋白质混合样品和标准蛋白质混合样品的洗脱曲线。
2. 从洗脱曲线上可以看出，不同分子量的蛋白质在层析过程中受到的阻滞作用不同，从而实现了分离。
3. 通过比较标准蛋白质的分子量和洗脱曲线上的保留时间，我们可以确定蛋白质混合样品中各蛋白质的分子量。
葡聚糖凝胶层析
凝胶类型:葡聚糖凝胶(Sephadex)和琼 脂糖凝胶(Sepharose). 葡聚糖凝胶:直链的葡聚糖分子和交联剂 3—氯1,2—环氧丙烷交联而成.
葡聚糖凝胶G—25作为固定相载体,来分离 蓝色葡聚糖—2000和溴酚蓝.蓝色葡聚 糖—2000分子量接近2×106, 而溴酚蓝分 子量为670,二者分子量相差较大,前者完 全排阻,而后者则可完全进入凝胶颗粒网 孔内,二者通过层析柱的时间不同而分开.
3.加样品:打开螺旋夹使柱面上的洗脱液流出, 直至床面与液面刚好平齐为止,关闭下端出口. 取溴酚蓝及蓝色葡聚糖—2000混合液0.3毫升,小 心地加于凝胶表面上,切勿搅动层析柱床表面. 打开下端出口,使样品溶液进入凝胶内,并开始 收集流出液.当样品溶液恰好流至与凝胶表面平 齐时,关闭下端出口.用少量洗脱液清洗层析柱 加样区,共洗涤三次,每次清洗液应完全进入凝 胶柱内后,再进行下一次洗涤.最后在凝胶表面 上加入洗脱液,保持高度为3—4cm.
葡聚糖凝胶层析
实验目的
【实验目的】 实验目的】 1.掌握葡聚糖凝胶的特性及凝胶层析的原理.
2.学习葡聚糖凝胶层析的基本操作技术.
葡聚糖凝胶层析原理
凝胶过滤层析也称分子筛层析,排阻层析. 是利用具有网状结构的凝胶的分子筛作用, 根据被分离物质的分子大小不同来进行分 离
凝胶层析: 凝胶层析:
实验材料
1.实验器材:层析柱(1×20cm)附有一小 实验器材: 实验器材 段乳胶管及螺旋夹;洗脱液瓶(带下口的 三角瓶,250m1);试管及试管架;量筒 10m1;721型分光光度计 2.实验试剂 实验试剂
(1)Tris—醋酸缓冲液(pH7.0): (2)溴酚蓝与葡聚糖—2000 混合样品. (3)葡聚糖凝胶G-25 (Sephadex-G-25)
实验三葡聚糖凝胶柱层析纯化蛋白质
层析柱的重要参数 ：
Vt(total volume) Vo(outer volume) Vi(inner volume) Ve(elution volume) Vg(gel volume) Vt=Vo+Vi+Vg , Ve=Vo+Kd×Vi。
组分的洗脱体积（Ve）：①当样品的 体积很少时（与洗脱体积比较可以忽 略不计） ，在洗脱图中，从加样到峰 顶位置所用洗脱液体积为Ve。 ②当 样品体积与洗脱体积比较不能忽略时， 洗脱体积计算可以从样品体积的一半 到峰顶位置。③当样品体积很大时， 洗脱体积计算可以从应用样品开始到 洗脱峰升高的弯曲点（或半高处）。
常用0.02％叠氮钠或20%乙醇溶液作防腐剂。 1 厘 米 光 程 时 ， 254nm 处 透 光 率 为 60 ％ ，
280nm处透光率为100％。
3、试剂、器材：
3.1、层析介质 Sephadex G-50； 3.2、样品（包含三个组分）： ①蓝色葡聚糖2000， ②溶菌酶，③ Trp
上样量：0.4ml/柱。 3.3、洗脱液：0.15M氯化钠，即生理盐 水。
、洗脱液流速的影响：
洗脱液的流速与样品分离的分辨率相关。 流速过快，会使色谱峰变形， 流速过慢，样品扩散倾向加剧。 一般流速控制在30－200ml/h。
今天洗脱流速控制在1ml/min。
、洗脱液的离子强度和pH值的影响：
纯化蛋白时,通常选用离子强度＞0.02的盐 溶液作洗脱剂，以增加样品的溶解度和 消除凝胶的吸附作用；
Kd是分配系数：用于衡量两个物质的分离分辩率， 是凝胶层析的一个特征常数，只与被分离物质 分子大小和凝胶孔径大小有关，与层析柱的长 短粗细无关。
Kd值的计算：Kd=(Ve-Vo)/Vi
实验一葡聚糖凝胶柱层析分离核黄素和牛血清蛋白
☻葡聚糖凝胶（Sephadex） ☻琼脂糖凝胶（Sepharose）
☻聚丙稀酰胺凝胶（Polyacrylamide）
G型（G-X: X数字代表 交联度与吸水量） LH型
Sephadex的常见规格（分级范围）
型号 分离范围 (G-X) (分子量Da)
G10 G15 G25 G-50 G-75 G100 G150 G200 <700 <1,500
（四）洗脱、收集与检测
1、流速1滴/5-6秒不变，2ml/管收集 流出液，收集至流出液为无色。 2、用分光光度计，在280nm波长处， 以PBS调零，测定无色管吸光度；在 在450nm波长处，以PBS调零，测定有 色管吸光度。（每管收集液稀释1倍 后测定） 3、以管号为横坐标，吸光度为纵坐 标，绘制洗脱曲线。
（三）上样
1. 先将柱的出口打开，让PBS逐渐流出，待 液面与凝胶床面平齐时，关闭出口（注意： 不可使凝胶柱表面干涸）。 2. 用刻度吸管取样品混合液0.5ml，沿管壁小 心加于柱床表面，打开层析柱出口端，待 样品完全渗入胶内，开始收集流出液，同 时小心加洗脱液（PBS），
控制流速：1滴/5-6秒。（注意柱床上要不 断加PBS，保持1cm高水层）
六、思考题
1、凝胶层析的原理是什么？ 2、用凝胶柱层析分离不同蛋白质，怎样才能
得到较好的分离效果？
实验一 葡聚糖凝胶柱层析法 分离核黄素和牛血清白蛋白
夏芳
2011-8-30
一、实验目的
了解：
层析技术的基本原理。
熟悉：
凝胶层析的操作过程。
掌握：
组分的洗脱与鉴定。
层析技术的基本原理
利用混合物中各组分的物理、化学性质 的差别，使各组分以不同程度分布在两相(固 定相、流动相)中达到分离。
葡聚糖凝胶层析
葡聚糖凝胶层析一、实验目的1、学习凝胶(Gel)层析法的基本原理；2、掌握葡聚糖凝胶（Sephadex）柱层析的操作技术。
二、实验原理凝胶层析又称排阻层析，凝胶过滤，渗透层析或分子筛层析等。
对于某种型号的凝胶，一些大分子不能进入凝胶颗粒内部而完全被排阻在外，只能沿着颗粒间的缝隙流出柱外（所用洗脱液的体积为外水体积）；而一些小分子不被排阻，可自由扩散，渗透进入凝胶内部的筛孔，尔后又被流出的洗脱液带走（所用洗脱液的体积为内水体积）。
分子越小，进入凝胶内部越深，所走的路程越多，故小分子最后流出柱外，而大分子先从柱中流出。
一些中等大小的分子介于大分子与小分子之间，只能进入一部分凝胶较大的孔隙，亦即部分排阻，因此这些分子从柱中流出的顺序也介于大、小分子之间。
这样样品经过凝胶层析后，分子便按照从大到小的顺序依次流出，达到分离的目的。
三、仪器、材料和试剂1、仪器：内直径为1cm，外直径为1.5cm的层析柱，恒流泵、收集器、酶标仪、试管、烧杯、移液枪。
2、材料与试剂：交联葡聚糖、双蒸水、蛋白溶液样品。
四、实验步骤1、装柱将交联葡聚糖溶液用玻璃棒引流导入层析柱中，要注意，不能让柱子中有气泡，可以边装边用玻璃棒搅拌。
2、上样装好柱后，用移液枪将柱子中上面的水吸出，再用移液枪将1ml 的蛋白溶液加入层析柱中。
3、洗脱和收集打开恒流泵和收集器装置，待样品刚好渗入到凝胶中时，再向层析柱中加入3-4ml的蒸馏水，此时盖上层析柱的上盖，将上盖的细管插入到盛有双蒸水的烧杯中，调节恒流泵的速度和收集器时间，开始洗脱收集。
4、样品的检测收集一段时间后，将样品取出，依次编号，依次加入200μl到酶标版上，选用一个孔加入双蒸水作为对照，用酶标仪在280nm下测检测。
五、实验结果及分析1、实验结果：2、蛋白质样品洗脱曲线：收集样品时设置的时间为3min每管，收集得到每管的体积为1.4ml，则计算：流速=每管体积/每管时间=1.4/3=0.47ml/min。
葡聚糖凝胶实验报告
一、实验目的1. 掌握葡聚糖凝胶的特性及凝胶层析的原理。
2. 学习葡聚糖凝胶层析的基本操作技术。
3. 了解分子量对分离效果的影响。
二、实验原理凝胶层析，又称分子排阻层析或凝胶过滤，是一种以被分离物质的分子量差异为基础的层析分离技术。
该技术为纯化蛋白质等生物大分子提供了一种非常温和的分离方法。
层析的固定相载体是凝胶颗粒，目前应用较广的是具有各种孔径范围的葡聚糖凝胶（Sephadex）和琼脂糖凝胶（Sepharose）。
葡聚糖凝胶是由直链的葡聚糖分子和交联剂3-氯1，2-环氧丙烷交联而成的具有多孔网状结构的高分子化合物。
凝胶颗粒中网孔的大小可通过调节葡聚糖和交联剂的比例来控制，交联度越大，网孔结构越紧密；交联度越小，网孔结构就越疏松，网孔的大小决定了被分离物质能够自由出入凝胶内部的分子量范围。
可分离的分子量范围从几百到几十万不等。
在葡聚糖凝胶层析中，待分离物质通过葡聚糖凝胶层析柱，各个组分由于分子量不相同，在凝胶柱上受到的阻滞作用不同，而在层析柱中以不同的速度移动。
分子量大于允许进入凝胶网孔范围的物质完全被凝胶排阻，不能进入凝胶颗粒内部，阻滞作用小，随着溶剂在凝胶颗粒之间流动，因此流程短，先流出层析柱；分子量小的物质可完全进入凝胶颗粒的网孔内，阻滞作用大，流程长，后流出层析柱。
三、实验材料与仪器1. 实验材料：- 葡聚糖凝胶G15- 待分离样品（蛋白质溶液）- 缓冲液（磷酸盐缓冲液，pH 7.0）- 甲醇- 水浴锅- 凝胶层析柱- 移液器- 离心机- 超滤器2. 实验仪器：- 电子天平- 紫外分光光度计- pH计- 显微镜四、实验步骤1. 准备葡聚糖凝胶：将葡聚糖凝胶G15浸泡于蒸馏水中至少24小时，并不断搅拌以保证凝胶溶胀，或者用热水浸泡（不建议煮沸）至少1小时直至充分溶胀，凝胶体积不再变化。
2. 准备缓冲液：配制磷酸盐缓冲液（pH 7.0），用超滤器过滤，以去除其中的大分子物质。
3. 装柱：将凝胶层析柱清洗干净，用缓冲液润湿并保持一小段液位，确保底端无气泡。
葡聚糖凝胶层析实验报告
葡聚糖凝胶层析实验报告葡聚糖凝胶层析实验报告⼀、实验⽬的1、学习凝胶(Gel)层析法的基本原理；2、掌握葡聚糖凝胶（Sephadex）柱层析的操作技术。
⼆、实验原理凝胶层析⼜称排阻层析，凝胶过滤，渗透层析或分⼦筛层析等。
对于某种型号的凝胶，⼀些⼤分⼦不能进⼊凝胶颗粒内部⽽完全被排阻在外，只能沿着颗粒间的缝隙流出柱外（所⽤洗脱液的体积为外⽔体积）；⽽⼀些⼩分⼦不被排阻，可⾃由扩散，渗透进⼊凝胶内部的筛孔，尔后⼜被流出的洗脱液带⾛（所⽤洗脱液的体积为内⽔体积）。
分⼦越⼩，进⼊凝胶内部越深，所⾛的路程越多，故⼩分⼦最后流出柱外，⽽⼤分⼦先从柱中流出。
⼀些中等⼤⼩的分⼦介于⼤分⼦与⼩分⼦之间，只能进⼊⼀部分凝胶较⼤的孔隙，亦即部分排阻，因此这些分⼦从柱中流出的顺序也介于⼤、⼩分⼦之间。
这样样品经过凝胶层析后，分⼦便按照从⼤到⼩的顺序依次流出，达到分离的⽬的。
三、仪器、材料和试剂1、仪器：内直径为1cm，外直径为的层析柱，恒流泵、收集器、酶标仪、试管、烧杯、移液枪。
2、材料与试剂：交联葡聚糖、双蒸⽔、蛋⽩溶液样品。
四、实验步骤1、装柱将交联葡聚糖溶液⽤玻璃棒引流导⼊层析柱中，要注意，不能让柱⼦中有⽓泡，可以边装边⽤玻璃棒搅拌。
2、上样装好柱后，⽤移液枪将柱⼦中上⾯的⽔吸出，再⽤移液枪将1ml 的蛋⽩溶液加⼊层析柱中。
3、洗脱和收集打开恒流泵和收集器装置，待样品刚好渗⼊到凝胶中时，再向层析柱中加⼊3-4ml的蒸馏⽔，此时盖上层析柱的上盖，将上盖的细管插⼊到盛有双蒸⽔的烧杯中，调节恒流泵的速度和收集器时间，开始洗脱收集。
4、样品的检测收集⼀段时间后，将样品取出，依次编号，依次加⼊200µl到酶标版上，选⽤⼀个孔加⼊双蒸⽔作为对照，⽤酶标仪在280nm 下测检测。
五、实验结果及分析1、实验结果：2、蛋⽩质样品洗脱曲线：收集样品时设置的时间为3min每管，收集得到每管的体积为，则计算：流速=每管体积/每管时间=3=min。
凝胶层析实验报告
一、实验目的1. 理解凝胶层析的原理及其应用。
2. 掌握凝胶层析的基本操作技术。
3. 通过实验，分离并鉴定不同分子量的蛋白质。
二、实验原理凝胶层析，又称分子筛层析或凝胶过滤，是一种利用凝胶的分子筛效应进行分离纯化的技术。
凝胶具有多孔的网状结构，其孔径大小可通过交联度来调节。
当混合物通过凝胶层析柱时，不同分子量的物质在凝胶柱中受到的阻滞作用不同，从而实现分离。
分子量较大的物质无法进入凝胶颗粒的内部，只能沿着颗粒间的缝隙流出，因此流出柱子的速度较快；而分子量较小的物质可以进入凝胶颗粒的内部，受到的阻滞作用较大，流出速度较慢。
通过调节凝胶的孔径和洗脱液的流速，可以实现对混合物中不同分子量物质的分离。
三、实验材料1. 凝胶层析柱（1.5cm×30cm）2. 葡聚糖凝胶（Sephadex G-75）3. 蛋白质混合物（含有已知分子量的蛋白质和未知分子量的蛋白质）4. 标准蛋白质分子量对照品5. 洗脱液（0.1mol/L Tris-HCl缓冲液，pH 7.4）6. 紫外分光光度计7. 移液器8. 试管9. 烧杯10. 滤纸四、实验步骤1. 准备凝胶层析柱，将葡聚糖凝胶用洗脱液浸泡过夜，使其充分膨胀。
2. 将浸泡好的凝胶层析柱垂直固定在支架上，用移液器将凝胶层析柱中的空气排尽。
3. 用移液器将蛋白质混合物加入凝胶层析柱中，使其刚好流过凝胶层析柱的顶部。
4. 将洗脱液缓慢加入凝胶层析柱中，使洗脱液流速保持恒定（约0.5ml/min）。
5. 收集洗脱液，每5ml收集一次，收集至蛋白质混合物完全流出。
6. 使用紫外分光光度计检测洗脱液中的蛋白质浓度，绘制蛋白质洗脱曲线。
7. 将收集到的洗脱液分别进行SDS-PAGE电泳，鉴定不同分子量的蛋白质。
五、实验结果与分析1. 蛋白质洗脱曲线通过蛋白质洗脱曲线，可以观察到不同分子量的蛋白质在凝胶层析过程中的洗脱时间。
分子量较大的蛋白质先流出柱子，而分子量较小的蛋白质后流出。
层析凝胶法实验报告
1. 了解层析凝胶法的原理及其应用。
2. 掌握层析凝胶法的基本操作步骤。
3. 学习利用层析凝胶法分离混合物中的不同组分。
二、实验原理层析凝胶法，又称分子筛层析法，是一种利用凝胶作为固定相，根据分子大小不同进行分离的技术。
凝胶是一种具有多孔结构的物质，其孔径大小可以调节，从而实现对不同分子大小的分离。
在层析过程中，分子量较大的物质无法进入凝胶内部，只能沿凝胶颗粒间的缝隙流出；而分子量较小的物质可以进入凝胶内部，流速较慢，最后流出柱外。
通过这种差异，样品中的不同组分可以得到有效分离。
三、实验材料与仪器1. 实验材料：混合物样品、葡聚糖凝胶、洗脱液、收集瓶等。
2. 实验仪器：层析柱、紫外-可见分光光度计、电子天平等。
四、实验步骤1. 准备凝胶：将葡聚糖凝胶用洗脱液浸泡，使其充分膨胀，然后装入层析柱中。
2. 样品制备：将混合物样品溶解于适量的洗脱液中，调整其浓度为1mg/mL。
3. 上样：将样品溶液缓慢加入层析柱中，使其均匀分布在凝胶表面。
4. 洗脱：用洗脱液冲洗层析柱，收集不同洗脱体积的洗脱液。
5. 分析：使用紫外-可见分光光度计测定不同洗脱体积的洗脱液吸光度，确定各组分的洗脱时间。
6. 收集：将不同洗脱时间的洗脱液收集于不同试管中，进行后续分析。
五、实验结果与分析1. 通过紫外-可见分光光度计测定不同洗脱体积的洗脱液吸光度，绘制洗脱曲线。
2. 根据洗脱曲线，确定各组分的洗脱时间。
3. 对收集的洗脱液进行后续分析，如质谱、核磁共振等，确定各组分的成分。
1. 层析凝胶法是一种有效分离混合物中不同组分的技术。
2. 通过调节凝胶的孔径大小，可以实现不同分子大小的分离。
3. 本实验成功分离了混合物中的不同组分，为后续分析提供了基础。
七、实验讨论1. 层析凝胶法的分离效果受多种因素影响，如凝胶的孔径大小、洗脱液的流速等。
在实际操作中，需要根据样品特性和实验目的选择合适的实验条件。
2. 层析凝胶法适用于分离分子量较大的物质，对于分子量较小的物质，可能需要采用其他分离方法。
生化凝胶层析实验报告
一、实验目的本实验旨在通过凝胶层析技术，对混合物中的不同分子量物质进行分离和纯化。
具体目标包括：1. 掌握凝胶层析的原理和操作步骤。
2. 学习如何根据分子量差异对蛋白质等生物大分子进行分离。
3. 观察和分析实验结果，验证凝胶层析技术的有效性和可行性。
二、实验原理凝胶层析（Gel Filtration）又称分子筛层析，是一种基于分子量差异进行物质分离的方法。
该技术利用凝胶作为固定相，凝胶具有多孔结构，分子量不同的物质在凝胶中的移动速度不同，从而实现分离。
实验中常用的凝胶材料包括葡聚糖凝胶（Sephadex）和琼脂糖凝胶（Sepharose）。
凝胶颗粒的大小可通过调节葡聚糖和交联剂的比例来控制。
交联度越大，网孔结构越紧密；交联度越小，网孔结构就越疏松。
因此，不同型号的凝胶具有不同的分子量分级范围。
实验过程中，将待分离物质加入凝胶柱中，在溶剂的作用下，各组分因分子量差异在凝胶柱中以不同的速度移动。
分子量大的物质在凝胶柱中的移动速度较慢，先流出柱子；而分子量小的物质则可以进入凝胶颗粒的网孔内，移动速度较快，后流出柱子。
三、实验材料与仪器1. 实验材料：- 待分离的混合物- 葡聚糖凝胶（Sephadex G-100）- 洗脱液（例如磷酸盐缓冲液）- 标准蛋白质溶液（例如牛血清白蛋白、肌红蛋白等）- 紫外分光光度计- 凝胶层析柱- 量筒- 移液器- 离心机2. 实验仪器：- 凝胶层析柱- 紫外分光光度计- 移液器- 量筒- 离心机四、实验步骤1. 准备凝胶柱：将葡聚糖凝胶（Sephadex G-100）用洗脱液充分溶胀，装入凝胶层析柱中。
2. 准备样品：将待分离的混合物用洗脱液稀释，调整蛋白质浓度至适当水平。
3. 加样：将样品加入凝胶柱中，待样品完全进入凝胶柱后，用洗脱液冲洗柱子，直至流出液为无色。
4. 收集洗脱液：用紫外分光光度计检测洗脱液中的蛋白质浓度，收集不同分子量范围的蛋白质组分。
5. 分析结果：将收集到的蛋白质组分进行SDS-PAGE电泳或Western blot分析，观察蛋白质的分子量和纯度。
葡聚糖凝胶柱层析
分离 范围
颗粒 大小 （μm）
<700 <1500 1000~5000
干粉40~120 干粉40~120 干粉100~300
1000~5 000
干粉50~150
1000~5000
干粉20~80
1000~5000
干粉10~40
1500~30000
干粉100~300
1500~30000
干粉50~150
1500~30000
pH 稳定性 工作
2~13 2~13 2~13
干凝胶 溶胀体
积mL/g
2~3 2.5~3.5 4~6
溶胀最少 平衡时间h
室温 沸水
3
1
3
1
6
2
最快 流速 (cm/h)
2~5 2~5 2~5
2~13 4~6
6
2
2~5
2~13 4~6
6
2
2~5
2~13 4~6
6
2
2~5
2~10 9~11
6
2
2~5
2~10 9~11
2、影响凝胶层析分离的因素：
2.1、样品的体积、粘度。 2.2、层析柱 ：（高度，内径，材质）。 2.3、洗脱液的流速：
过慢：扩散； 过快：拖尾。 2.4、洗脱液的离子强度、pH。
2.1、样品的体积、粘度：
分析分离时：Vsample=1-4%Vbed； 制备分离时：Vsample=25-30%Vbed. 分离体积(Vsep): 相邻两组分Ve之差，用于衡量相邻两组分的
同型号的胶，同样的床体积，粒度小的胶对样品的分离度要优 于粒度大的胶，即有较高的分辨率。
4.4、凝胶的防腐、保存：
Sephadex、Sepharose 是多糖类物质，易于长菌。因 此，常在凝胶不用时，加入抑菌剂，使用时再除去。
葡聚糖凝胶层析法
实验一蛋白质分子量的测定——凝胶层析法；一、实验目的；1.掌握凝胶层析的基本原理；2.学习利用凝胶层析法测定蛋白质相对分子质量的实；二、实验原理；凝胶层析法也称分子筛层析法，是利用具有一定孔径大；将凝胶装在柱后，柱床体积称为“总体积”，以Vt表；式中Ve为洗脱体积，自加入样品时算起，到组分最大；上式中Ve为实际测得的洗脱体积；Vo可用不被凝胶；如果假定蛋白质实验一蛋白质分子量的测定——凝胶层析法一、实验目的1.掌握凝胶层析的基本原理。
2.学习利用凝胶层析法测定蛋白质相对分子质量的实验技能。
二、实验原理凝胶层析法也称分子筛层析法，是利用具有一定孔径大小的多孔凝胶作固定相的层析技术。
当混合物随流动相经过凝胶层析柱时，其中各组分按其分子大小不同而被分离的技术。
该法设备简单、操作方便、重复性好、样品回收率高。
凝胶是一种不带电的具有三维空间的多孔网状结构、呈珠状颗粒的物质，每个颗粒的细微结构及筛孔的直径均匀一致，像筛子，小的分子可以进入凝胶网孔，而大的分子则排阻于颗粒之外。
当含有分子大小不一的蛋白质混合物样品加到用此类凝胶颗粒装填而成的层析柱上时，这些物质即随洗脱液的流动而发生移动。
大分子物质沿凝胶颗粒间隙随洗脱液移动，流程短，移动速率快，先被洗出层析柱；而小分子物质可通过凝胶网孔进入颗粒内部，然后再扩散出来，故流程长，移动速度慢，最后被洗出层析柱，从而使样品中不同大小的分子彼此获得分离。
若分子大小介于上述完全排阻或完全渗入凝胶的物质，则居二者之间从柱中流出。
总之，各种不同相对分子质量的蛋白质分子，最终由于它们被排阻和扩散的程度不同，在凝胶柱中所经过的路程和时间也不同，从而彼此可以分离开来。
将凝胶装在柱后，柱床体积称为“总体积”，以Vt表示。
实质上Vt是由V i与Vg三部分组成，Vo称为“孔隙体积”或“外水体积”，即存在于柱床内凝胶颗粒外面空隙之间的水相体积，相应于一般层析法中柱内流动相的体积；Vi 为内体积，即凝胶颗粒内部所含水相的体积。
葡聚糖凝胶层析
葡聚糖凝胶层析一、实验目的1、学习凝胶(Gel)层析法的基本原理；2、掌握葡聚糖凝胶（Sephadex）柱层析的操作技术。
二、实验原理凝胶层析又称排阻层析，凝胶过滤，渗透层析或分子筛层析等。
对于某种型号的凝胶，一些大分子不能进入凝胶颗粒内部而完全被排阻在外，只能沿着颗粒间的缝隙流出柱外（所用洗脱液的体积为外水体积）；而一些小分子不被排阻，可自由扩散，渗透进入凝胶内部的筛孔，尔后又被流出的洗脱液带走（所用洗脱液的体积为内水体积）。
分子越小，进入凝胶内部越深，所走的路程越多，故小分子最后流出柱外，而大分子先从柱中流出。
一些中等大小的分子介于大分子与小分子之间，只能进入一部分凝胶较大的孔隙，亦即部分排阻，因此这些分子从柱中流出的顺序也介于大、小分子之间。
这样样品经过凝胶层析后，分子便按照从大到小的顺序依次流出，达到分离的目的。
三、仪器、材料和试剂1、仪器：内直径为1cm，外直径为 1.5cm的层析柱，恒流泵、收集器、酶标仪、试管、烧杯、移液枪。
2、材料与试剂：交联葡聚糖、双蒸水、蛋白溶液样品。
四、实验步骤1、装柱将交联葡聚糖溶液用玻璃棒引流导入层析柱中，要注意，不能让柱子中有气泡，可以边装边用玻璃棒搅拌。
2、上样装好柱后，用移液枪将柱子中上面的水吸出，再用移液枪将1ml 的蛋白溶液加入层析柱中。
3、洗脱和收集打开恒流泵和收集器装置，待样品刚好渗入到凝胶中时，再向层析柱中加入3-4ml的蒸馏水，此时盖上层析柱的上盖，将上盖的细管插入到盛有双蒸水的烧杯中，调节恒流泵的速度和收集器时间，开始洗脱收集。
4、样品的检测收集一段时间后，将样品取出，依次编号，依次加入200μl到酶标版上，选用一个孔加入双蒸水作为对照，用酶标仪在280nm下测检测。
五、实验结果及分析1、实验结果：序号 2 4 6 8 10 12 14 吸光0．051 0.045 0.051 0.071 0.195 0.127 0.067 度A序号16 18 20 22 24 26 28 吸光0.055 0.039 0.066 0.027 0.053 0.049 0.011度A2、蛋白质样品洗脱曲线：收集样品时设置的时间为3min每管，收集得到每管的体积为1.4ml，则计算：流速=每管体积/每管时间=1.4/3=0.47ml/min。
葡聚糖凝胶层析法分离蛋白质
葡聚糖凝胶层析法分离蛋白质实验简介：凝胶层析法是用一般的柱层析法使分子量不同的溶质通过具有分子筛效应的介质(如葡聚糖凝胶)，从而达到分离提纯的目的。
凝胶层析设备简单，操作简便，条件温和，已成为分离分析蛋白质等生物大分子不可缺少的实验手段。
一、实验目的1、掌握葡聚糖凝胶柱层析法的工作原理及基本操作技术。
2、掌握蛋白质分离纯化的一般操作技术。
二、实验原理凝胶层析是按溶质分子大小不同而进行分离的一种层析技术，当溶质分子大小不同的样品溶液通过凝胶柱时，由于凝胶颗粒内部的网络结构具有分子筛作用，分子大小不同的溶质就会受到不同的阻滞作用。
本实验采用葡聚糖凝胶G-50作为固相载体，它适用于相对分子质量范围在1500～30000之间的多肽与蛋白质的分离。
当蓝色葡聚糖-2000(相对分子质量在200万以上，蓝色)，细胞色素C(相对分子质量12800，红色)和重铬酸钾(相对分子质量294，黄色)的混合物流经层析柱时，三种物质的分级分离明显可见。
蓝色葡聚糖因完全被排阻在凝胶颗粒之外而首先流出，细胞色素C渗入凝胶颗粒内部而其次流出，重铬酸钾则完全渗入凝胶内部最后流出。
通过作洗脱曲线便可清楚地表示出葡聚糖凝胶G-50对这三种物质的分离效果。
样品中的各组分的流出顺序，可用有效分配系数K av表示：K av =(V e-V o)/(V t -V o)上式中，K av指的是分子量不同的溶质在凝胶内部和外部的分配系数，只与被分离物质分子的大小和凝胶颗粒孔径的大小分布有关，而与柱的长短粗细无关。
外水体积V o(outer volume)指基质颗粒之间体积的总和；内水体积V i(inner volume)指基质颗粒内部体积的总和；基质体积(V g)指基质自身所具有的体积。
V。
、V i和V g都是随着床体积和基质性质变化而变化的；洗脱体积V e(elution volume)指从加样到柱出现最大浓度(峰)时所流过的洗脱液的体积(如图1)。
生化葡聚糖实验报告
一、实验目的1. 理解和掌握葡聚糖凝胶层析的基本原理和操作技术。
2. 通过实验验证葡聚糖凝胶作为分子筛在蛋白质分离中的应用效果。
3. 学习如何分析层析结果，了解不同分子量的蛋白质在层析过程中的分离行为。
二、实验原理凝胶层析，又称分子排阻层析或凝胶过滤，是一种基于分子量差异的层析分离技术。
该技术利用具有多孔网状结构的凝胶颗粒作为固定相，通过分子量的不同，使蛋白质等生物大分子在层析过程中受到不同程度的阻滞，从而实现分离。
葡聚糖凝胶是由直链的葡聚糖分子和交联剂3—氯1，2—环氧丙烷交联而成的，其网孔大小可通过调节葡聚糖和交联剂的比例来控制。
交联度越大，网孔结构越紧密；交联度越小，网孔结构越疏松。
因此，不同分子量的蛋白质在层析过程中受到的阻滞作用不同，从而实现分离。
三、实验材料与仪器1. 实验材料：蛋白质混合物、葡聚糖凝胶（Sephadex G-100）、缓冲溶液、标准蛋白质溶液等。
2. 实验仪器：层析柱、紫外分光光度计、移液器、微量注射器、烧杯、试管等。
四、实验步骤1. 准备层析柱：将葡聚糖凝胶加入层析柱中，用缓冲溶液平衡凝胶。
2. 样品制备：将蛋白质混合物用缓冲溶液稀释，配制一定浓度的样品。
3. 层析操作：将样品注入层析柱中，待样品流出后，用缓冲溶液冲洗层析柱，收集各洗脱峰。
4. 蛋白质检测：使用紫外分光光度计检测各洗脱峰的蛋白质含量。
5. 结果分析：比较不同分子量的蛋白质在层析过程中的分离效果。
五、实验结果与分析1. 层析图谱：通过紫外分光光度计检测各洗脱峰的蛋白质含量，绘制层析图谱。
2. 分子量分布：根据层析图谱，分析不同分子量的蛋白质在层析过程中的分离效果。
3. 结果讨论：比较实验结果与理论预期，分析实验中可能存在的问题及改进措施。
六、实验结论1. 葡聚糖凝胶层析是一种有效的蛋白质分离技术，适用于不同分子量的蛋白质分离。
2. 通过调节葡聚糖凝胶的交联度，可以控制层析过程中的分离效果。
3. 本实验成功实现了蛋白质混合物的分离，为后续的蛋白质研究提供了有力支持。
葡聚糖凝胶层析法
实验一蛋白质分子量的测定——凝胶层析法；一、实验目的；1.掌握凝胶层析的基本原理；2.学习利用凝胶层析法测定蛋白质相对分子质量的实；二、实验原理；凝胶层析法也称分子筛层析法，是利用具有一定孔径大；将凝胶装在柱后，柱床体积称为“总体积”，以Vt表；式中Ve为洗脱体积，自加入样品时算起，到组分最大；上式中Ve为实际测得的洗脱体积；Vo可用不被凝胶；如果假定蛋白质实验一蛋白质分子量的测定——凝胶层析法一、实验目的1.掌握凝胶层析的基本原理。
2.学习利用凝胶层析法测定蛋白质相对分子质量的实验技能。
二、实验原理凝胶层析法也称分子筛层析法，是利用具有一定孔径大小的多孔凝胶作固定相的层析技术。
当混合物随流动相经过凝胶层析柱时，其中各组分按其分子大小不同而被分离的技术。
该法设备简单、操作方便、重复性好、样品回收率高。
凝胶是一种不带电的具有三维空间的多孔网状结构、呈珠状颗粒的物质，每个颗粒的细微结构及筛孔的直径均匀一致，像筛子，小的分子可以进入凝胶网孔，而大的分子则排阻于颗粒之外。
当含有分子大小不一的蛋白质混合物样品加到用此类凝胶颗粒装填而成的层析柱上时，这些物质即随洗脱液的流动而发生移动。
大分子物质沿凝胶颗粒间隙随洗脱液移动，流程短，移动速率快，先被洗出层析柱；而小分子物质可通过凝胶网孔进入颗粒内部，然后再扩散出来，故流程长，移动速度慢，最后被洗出层析柱，从而使样品中不同大小的分子彼此获得分离。
若分子大小介于上述完全排阻或完全渗入凝胶的物质，则居二者之间从柱中流出。
总之，各种不同相对分子质量的蛋白质分子，最终由于它们被排阻和扩散的程度不同，在凝胶柱中所经过的路程和时间也不同，从而彼此可以分离开来。
将凝胶装在柱后，柱床体积称为“总体积”，以Vt表示。
实质上Vt是由V i与Vg三部分组成，Vo称为“孔隙体积”或“外水体积”，即存在于柱床内凝胶颗粒外面空隙之间的水相体积，相应于一般层析法中柱内流动相的体积；Vi 为内体积，即凝胶颗粒内部所含水相的体积。
实验五葡聚糖凝胶柱层析分离纯化蛋白质
物理 化学 性质
固定相
流动相
层 析
固定相(Stationary phase ) ：是色谱的基质， 可以是固体物质（如吸附剂、凝胶、离子 交换剂等），也可以是液体物质（如固定 在硅胶或纤维素上的溶液），这些物质能 与待分离的化合物进行可逆的吸附、溶解、 交换等作用。
☺琼脂糖凝胶做成珠状后不再脱水干燥，否 则不能再溶胀恢复原有形状，因此商品大 都以含水状态供应，并应在湿态保存。
☺琼脂糖凝胶是商品名因生产厂家不同而异。 （具体名称和型号见教材P18）
琼脂糖凝胶特点
室温下其稳定性胶葡聚糖凝胶和聚丙烯酰 胺凝胶，对样品的吸附性很小。 洗脱速度较快 排阻极限大，分离范围广，适合分离大分 子物质。
柱层析（column chromatography） 将固定相装在层析柱中，使样品 朝着一个方向移动，通过各组分随 流动相流动而得到分离的方法。
层析的分类
三、按层析的分离机制分类
1. 吸附层析 2. 分配层析 3. 离子交换层析 4. 亲和层析 5. 凝胶层析
凝胶层析 (分子筛过滤、排阻层析)
得到较好的分离效果？
Thank You!
葡聚糖凝胶柱层析法分离蛋白质
生物化学与分子生物学教研室
教学目标:
了解：
1. 层析技术的基本原理。 2. 有效分配系数Kav的计算。
理解：
葡聚糖凝胶的选择和准备。
掌握：
1. 凝胶层析的原理和操作方法。 2. 有效分配系数Kav的意义。
教学重点：
凝胶层析的原理和实验步骤。
教学难点： 教学对象：
小 结
凝胶层析的原理：分子筛效应 凝胶层析有效分配系数（Kav）：被分 离的化合物被凝胶排阻的程度。 层析实验操作过程中的注意事项。
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葡聚糖凝胶层析实验报告
一、实验目的
1、学习凝胶(Gel)层析法的基本原理；
2、掌握葡聚糖凝胶（Sephadex）柱层析的操作技术。
二、实验原理
凝胶层析又称排阻层析，凝胶过滤，渗透层析或分子筛层析等。
对于某种型号的凝胶，一些大分子不能进入凝胶颗粒内部而完全被排
阻在外，只能沿着颗粒间的缝隙流出柱外（所用洗脱液的体积为外水
体积）；而一些小分子不被排阻，可自由扩散，渗透进入凝胶内部的
筛孔，尔后又被流出的洗脱液带走（所用洗脱液的体积为内水体积）。
分子越小，进入凝胶内部越深，所走的路程越多，故小分子最后流出
柱外，而大分子先从柱中流出。
一些中等大小的分子介于大分子与小
分子之间，只能进入一部分凝胶较大的孔隙，亦即部分排阻，因此这
些分子从柱中流出的顺序也介于大、小分子之间。
这样样品经过凝胶
层析后，分子便按照从大到小的顺序依次流出，达到分离的目的。
三、仪器、材料和试剂
1、仪器：内直径为1cm，外直径为1.5cm的层析柱，恒流泵、收集器、酶标仪、试管、烧杯、移液枪。
2、材料与试剂：交联葡聚糖、双蒸水、蛋白溶液样品。
四、实验步骤
1、装柱
将交联葡聚糖溶液用玻璃棒引流导入层析柱中，要注意，不能让
柱子中有气泡，可以边装边用玻璃棒搅拌。
2、上样
装好柱后，用移液枪将柱子中上面的水吸出，再用移液枪将1ml 的蛋白溶液加入层析柱中。
3、洗脱和收集
打开恒流泵和收集器装置，待样品刚好渗入到凝胶中时，再向层析柱中加入3-4ml的蒸馏水，此时盖上层析柱的上盖，将上盖的细管插入到盛有双蒸水的烧杯中，调节恒流泵的速度和收集器时间，开始洗脱收集。
4、样品的检测
收集一段时间后，将样品取出，依次编号，依次加入200μl到酶标版上，选用一个孔加入双蒸水作为对照，用酶标仪在280nm下测检测。
五、实验结果及分析
1、实验结果：
序号 2 4 6 8 10 12 14
吸光
0．051 0.045 0.051 0.071 0.195 0.127 0.067 度A
序号16 8
吸光
0.055 0.039 0.066 0.027 0.053 0.049 0.011
度A
2、蛋白质样品洗脱曲线：
收集样品时设置的时间为3min每管，收集得到每管的体积为1.4ml，则计算：
流速=每管体积/每管时间=1.4/3=0.47ml/min。