微生物大小的测定及微生物数量的直接计数法
微生物生长的几种检测方法
一、生长量测定法1.1体积测量法：又称测菌丝浓度法。
通过测定一定体积培养液中所含菌丝的量来反映微生物的生长状况。
方法是，取一定量的待测培养液（如10毫升）放在有刻度的离心管中，设定一定的离心时间（如5分钟）和转速（如5000 rpm），离心后，倒出上清夜，测出上清夜体积为v，则菌丝浓度为（10-v）/10。
菌丝浓度测定法是大规模工业发酵生产上微生物生长的一个重要监测指标。
这种方法比较粗放，简便，快速，但需要设定一致的处理条件，否则偏差很大，由于离心沉淀物中夹杂有一些固体营养物，结果会有一定偏差。
1.2称干重法：可用离心或过滤法测定。
一般干重为湿重的10-20%。
在离心法中，将一定体积待测培养液倒入离心管中，设定一定的离心时间和转速，进行离心，并用清水离心洗涤1-5次，进行干燥。
干燥可用烘箱在105℃或100℃下烘干，或采用红外线烘干，也可在80℃或40℃下真空干燥，干燥后称重。
如用过滤法，丝状真菌可用滤纸过滤，细菌可用醋酸纤维膜等滤膜过滤，过滤后用少量水洗涤，在40℃下进行真空干燥。
称干重发法较为烦琐，通常获取的微生物产品为菌体时，常采用这种方法，如活性干酵母（activity dry yeast, ADY）,一些以微生物菌体为活性物质的饲料和肥料。
1.3比浊法：微生物的生长引起培养物混浊度的增高。
通过紫外分光光度计测定一定波长下的吸光值，判断微生物的生长状况。
对某一培养物内的菌体生长作定时跟踪时，可采用一种特制的有侧臂的三角烧瓶。
将侧臂插入光电比色计的比色座孔中，即可随时测定其生长情况，而不必取菌液。
该法主要用于发酵工业菌体生长监测。
如我所使用UNICO公司的紫外-可见分光光度计，在波长600nm 处用比色管定时测定发酵液的吸光光度值OD600，以此监控E.Coli的生长及诱导时间。
1.4菌丝长度测量法：对于丝状真菌和一些放线菌，可以在培养基上测定一定时间内菌丝生长的长度，或是利用一只一端开口并带有刻度的细玻璃管，到入合适的培养基，卧放，在开口的一端接种微生物，一段时间后记录其菌丝生长长度，借此衡量丝状微生物的生长二、微生物计数法2.1血球计数板法:血球计数板是一种有特别结构刻度和厚度的厚玻璃片，玻片上有四条沟和两条嵴，中央有一短横沟和两个平台，两嵴的表比两平台的表面高0.1 mm，每个平台上刻有不同规格的格网，中央0.1 mm2面积上刻有400个小方格。
微生物大小测定和显微镜直接计数
实验五微生物大小测定和显微镜直接计数一、实验目的：1、了解显微测微尺的结构；2、掌握显微测微尺用于测量菌体的方法；3、学习使用血细胞计数板计算酵母细胞数的原理和方法；4、了解微生物活体染色的原理的技术的方法。
二、实验原理：1、显微测微尺可用于测量微生物细胞或孢子的大小，包括镜台测微尺和目镜测微尺两个部件。
镜台测微尺全长1mm，等分为100格，每格0.01mm。
用于校正目镜测微尺没小哥的长度.目镜测微尺其中央刻有50等分或100等分的小格.测量前应预先用镜台测微尺来校正并计算出在某一放大镜下,目镜测微尺每小格所代表的实际长度,再以后作为测量微生物细胞的长度.目镜测微尺每格长度/μm = 两条重合线间镜台测微尺的格数×10/两条重合线间目镜测微尺的格数2、利用血球计数板直接在显微镜下计数微生物的细胞（或孢子）数目。
优点：直观、快速、操作简便，其缺点为：不能区分死菌与活菌；不适于对运动细菌的计数；需要相对高的细菌浓度；个体小的细菌在显微镜下难以观察1ml菌液中的总菌数=（5个方格中的总菌数/5）×25×104×稀释倍数本实验中暂规定：计上不计下，计左不计右，即位于本格上线和左线上的细胞计入本格，本格的下线和右线上的细胞按规定计入相应的格中三、实验步骤：（一）微生物大小的测定：1、放置目镜测微尺：取出目镜，旋开目透镜，目镜测微尺放在光阑上，旋上目镜，将目镜插入镜筒2、将镜台测微尺放在井台上，调焦看清镜台测微尺的刻度3、低倍镜下使镜台测微尺与目镜测微尺刻度平行，一段起止线重合，分别数出格数并求出目镜测微尺每小格的实际长度，同样的方法在高倍镜下重复进行4、按公式计算目镜测微尺每格的长度5、测量菌体的大小：取下镜台测微尺，制作酵母菌涂片，分别在低倍镜、高倍镜下测量10个菌体的长宽，求其平均值，用长（μm)*宽（μm）表示（二）显微镜直接计数1、制备酵母菌的稀释液，将菌液稀释10倍2、将计数板的盖玻片放在计数室上面的两边平台架上，混匀后酵母菌悬液吸取滴加在盖玻片与计数板的边缘缝隙处，待菌液渗入计数室，菌体自然沉降与稳定后计数3、在计数室移至视野中央，选取25中格（4觉与中央）计含菌数，重复计数2-4个计数室内的含菌量，求其平均值。
微生物大小的测定及显微镜直接计数法
微生物大小和数量的测定一、目的要求1．学习并掌握使用显微镜测微尺测定微生物大小的方法。
2．增强微生物细胞大小的感性认识。
3．了解血球计数板的构造、明确其计数原理。
4．学习并掌握使用血球计数板测定微生物细胞或孢子数量的方法。
二、基本原理l.显微测微尺显微测微尺可用于测量微生物细胞或孢子的大小，包括镜台测微尺和目镜测微尺两个部件。
目镜测微尺（图1）是一块可放入接目镜内的圆形小玻片，其中央有精确的等分刻度，有等分为50小格和100小格两种。
测量时，需将其放在接目镜中的隔板上，用以测量经显微镜放大后的细胞物象。
由于不同显微镜或不同的目镜和物镜组合放大倍数不同，目镜测微尺每小格所代表的实际长度也不一样。
因此，用目镜测微尺测量微生物大小时，必须先用镜台测微尺进行校正，以求出该显微镜在一定大放大倍数的目镜和物镜下，目镜测微尺每小格所代表的相对长度。
然后根据微生物细胞相当于目镜测微尺的格数，即可计算出细胞的实际大小。
镜台测微尺全长1mm，等分为100格，每格0.01mm。
用于校正目镜测微尺每小格的长度.目镜测微尺每格长度（μm）=两重合线间镜台测微尺格数×10两重合线间目镜测微尺格数2.表示方法球菌用直径来表示其大小；杆菌则用宽和长的范围来表示。
如金黄色葡萄球菌直径约为0.8µm，枯草芽孢杆菌大小为0.7~0.8×2~3µm。
图1：目镜测微尺和镜台测微尺3．显微直接计数法：将小量待测样品悬浮液置于计菌器上，于显微镜下直接计数的一种简便、快速、直观的方法。
显微计数法适用于各种含单细胞菌体的纯培养悬浮液，如酵母、细菌、霉菌孢子等。
菌体较大的酵母菌或霉菌孢子可采用血球计数板，一般细菌则采用彼得罗夫·霍泽（Petrof Hausser）细菌计数板或Hawksley计数板。
三种计数板的原理和部件相同，只是细菌计数板较薄，可以使用油镜观察。
而血球计数板较厚，不能使用油镜，计数板下部的细菌不易看清。
微生物大小与菌群数量的测定实验 史倩
微生物大小与菌群数量的测定实验一、实验目的1.学习并掌握微生物大小及菌落数量的测量方法2.了解血细胞计数板和显微镜测微尺的使用二、实验原理酵母菌（yeast）是一群单细胞的真核微生物。
这个词语为无分类学意义的普通名称，通常用于以裂殖或芽殖来进行无性繁殖的单细胞真菌，以与霉菌分开。
大多数酵母菌为单细胞，在光学显微镜下，一般呈卵圆形、圆形、圆柱形或柠檬形。
大小约为（1-5）μm╳（5-30）μm，最大可达100μm。
各种酵母菌有其一定的大小和形态，但也随菌龄和环境条件而异。
枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）是芽孢杆菌属的一种。
单个细胞0.7～0.8×2～3μm，着色均匀。
无荚膜，周生鞭毛，能运动。
革兰氏阳性菌，芽孢0.6～0.9×1.0～1.5μm，椭圆到柱状，位于菌体中央或稍偏，芽孢形成后菌体不膨大。
显微测微尺包括镜台测微尺和目镜测微尺两部分。
镜台测微尺是中央部分刻有精确等分线的载玻片，一般将1mm等分为100格，每格长l0μm（即0.0lmm），是专门用来校正目镜测微尺的。
校正时，将镜台测微尺放在载物台上，由于镜台测微尺与细胞标本是处于同一位置，都要经过物镜和目镜的两次放大成象进入视野，因此从镜台测微尺上得到的读数就是细胞的真实大小，所以可求出目镜测微尺每格所代表的长度，然后移去镜台测微尺，换上待测标本片，用校正好的目镜测微尺在同样放大倍数下测量微生物大小。
目镜测微尺是一块可放在接目镜内的隔板上的圆形小玻片，其中央刻有精确的刻度，等分成100小格两种，每5小格间有一长线相隔。
由于所用接目镜放大倍数和接物镜放大倍数的不同，目镜测微尺每小格所代表的实际长度也就不同，因此，目镜测微尺不能直接用来测量微生物的大小，在使用前必须用镜台测微尺进行校正，以求得在一定放大倍数的接目镜和接物镜下该目镜测微尺每小格的相对值，然后才可用来测量微生物的大小。
镜台测微尺是一个特制载玻片中央封固的标准刻尺，其尺度总长为1mm，精确分为10个大格，每个大格又分为10个小格，共100个小格，每一个小格长度为0.01mm，即10μm。
微生物数量的测定方法
微生物数量的测定方法微生物数量的测定方法微生物是一类微小的生物体，包括细菌、真菌、病毒等。
它们广泛存在于自然界中的土壤、水体、空气中，也存在于人体内外。
了解微生物的数量对于环境监测、食品安全、医学诊断等领域具有重要意义。
本文将介绍几种常用的微生物数量测定方法。
1. 直接计数法直接计数法是最直接、最常用的微生物数量测定方法之一。
它通过显微镜观察和计数来确定微生物的数量。
首先，将待测样品制备成适当的悬浮液，然后在显微镜下观察，并使用计数器进行计数。
这种方法适用于细菌和酵母等较大的微生物。
但是，由于显微镜观察需要较高的技术水平和时间，所以无法快速测量大量样品。
2. 培养法培养法是一种常用的微生物数量测定方法，它通过培养微生物并计数生长的菌落来确定数量。
首先，将待测样品制备成适当的培养基，然后在恰当的温度和湿度条件下培养一段时间。
培养基中的微生物会形成可见的菌落，通过计数菌落的数量来确定微生物的数量。
这种方法适用于大部分微生物，但是它需要一定的培养时间，并且某些微生物可能无法在常规培养基上生长。
3. 膜过滤法膜过滤法是一种常用的微生物数量测定方法，它通过将待测样品过滤到膜上，并将膜培养在适当的培养基上来确定数量。
首先，将待测样品通过特定孔径的过滤器过滤，然后将过滤后的膜放置在培养基上培养。
培养基中的微生物会在膜上形成可见的菌落，通过计数菌落的数量来确定微生物的数量。
这种方法适用于水样、空气样等液态和气态样品。
4. 分子生物学方法分子生物学方法是一种新兴且快速发展的微生物数量测定方法。
它通过检测和分析微生物DNA或RNA来确定数量。
常用的分子生物学方法包括聚合酶链反应（PCR）、实时荧光定量PCR（qPCR）等。
这些方法可以快速、准确地测定微生物的数量，并且可以检测到少量微生物。
但是，分子生物学方法需要一定的实验设备和技术，并且对样品预处理要求较高。
总结起来，微生物数量的测定方法有直接计数法、培养法、膜过滤法和分子生物学方法等。
微生物计数方法有哪些
微生物计数方法有哪些微生物计数方法是用来确定样品中微生物数量的技术方法。
根据微生物所在的环境、特征和研究目的的不同，可以选择不同的计数方法。
常用的微生物计数方法包括直接计数法、培养计数法、膜滤法、荧光染色法等。
本文将详细介绍这些常用的微生物计数方法。
一、直接计数法直接计数法是指直接通过显微镜观察计数来确定微生物数量的方法。
常用的直接计数法有：1. 显微镜计数法：通过显微镜观察样品中微生物的数量，通常使用显微镜配合计数室或计数盘进行计数。
2. 相位差显微镜计数法：与常规显微镜计数法类似，但使用相位差显微镜可以获得更清晰的图像，更准确地计数微生物的数量。
3. 流式细胞仪计数法：使用流式细胞仪对微生物进行计数和粒子分析，可以同时获得微生物的数量和其他特征信息，如大小、形状等。
二、培养计数法培养计数法是通过将微生物样品培养在含有适宜营养物质的培养基上，利用微生物的生长繁殖特性来确定微生物数量的方法。
1. 可视化计数法：将培养基和微生物混合后在琼脂培养基上进行平皿计数或浸液计数，通过观察菌落形成单位来计数微生物数量。
2. 过滤膜计数法：将微生物样品过滤到具有适当孔径的膜滤器上，然后将膜滤器移植到含有适宜培养基的琼脂平皿上，通过菌落形成单位进行计数。
3. 表面播菌计数法：将微生物样品均匀涂布在琼脂平板的表面，通过菌落形成单位计数微生物的数量。
三、膜滤法膜滤法是利用膜滤器对微生物样品进行筛选和集落计数的方法。
膜滤法通常用于分析水、空气和食品等中微生物的数量。
1. 电子显微镜计数法：将微生物样品过滤到具有适当孔径的膜滤器上，并使用电子显微镜观察并计数微生物的数量。
2. DNA混合体计数法：将微生物样品过滤到DNA束水中，通过对DNA束的计数来确定微生物数量。
3. 梅勒算法：将微生物的集落过滤到膜滤器上，使用特定的染色剂、显微镜和图像分析软件进行计数。
四、荧光染色法荧光染色法是通过使用特定的荧光染料和荧光显微镜或流式细胞仪来计数微生物数量的方法。
实验六、微生物细胞的大小测量和显微计数目
10
计数规则：
1）要求每小格内约有5－10个菌体为宜；
2）选计数室四个角的中方格和中央的一个中方格进行计数；
3）当细胞位于方格的线上时，一般只数上方和右边线上的细胞；
4）酵母出芽，又未脱离母体的，只有当芽体大小达到母细胞的
一半时，即作为两个菌体计算；
操作要点：
•血球计数室要清洁。
•观察时光线不宜过强，否则难以找到计数室。
操作要点： • 观察时光线不宜过强，否则难以找到镜台测微尺的刻度。 • 换高倍镜和油镜校正时，防止接物镜压坏镜台测微尺和损坏 镜头。
2、显微直接计数
1）血球计数室的观察和清洗 取血球计数板置于载物台上→ 观察熟悉计数室的中 方格和小方格 → 取下血球计数板→用自来水冲洗计 数室后，再用无水乙醇将血球计数室冲洗干净→ 置 干燥箱干燥 。
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2）样品中酵母菌细胞的直接计数：
取干净血球计数板→ 在计数室上方盖上盖玻片→ 用无 菌吸管，吸取摇匀的酵母菌稀释液→ 在盖玻片边缘沾 一下，让菌液沿缝隙靠毛细管渗透作用进入计数室→ 静置5min → 低倍镜或高倍镜计算每个中方格内的细 胞数→ 完毕后清洗血细胞计数板→ 冲洗、干燥
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二、基本原理
1、微生物细胞大小的测量
微生物细胞的大小是微生物基本的形态特征，也 是分类鉴定的依据之一。微生物大小的测定，需要 在显微镜下，借助特殊测量工具――测微尺（包括 镜台测微尺和目镜测微尺）。
测微尺原理：镜台测微尺是中央部分刻有精确等 分线的载玻片，一般是将1mm等分为100格，每格长 0.01mm(即10μm)。镜台测微尺并不直接用来测量细 胞的大小，而是用于校正目镜测微尺每格的相对长 度，然后再用目镜测微尺测量微生物细胞的大小。
显微镜直接计数法实验报告
显微镜直接计数法实验报告篇一：显微镜直接计数法实验报告显微镜直接计数法一、实验目的1、明确血细胞计数板计数原理；2、掌握使用血细胞计数板进行微生物计数的方法。
二、实验原理利用血细胞计数板在显微镜下直接计数，是一种常用的微生物计数方法。
此法的优点是直观、快速。
该计数板（构造如图1所示），是一块特制的载玻片，其上由四条槽构成三个平台。
中间的平台又被一短横槽隔成两半，每一边的平台上各刻有一个方格网，每个方格网共分九个大方格，中间的大方格即为计数室，微生物的计数就在计数室中进行。
计数室的刻度一般有两种规格，一种是一个大方格分成16个中方格，而每个中方格又分成25个小方格；另一种是一个大方格分成25个中方格，而每个中方格又分成16个小方格。
所以无论是哪种规格的计数板，每一个大方格中的小方格数都是相同的即共有400个小格。
2每一个大方格边长为1㎜，则每一大方格的面积为1㎜，盖上盖玻片后，载玻片与盖3玻片之间的高度为㎜，所以计数室的容积为㎜。
其计算方法如下：设5个中方格中的总菌数为A，菌液稀释倍数为B 1．16×25的计数板计算公式细胞数/ml=×16×10000×B=32000AB 个2．25×16的计数板计算公式细胞数/ml=×25×10000×B=50000AB 个三、实验器材（1）菌悬液：酵母菌悬液（2）其他物品：血球计数板，显微镜，盖玻片，无菌毛细管等。
四、实验步骤1．稀释：将酵母菌悬液进行适当稀释，菌液如不浓，可不必稀释。
（一般样品稀释度要求每小格内约有5—10个菌体为宜）2．镜检计数室：在加样前，先对计数板的计数室进行镜检。
若有污物，则需清洗后才能进行计数。
3．加样品：将清洁干燥的血球计数板盖上盖玻片，再用无菌的细口滴管将稀释的酵母菌液由盖玻片边缘滴一小滴（不宜过多），使菌液沿缝隙靠毛细渗透作用自行进入计数室，静置5—10分钟即可计数。
微生物细胞大小和数量的测定
微生物细胞大小和数量的测定
目的要求 实验材料 实验程序 思考题
目的要求
学习使用目镜测微尺和镜台测微尺在显 微镜下测定微生物大小的方法。 学习使用血球记数板测定微生物数量的 方法。
实验材料
显微镜、目镜测微尺、镜台测微尺、细 菌染色片、血球记数板、酵母菌悬液、 盖玻片、无菌滴管、西水纸、擦镜纸、 香柏油、二甲苯。
谢谢大家！
实验程序
测定微生物的大小 测定微生物数量
实验程序Ⅰ （测定微生物的大小）
测定的工具：目镜测微尺 镜台测微尺
实验程序Ⅱ
（测定微生物的大小）
目镜测微尺的校正：在高倍镜下，看清镜台测微尺的刻度后， 转动目镜，使目镜测微尺与镜台测微尺的刻度平行，移动推动 器，使目镜测微尺的0点与镜台测微尺的某一刻度重合，然后， 仔细寻找两尺第二个完全重合的刻度。计算两刻度间目镜测微 尺的格数和镜台测微尺的格数。由于镜台测微尺的刻度每格长 10µm，所以可得： 目镜测微尺每格长度（ µm）=（镜台测微尺格数×10）/目镜 测微尺格数 注意：校正目镜测微尺必须针对特定的显微镜和附件（特定的 接物镜、接目镜、镜筒长度等）进行，而且只能在这特定的情 况下才可重复使用。
实 验 程 序IV 2
5. 计算方法：
酵3+X4+X5）X 5
25（或16）X
10
X
1000
x
稀释倍数
6.
注意事项：压在方格线上的菌体，以压在底线和右
侧线上的菌体计入本格内；遇到有芽体的酵母时， 若芽体和母体同等大，就按单个酵母计数。
7. 计数完毕后，血球计数板要立即清洗干净，并用 吸水纸吸干，最后用擦镜纸擦干净，并放回盒内。
思考题
微生物生长的测定方法
微生物生长的测定方法:微生物生长的测定有计数、重量和生理指标等方法。
1、计数法此法通常用来测定样品中所含细菌、抱子、酵母菌等单细胞微生物的数量。
计数法又分为直接计数和间接计数两类。
(1)直接计数这类方法是利用特定的细菌计数板或血细胞计数板，在显微镜下计算一定容积里样品中微生物的数量。
此法的缺点不能区分死菌与活菌。
计数板是一块特制的载玻片，上面有一个特定的面积1 mm2和高O.Imm的计数室，在I mm2的面积里又被刻划成25个(或16个)中格，每个中格进一步划分成16个(或25个)小格，但计数室都是由400个小格组成。
将稀释的样品滴在计数板上，盖上盖玻片，然后在显微镜下计算4-5个中格的细菌数，并求出每个小格所含细菌的平均数，再按下面公式求出每毫升样品所含的细菌数。
每毫升原液所含细菌数二每小格平均细菌数x400x1000x稀释倍数.(2)间接计数法此法又称活菌计数法，其原理是每个活细菌在适宜的培养基和良好的生长条件下可以通过生长形成菌落。
将待测样品经一系列10倍稀释，然后选择三个稀释度的菌液，分别取0.2m1故人无菌平皿，再倒人适量的已熔化并冷至45℃左右的培养基，与菌液混匀，冷却、待凝固后，放人适宜温度的培养箱或温室培养，长出菌落后，计数，按下面公式计算出原菌液的含菌数:每毫升原菌液活菌数=同一稀释度三个以上重复平皿菌落平均数x稀释倍数x5此法可因操作不熟练造成污染，或因培养基温度过高损伤细胞等原因造成结果不稳定。
尽管如此，由于该方法能测出样品中微量的菌数，仍是教学、科研和生产上常用的一种测定细菌数的有效方法。
土壤、水、牛奶、食品和其他材料中所含细菌、酵母、芽抱与抱子等的数量均可用此法测定。
但不适于测定样品中丝状体微生物，例如放线菌或丝状真菌或丝状蓝细菌等的营养体等。
除上述两种常用的计数方法外，还有膜过滤法、比浊法。
膜过滤法是当样品中菌数很低时，可以将一定体积的潮水、海水或饮用水等样品通过膜过滤器。
微生物生长的常用检测方法
微生物生长的常用检测方法微生物生长的常用检测方法微生物包括：细菌、病毒、真菌以及一些小型的原生生物、显微藻类等在内的一大类生物群体，它个体微小，与人类关系密切。
下面是店铺收集整理的微生物生长的几种检测方法，希望对您有所帮助！一、生长量测定法1.1体积测量法：又称测菌丝浓度法。
通过测定一定体积培养液中所含菌丝的量来反映微生物的生长状况。
方法是，取一定量的待测培养液（如10毫升）放在有刻度的离心管中，设定一定的离心时间（如5分钟）和转速（如5000rpm），离心后，倒出上清夜，测出上清夜体积为v，则菌丝浓度为（10-v）/10。
菌丝浓度测定法是大规模工业发酵生产上微生物生长的一个重要监测指标。
这种方法比较粗放，简便，快速，但需要设定一致的处理条件，否则偏差很大，由于离心沉淀物中夹杂有一些固体营养物，结果会有一定偏差。
1.2称干重法：可用离心或过滤法测定。
一般干重为湿重的10-20%。
在离心法中，将一定体积待测培养液倒入离心管中，设定一定的离心时间和转速，进行离心，并用清水离心洗涤1-5次，进行干燥。
干燥可用烘箱在105℃或100℃下烘干，或采用红外线烘干，也可在80℃或40℃下真空干燥，干燥后称重。
如用过滤法，丝状真菌可用滤纸过滤，细菌可用醋酸纤维膜等滤膜过滤，过滤后用少量水洗涤，在40℃下进行真空干燥。
称干重发法较为烦琐，通常获取的微生物产品为菌体时，常采用这种方法，如活性干酵母（activitydryyeast,ADY）,一些以微生物菌体为活性物质的饲料和肥料。
1.3比浊法：微生物的生长引起培养物混浊度的增高。
通过紫外分光光度计测定一定波长下的吸光值，判断微生物的生长状况。
对某一培养物内的菌体生长作定时跟踪时，可采用一种特制的有侧臂的三角烧瓶。
将侧臂插入光电比色计的比色座孔中，即可随时测定其生长情况，而不必取菌液。
该法主要用于发酵工业菌体生长监测。
如我所使用UNICO公司的紫外-可见分光光度计，在波长600nm处用比色管定时测定发酵液的吸光光度值OD600，以此监控E.Coli的生长及诱导时间。
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微生物大小的测定及微生物数量的直接计数法摘要：本文使用了目镜测微尺和镜台测微尺来测量野生酵母的细胞大小，得到的结果是宽在5.78~11之间，长在8.25~20之间。
然后用血细胞计数板对酵母菌进行计数，并绘制其生长曲线，有四个时期，分别是延滞期、对数期、稳定期和衰亡期。
关键词：细胞大小血细胞计数板酵母菌生长曲线
前言
生产生活中利用微生物时，需要了解微生物的一些基本物理属性，如菌体的大小形状等。
本实验利用显微测微尺对野生酵母进行测量，并用血球计数板对酵母菌进行其生长曲线的测定，了解去生长规律。
通过此综合性实验加深对无菌操作的印象，并将其掌握。
1实验材料与仪器
1．1实验材料与试剂
麦芽汁培养基、生理盐水、果汁（自制）、活化的酵母菌、酒精
1．2实验仪器
锥形瓶、试管、接种环、移液枪、显微镜、目镜测微尺、镜台测微尺、盖玻片、载玻片、滴管、血细胞计数板、吸水纸、酒精灯
2实验方法
2．1预准备
2.1.1培养基的制备
麦芽汁培养基（130.1g/L）200ml*4瓶
麦芽汁琼脂培养基（145.1g/L）5ml*2支试管150ml*1瓶
生理盐水9ml*20支
（制备后高压蒸汽灭菌121℃，20min）
2.1.2酵母分离纯化
平板划线分离：先倒制无菌琼脂培养基平板,待充分冷却凝固后,用接种环以无菌沾取少量待分离的含菌样品,在无菌琼脂平板表面进行有规则的划线。
划线的方式有连续划线、平行划线、扇形划线或其它形式的划线。
通过这样在平板上进行划线稀释, 微生物细胞数量将随着划线次数的增加而减少, 并逐步分散开
来。
经培养后,可在平板表面形成分散的单
个菌落。
但单个菌落并不一定是由单个细
胞形成的，需再重复划线1-2次, 并结合显
微镜检测个体形态特征, 才可获得真正的
纯培养物。
斜面接种是从已生长好的菌种斜面上
挑取少量菌种移植至另一支新鲜斜面培养基上的一种接种方法。
具体操作如下：接种前在试管上贴上标签，注明菌名、接种日期、接种人姓名等。
贴在距试管口约2-3cm的位置。
点燃酒精灯。
用接种环将少许菌种移接到贴好标签的试管斜面上。
操作必须按无菌操作法进行。
简述如下：1)手持试管：将菌种和待接斜面的两支试管用大拇指和其他四指握在左手中，使中指位于两试管之间部位。
斜面面向操作者，并使它们位于水平位置。
2)旋松管塞：先用有于松动棉塞或塑料管盖，以便接种时拔出。
3)取接种环：右手拿接种环(如握钢笔一样)，在火焰上将环端灼烧灭菌。
然后将有可能伸入试管的其余部分均灼烧灭菌，重复此操作，再灼烧一次。
4)拔管塞：用右手的无名指、小指和手掌边先后取下菌种管和待接试管的管塞，然后让试管口缓缓过火灭菌(切勿烧得过烫)。
5)接种环冷却：将灼烧过的接种环伸入菌种管，先使环接触没有长菌的培养基部分，使其冷却。
6)取菌：待接种环冷却后，轻轻沾取少量菌体或胞子，然后将接种环移出菌种管，注意不要使接种环的部分碰到管壁，取出后不可使带菌接种环通过火焰。
7)接种：在火焰旁迅速将沾有菌种的接种环伸入另一支待接斜面试管。
从斜面培养基的底部向上部作“Z”形来回密集划线，切勿划破培养基。
有时也可用接种针仅在斜面培养基的中央拉一条直线作斜面接种，直线接种可观察不同菌种的生长特点。
8)塞管塞：取出接种环，灼烧试管口，并在火焰旁将管塞旋上。
塞棉塞时不要用试管去迎棉塞，以免试管在移动时纳入不洁空气。
9)将接种环灼烧灭菌。
放下接种环，再将棉花塞旋紧。
2．2微生物大小的测定
2.2.1目镜测微尺的校准
取下接目镜，旋下目镜上的目透镜，将目镜测微尺放人接目镜的中隔板上，使有刻度的一面朝下，再旋上目透镜，并装入镜筒内。
将物镜测微尺置于显微镜的载物台上，使有刻度的一面朝上，同观察标本一样，使具有刻度的小圆圈位于视野中央。
先用低倍镜观察，对准焦距，待看清物镜测微尺的刻度后，转动目镜，使目镜测微尺的刻度与物镜测微尺的刻度相平行，并使两尺的左边第一条线相重合，再向右寻找两尺的另外一条重合线。
记录二条重合线间的目镜测微尺的格数和物镜测微尺的格数。
因为镜台测微尺的刻度每个长10μm，所以有下列公式就可以算出所校准的目镜测微尺每格代表的长度。
目镜测微尺每格长度（μm）=
用此法分别校正10倍镜和40倍镜下目镜测微尺每格代表的长度。
2.2.2野生酵母菌大小的测定
取下镜台测微尺，换上酵母菌水浸制片。
（酵母菌水浸制片是：将接种在斜面的野生酵母菌用麦芽糖液体培养基冲洗后移入200ml的麦芽糖液体培养基后，制水浸制片。
）分别在10倍镜和40倍镜下，测量菌体的长度和宽度各占目镜测微尺几格，然后换算出菌体的实际长度。
在同一标本上测定3-4个菌体，求其平均值。
2．3微生物数量的直接测定法（酵母菌的生长曲线测定）
2.3.1菌悬液制备
用移液枪分别取1ml 活化了的酵母菌，放入200ml 麦芽汁液体培养基中，分别标记对照组、平行组1、平行组2。
2.3.2血球计数板的使用
检查计数 稀释样品（加美兰） 加样 计数 计算 清洗 视待测菌悬液浓度，加无菌水适当稀释，以每小格的菌数可数为度（最好每格3-5个菌）。
取洁净的血球计数板一块，在计数区上盖上一块盖玻片。
将酵母菌悬液摇匀，用滴管吸取少许，从计数板中间平台两侧的沟槽内沿盖玻片的下边缘摘入一小滴（不宜过多），让菌悬液利用液体的表面张力充满计数区，勿使气泡产生，并用
吸水纸吸去沟槽中流出的多余菌悬液。
也可以将菌悬液直接滴加在计数区上，不要使计数区两边平台沾上菌悬液，以免加盖盖玻片后，造成计数区深度的升高。
然后加盖盖玻片（勿使产生气泡）。
静置片刻，将血球计数板置载物台上夹稳，先在低倍镜下找到计数区后，再转换高倍镜（40倍镜）观察并计数。
由于生活细胞的折光率和水的折光率相近，观察时应减弱光照的强度。
计数时若计数区是由16个大方格组成，按对角线方位，数左上（A1）、左下(A4)、右上(A2)、右下(A3)的4个大方格（即100小格）的菌数。
如果是25个大方格组成的计数区，除数上述四个大方格外，还需数中央(A5)l 个大方格的菌数（即80个小格）。
如菌体位于大方格的双线上，计数时则数上线不数下线，数左线不数右线，以减少误差。
对于出芽的酵母菌，芽体达到母细胞大小一半时，即可作为两个菌体计算。
每个样品重复计数2—3次（每次数值不应相差过大，否则应重新操作），求出每
A1
A2
A4
A3
A5
一个小格中细胞平均数（N），按公式计算出每ml（g）菌悬液所含酵母菌细胞数量。
每毫升菌液的菌数[个/ml]=(A1+A2+A3+A4+A5)/80*400*104*稀释倍数
测数完毕，取下盖玻片，用酒精和水将血球计数板冲洗干净，切勿用硬物洗刷或抹擦，以免损坏网格刻度。
洗净后自行晾干或用吹风机吹干，放入盒内保存。
2.3.3生长曲线的制作
在制备菌悬液后，分别计数三瓶菌液中活酵母菌数量，之后每隔1小时计数平行1、平行2中的活酵母菌数。
最后（下午4：00）测三瓶菌液的活酵母菌数量。
3实验结果与讨论
3.1野生酵母菌大小的测定
2 2．75 2.5 6.88 4.0 11 8.25~20
之间
3 2．75 2.8 7.7 3.0 8.25
4 2．7
5 2.1 5.78 5.0 13.75
有上表可知：野生酵母菌的大小为：宽在5.78~11之间，长在8.25~20之间。
3.2酵母菌生长曲线的绘制
由此图可得下图：
由此表可得酵母菌生长曲线：
由上图以看出，酵母菌的生长率不是一样的，它会经过一个含有延长期，对数期，稳定期和衰老期的生长期，并且由对照组与平行组的数据进行比较，可以较明显地看出，对照的酵母菌数比平行组的多许多，氧气在其生长中有一定的影响。
但是由于观察计数的不及时，得出的数据并不准确，到后来其生长曲线发生较大的偏差，并没有稳定期的出现。
4 结论
野生酵母菌大小的测定：宽在5.78~11之间，长在8.25~20之间。
酵母菌生长曲线的测定：一般的微生物生长曲线分为四个区：延滞期、对数期、稳定期和衰亡期。
参考文献
[2] 何国庆,贾英明.丁立孝等主编.食品微生物学.中国农业大学出版社
[3] 刘素纯,吕嘉枥.蒋立文等主编.食品微生物学实验.化学工业出版社。