微生物大小的测定及微生物数量的直接计数法

微生物大小的测定及微生物数量的直接计数法摘要：本文使用了目镜测微尺和镜台测微尺来测量野生酵母的细胞大小，得到的结果是宽在5.78~11之间，长在8.25~20之间。然后用血细胞计数板对酵母菌进行计数，并绘制其生长曲线，有四个时期，分别是延滞期、对数期、稳定期和衰亡期。

关键词：细胞大小血细胞计数板酵母菌生长曲线

前言

生产生活中利用微生物时，需要了解微生物的一些基本物理属性，如菌体的大小形状等。本实验利用显微测微尺对野生酵母进行测量，并用血球计数板对酵母菌进行其生长曲线的测定，了解去生长规律。通过此综合性实验加深对无菌操作的印象，并将其掌握。

1实验材料与仪器

1．1实验材料与试剂

麦芽汁培养基、生理盐水、果汁（自制）、活化的酵母菌、酒精

1．2实验仪器

锥形瓶、试管、接种环、移液枪、显微镜、目镜测微尺、镜台测微尺、盖玻片、载玻片、滴管、血细胞计数板、吸水纸、酒精灯

2实验方法

2．1预准备

2.1.1培养基的制备

麦芽汁培养基（130.1g/L）200ml*4瓶

麦芽汁琼脂培养基（145.1g/L）5ml*2支试管150ml*1瓶

生理盐水9ml*20支

（制备后高压蒸汽灭菌121℃，20min）

2.1.2酵母分离纯化

平板划线分离：先倒制无菌琼脂培养基平板,待充分冷却凝固后,用接种环以无菌沾取少量待分离的含菌样品,在无菌琼脂平板表面进行有规则的划线。划线的方式有连续划线、平行划线、扇形划线或其它形式的划线。通过这样在平板上进行划线稀释, 微生物细胞数量将随着划线次数的增加而减少, 并逐步分散开

来。经培养后,可在平板表面形成分散的单

个菌落。但单个菌落并不一定是由单个细

胞形成的，需再重复划线1-2次, 并结合显

微镜检测个体形态特征, 才可获得真正的

纯培养物。

斜面接种是从已生长好的菌种斜面上

挑取少量菌种移植至另一支新鲜斜面培养基上的一种接种方法。具体操作如下：接种前在试管上贴上标签，注明菌名、接种日期、接种人姓名等。贴在距试管口约2-3cm的位置。点燃酒精灯。用接种环将少许菌种移接到贴好标签的试管斜面上。操作必须按无菌操作法进行。

简述如下：1)手持试管：将菌种和待接斜面的两支试管用大拇指和其他四指握在左手中，使中指位于两试管之间部位。斜面面向操作者，并使它们位于水平位置。2)旋松管塞：先用有于松动棉塞或塑料管盖，以便接种时拔出。3)取接种环：右手拿接种环(如握钢笔一样)，在火焰上将环端灼烧灭菌。然后将有可能伸入试管的其余部分均灼烧灭菌，重复此操作，再灼烧一次。4)拔管塞：用右手的无名指、小指和手掌边先后取下菌种管和待接试管的管塞，然后让试管口缓缓过火灭菌(切勿烧得过烫)。5)接种环冷却：将灼烧过的接种环伸入菌种管，先使环接触没有长菌的培养基部分，使其冷却。6)取菌：待接种环冷却后，轻轻沾取少量菌体或胞子，然后将接种环移出菌种管，注意不要使接种环的部分碰到管壁，取出后不可使带菌接种环通过火焰。7)接种：在火焰旁迅速将沾有菌种的接种环伸入另一支待接斜面试管。从斜面培养基的底部向上部作“Z”形来回密集划线，切勿划破培养基。有时也可用接种针仅在斜面培养基的中央拉一条直线作斜面接种，直线接种可观察不同菌种的生长特点。8)塞管塞：取出接种环，灼烧试管口，并在火焰旁将管塞旋上。塞棉塞时不要用试管去迎棉塞，以免试管在移动时纳入不洁空气。9)将接种环灼烧灭菌。放下接种环，再将棉花塞旋紧。

2．2微生物大小的测定

2.2.1目镜测微尺的校准

取下接目镜，旋下目镜上的目透镜，将目镜测微尺放人接目镜的中隔板上，使有刻度的一面朝下，再旋上目透镜，并装入镜筒内。将物镜测微尺置于显微镜的载物台上，使有刻度的一面朝上，同观察标本一样，使具有刻度的小圆圈位于视野中央。先用低倍镜观察，对准焦距，待看清物镜测微尺的刻度后，转动目镜，使目镜测微尺的刻度与物镜测微尺的刻度相平行，并使两尺的左边第一条线相重合，再向右寻找两尺的另外一条重合线。记录二条重合线间的目镜测微尺的格数和物镜测微尺的格数。因为镜台测微尺的刻度每个长10μm，所以有下列公式就可以算出所校准的目镜测微尺每格代表的长度。

目镜测微尺每格长度（μm）=

用此法分别校正10倍镜和40倍镜下目镜测微尺每格代表的长度。

2.2.2野生酵母菌大小的测定

取下镜台测微尺，换上酵母菌水浸制片。（酵母菌水浸制片是：将接种在斜面的野生酵母菌用麦芽糖液体培养基冲洗后移入200ml的麦芽糖液体培养基后，制水浸制片。）分别在10倍镜和40倍镜下，测量菌体的长度和宽度各占目镜测微尺几格，然后换算出菌体的实际长度。在同一标本上测定3-4个菌体，求其平均值。

2．3微生物数量的直接测定法（酵母菌的生长曲线测定）

2.3.1菌悬液制备

用移液枪分别取1ml 活化了的酵母菌，放入200ml 麦芽汁液体培养基中，分别标记对照组、平行组1、平行组2。 2.3.2血球计数板的使用

检查计数 稀释样品（加美兰） 加样 计数 计算 清洗 视待测菌悬液浓度，加无菌水适当稀释，以每小格的菌数可数为度（最好每格3-5个菌）。

取洁净的血球计数板一块，在计数区上盖上一块盖玻片。将酵母菌悬液摇匀，用滴管吸取少许，从计数板中间平台两侧的沟槽内沿盖玻片的下边缘摘入一小滴（不宜过多），让菌悬液利用液体的表面张力充满计数区，勿使气泡产生，并用

吸水纸吸去沟槽中流出的多余菌悬液。也可以将菌悬液直接滴加在计数区上，不要使计数区两边平台沾上菌悬液，以免加盖盖玻片后，造成计数区深度的升高。然后加盖盖玻片（勿使产生气泡）。

静置片刻，将血球计数板置载物台上夹稳，先在低倍镜下找到计数区后，再转换高倍镜（40倍镜）观察并计数。由于生活细胞的折光率和水的折光率相近，观察时应减弱光照的强度。

计数时若计数区是由16个大方格组成，按对角线方位，数左上（A1）、左下(A4)、右上(A2)、右下(A3)的4个大方格（即100小格）的菌数。如果是25个大方格组成的计数区，除数上述四个大方格外，还需数中央(A5)l 个大方格的菌数（即80个小格）。如菌体位于大方格的双线上，计数时则数上线不数下线，数左线不数右线，以减少误差。

对于出芽的酵母菌，芽体达到母细胞大小一半时，即可作为两个菌体计算。每个样品重复计数2—3次（每次数值不应相差过大，否则应重新操作），求出每

A1

A2

A4

A3

A5