重组葡萄糖异构酶的固定化研究

5mmol/L，经60℃热处理30min后冷却至25℃，在磁力搅
拌器上，以800r/min转速搅拌，同时把100mL用醋酸溶
解的壳聚糖溶液缓慢流加到发酵液中，室温条件下静置
10min待絮凝颗粒下沉。絮凝效果以酶活回收率来评定，
依照1.6.1节中发酵液酶活力的测定方法测定酶活力，酶
活ol.34, No.09 165
固定化酶制剂主要有两种，一种为固定化酶，另一 种为固定化产酶细胞。由于天然来源的GIase几乎均为胞 内酶，因此产GIase细胞的固定化相对GIase酶的固定化 省去了酶的分离提取成本，同时减少了酶活损失，并且 GIase的作用底物和产物都是小分子单糖，能自由进出细 胞，所以细胞固定化技术是用来制作固定化GIase制剂的 首选方法。
Immobilization of Cells Producing Glucose Isomerases
DENG Hui1,2，CHEN Sheng1,2，CHEN Jian1,2，WU Jing1,2,*
(1. State Key Laboratory of Food Science and Technology, Jiangnan University, Wuxi 214122, China；2. Key Laboratory of Industrial Biotechnology, Ministry of Education, School of Biotechnology, Jiangnan University, Wuxi 214122, China)
度和pH值的戊二醛溶液，在一定温度条件下，低速搅
拌一定时间，经布氏漏斗过滤后，用去离子水浸泡清洗
过滤交联产物2次，把滤饼用挤压机挤压成直径1mm的
颗粒，在35℃的烘箱中鼓风烘至质量恒定，得到交联样
品；如果絮凝物未经戊二醛交联，直接过滤挤压成颗粒
后干燥，则为未交联样品。依照1.6.1节中固定化细胞酶
制剂活力的测定方法测定等质量交联样品和未交联样品
constants and operation stability of immobilized enzyme preparation were determined. The results showed that the optimal immobilization conditions were diatomaceous earth addition of 0.6% and 5 mmol/L Mg2+ in high-density
摘 要：采用壳聚糖絮凝和戊二醛交联的方法，对表达生产Thermobifida fusca葡萄糖异构酶(GIase)的重组大肠杆菌 细胞进行固定化工艺研究，以期获得高性能和低成本的固定化产酶细胞方法。考察影响细胞絮凝和交联的各种因 素，并对固定化酶制剂的理化性质、动力学常数进行测定。结果表明：最佳的固定化条件为在高密度发酵液中添加 0.6%硅藻土和5mmol/L Mg2+，经60℃热处理30min后，在壳聚糖终质量分数0.1‰、pH5.5、充分搅拌条件下絮凝， 酶活回收率达98%；絮凝产物在戊二醛体积分数0.25%、pH6.5、轻微搅拌条件下交联3h，以未交联的样品作参照 (100%)，交联样品的酶活保留率达80%。相对于游离GIase，此条件下制备的固定化GIase的最适温度仍为80℃、最 适pH值从10降低至9；在工业生产应用条件下，固定化GIase的初始酶活力达到356U/g，半衰期为61d，能够满足高 果糖浆工业的生产要求。 关键词：葡萄糖异构酶；重组大肠杆菌细胞；固定化；壳聚糖絮凝；戊二醛交联
The initial enzyme activity 356 U/g, and its half-life reached up to 61 d.
Key words：glucose isomerase；recombinant Escherichia coli cells；immobilization；chitosan flocculation；
1 材料与方法
1.1 材料与试剂 菌株xylA/pT7-7/BL21(DE3)由本实验室保存和
提供；高密度发酵液为本实验室发酵提供(光密度 OD600nm≈140，菌体干质量为80～90g/L，pH7.2)。
壳聚糖(脱乙酰度≥98.0%)、硅藻土(食品级，60目)、 25%戊二醛、冰醋酸、K2HPO4·3H2O、KH2PO4、活性 炭、二氧化硅 国药集团化学试剂有限公司；所有试剂 均为化学纯或分析纯。
调节戊二醛溶液的体积分数与絮凝物混合，使得混
合后溶液中戊二醛的终体积分数为0.1%、0.25%、0.5%、
1.0%、1.5%、2.0%、2.5%。同时设定交联温度25℃、时
glutaraldehyde cross-linking
中图分类号：Q814.2
文献标志码：A
文章编号：1002-6630(2013)09-0164-06
doi:10.7506/spkx1002-6630-201309034
木糖异构酶(xylose isomerase，Xiase，EC 5.3.1.5)， 又称葡萄糖异构酶(glucose isomerase，GIase)，在胞外可 以催化D-葡萄糖至D-果糖的异构化反应，是食品工业生 产上以淀粉为原料制备果葡糖浆的关键酶之一[1]。目前
for 3 h in 0.25% glutaraldehyde solution at pH 6.5 under slight rabbling, and the enzyme activity reached up to 80%
of flocculation. Compared to free GIase, the optimal temperature was 80 ℃, and the optimal pH reduced from 10 to 9.
的酶活力，然后测定交联样品在75℃处理1h之前和之后
的酶活。交联效果参照交联后酶活保留率和热处理后酶
活保留率来确定，分别按式(2)、(3)计算。
Ѹ㘨ḋક䝊⌏࡯ Ѹ㘨ৢ䝊⌏ֱ⬭⥛/% = 䴲Ѹ㘨ḋક䝊⌏࡯ h100 (2)
⛁໘⧚ৢ䝊⌏࡯ ⛁໘⧚ৢ䝊⌏ֱ⬭⥛/% = ⛁໘⧚ࠡ䝊⌏࡯ h100 (3)
1.4.1 戊二醛体积分数对交联效果的影响
目前国内市场所使用的固定化GIase制剂被诺维信 公司垄断，在本实验室前期工作中，一种来源于嗜热 菌Thermobifida fusca GIase的基因xylA在E. coli中被成功 克隆表达，并对纯化酶进行了酶学性质分析，以葡萄 糖为底物该酶的米氏常数(Km)和催化常数(Kcat)值分别为 190mmol/L和28s-1，70℃条件下的半衰期为15h，高的催 化活力和良好的热稳定性使该酶成为改进葡萄糖异构化 食品工业过程中具有巨大潜力的选择。本实验拟采用壳 聚糖絮凝加戊二醛交联的固定办法，对产Thermobifida fusca GIase的重组大肠杆菌细胞进行固定化过程研究， 以期获得一种生产性能好、酶活回收率高、经济成本低 的固定化酶制剂的方法，为实现我国固定化GIase制剂高 效、低耗的工业化生产，提供一定的参考。
164 2013, Vol.34, No.09
食品科学
※生物工程
产葡萄糖异构酶细胞的固定化
邓 辉1,2，陈 晟1,2，陈 坚1,2，吴 敬1,2,*
(1.江南大学 食品科学与技术国家重点实验室，江苏 无锡 214122； 2.江南大学生物工程学院，工业生物技术教育部重点实验室，江苏 无锡 214122)
1.3.2 壳聚糖质量分数对絮凝效果的影响
调节壳聚糖质量分数与发酵液混合，使得混合后
溶液中的壳聚糖的最终质量分数为0.01‰、0.05‰、
0.10‰、0.15‰、0.20‰、0.25‰、0.30‰。同时设定其他
条件为pH5.5、温度30℃。
1.4 戊二醛交联
弃去絮凝后的上清液，取絮凝物加入100mL一定浓
单位质量的酶活力是衡量固定化酶制剂的主要指 标之一，单位质量细胞含量越多，相应的酶活力越高。 针对吸附和包埋等方法所生产的酶制剂中载体含量比例 高、单位质量酶活低、生产占用设备体积大等问题，絮 凝法固定制备的酶制剂能有效地解决该类问题[ 。 2-7] 同 时，天然存在的絮凝剂——壳聚糖，作为一种碱性阳离 子絮凝剂，无毒、无味、无污染，其亲水性和生物相容 性好，操作条件温和，化学性质稳定，具有能与细胞表 面基团相作用的功能团，是絮凝和回收蛋白质的理想絮 凝剂[8]，而具有双功能基团的交联剂——戊二醛利用其羰 基能同时与壳聚糖和酶分子上的氨基发生亲核加成反应 生成Schiff碱，将物理吸附和化学交联相结合，形成壳聚 糖、酶分子和戊二醛分子间的多重交联网络，不但使酶 分子有效固定在载体上，而且使酶制剂的稳定性和耐压 强度大大提高[9-10]。
fermentation broth. After heat treatment at 60 ℃ for 30 min, cells and debris were flocculated by 0.1‰ chitosan
solution at pH 5.5 under fully rabbling, and recovery rate of GIase reached up to 98%. Flocculation was cross-linked
1.2 仪器与设备
721型分光光度计 上海元析仪器有限公司；
Hitachi himac CFl6RX高速离心机 日立工机株式会社；
PHS-3C精密pH计 上海嘉鹏科技有限公司；JB90-D型
强力电动搅拌机 上海隆拓仪器设备有限公司；120轴
式挤压机 山东章丘市华祥机械厂。
1.3 壳聚糖絮凝 取 2 5 0 m L 发 酵 液 ， 添 加 硫 酸 镁 至 Mg2+终 浓 度 为
methods. In order to obtain the immobilization method for GIase with high performance and low cost, various factors