微生物的计数——血球计数板法

微生物得计数——血球计数板法

【摘要】测定微生物细胞数量得方法很多，有分光光度法、显微直接计数法与平板计数法。分光光度法比较简便，易操作，但就是会使数据严重偏大。而平板计数法则会使实验数据严重偏小.ﻫ显微计数法适用于各种含单细胞菌体得纯培养悬浮液,如有杂菌或杂质，常不易分辨.菌体较大得酵母菌或霉菌孢子可采用血球计数板,一般细菌则采用彼得罗夫·霍泽(PetｒｏｆHausｓｅr)细菌计数板。两种计数板得原理与部件相同，只就是细菌计数板较薄,可以使用油镜观察。而血球计数板较厚,不能使用油镜，计数板下部得细菌不易瞧清.本实验采用血球计数板法，主要目得就是了解血球计数板法得构造与使用方法，学会用血球计数板对酵母菌细胞进行计数。

一、实验目得与要求

１、了解微生物计数常用得三种方法：分光光度法;平板计数法；血球计数板法。

2、了解血球计数板得构造与使用方法。

3、学会用血球计数板对酵母细胞进行计数。

二、基本原理

利用血球计数板在显微镜下直接计数，就是一种常用得微生物计数方法。此法得优点就是直观、快速.将经过适当稀释得菌悬液（或孢子悬液）放在血球计数板载玻片与盖玻片之间得计数室中，在显微镜下进行计数。由于计数室得容积就是一定得（０、1mｍ2），所以可以根据在显微镜下观察到得微生物数目来换算成单位体积内得微生物总数目。由于此法计得得就是活菌体与死菌体得总与，故又称为总菌计数法.

血球计数板,通常就是一块特制得载玻片，其上由四条槽构成三个平台。中间得平台又被一短横槽隔成两半，每一边得平台上各刻有一个方格网,每个方格网共分九个大方格,中间得大方格即为计数室，微生物得计数就在计数室中进行。

计数室得刻度一般有两种规格,一种就是一个大方格分成１６个中方格，而每个中方格又分成25个小方格;另一种就是一个大方格分成25个中方格，而每个中方格又分成16个小方格。但无论就是哪种规格得计数板,每一个大方格中

得小方格数都就是相同得,即1６×25=400小方格。

每一个大方格边长为１mm，则每一大方格得面积为1ｍm2，盖上盖玻片后，载玻片与盖玻片之间得高度为0.1mm，所以计数室得容积为０.1ｍm３。

在计数时，通常数五个中方格得总菌数，然后求得每个中方格得平均值，再乘上16或25，就得出一个大方格中得总菌数，然后再换算成1ml菌液中得总菌数.

下面以一个大方格有2５个中方格得计数板为例进行计算：设五个中方格中总菌数为A，菌液稀释倍数为B，那么，一个大方格中得总菌数

因1ml=1cm３＝1000mm３，

＝50００0A·B（个)

同理,如果就是16个中方格得计数板，设五个中方格得总菌数为A’,则三、实验材料

1)菌种：酿酒酵母菌

２）用品:显微镜、血球计数板、酒精灯、盖玻片、接种环、番红染液、胶头滴管。

四、实验方法

1、实验流程图

2、实验步骤

1)镜检计数室:在加样前，先对计数板得计数室进行镜检。若有污物,则需清洗后才能进行计数.

２）将酿酒酵母菌悬液进行适当稀释，菌液如不浓,可不必稀释。

3）取洁净得血球计数板一块，在计数区上盖上一块盖玻片。然后在显微镜下找到计数室。若计数室沾有杂质或者菌体，要用蒸馏水冲洗计数板,用滤纸吸干其上得水分。然后再放到显微镜下找到计数室。

4）将酵母菌悬液摇匀,用滴管吸取少许，从计数板中间平台两侧得沟槽内沿盖玻片得下边缘摘入一小滴(不宜过多)，让菌悬液利用液体得表面张力充满计数区，勿使气泡产生,并用吸水纸吸去沟槽中流出得多余菌悬液.

5）静置片刻,先在低倍镜下找到计数区后，再转换高倍镜观察并计数。由于生活细胞得折光率与水得折光率相近，观察时应减弱光照得强度.

6）计数时若计数区就是由1６个大方格组成，按对角线方位，数左上、左下、右上、右下得4个大方格（即100小格)得菌数。如果就是25个大方格组成得计数区,除数上述四个大方格外，还需数中央l个大方格得菌数（即80个小格）。如菌体位于大方格得双线上，计数时则数上线不数下线,数左线不数右线，以减少误差.本实验采用２5格×１６格得血球计数板。计数时应数５个大方格。７)计数.每个样品重复计数２—3次（每次数值不应相差过大,否则应重新操作），求出每一个小格中细胞平均数（N),按公式计算出每ml(ｇ)菌悬液所含酵母菌细胞数量。

８）测数完毕,取下盖玻片，用水将血球计数板冲洗干净，切勿用硬物洗刷或抹擦,以免损坏网格刻度。洗净后自行晾干或用吹风机吹干，放入盒内保存.

9)计算结果。

可用以下公式进行计算

(１）１6格×25格得血球计数板计算公式:ﻫ细胞数/ml=１00小格内细胞个数／100×40０×10０00×稀释倍数

(2）25格×16格得血球计数板计算公式:

细胞数/ml=８０小格内细胞个数/80×4００×100０0×稀释倍数

五、实验结果

六、结论与分析

1、误差来源

本次试验中我们组用得就是2号酵母培养液,就是本次试验所用得酵母培养液中浓度最高得培养液。但就是经过老师分析,实验数据仍然偏大得一点.产生这种误差得原因大概如下:

①酵母细胞计数得误差分别来源于技术误差与固有误差.其中由于操作人员不注意细节，器材处理、使用不当，稀释不准确,细胞识别错误等因素所造成得误差属技术误差;而由于仪器（计数板、盖片、吸管等)不够准确与精密带来得误差称仪器误差，由于细胞分布不均匀等因素带来得细胞计数误差属于分布误差或计数域误差（)。

②由于时间得关系,实验计数得次数太少，难以得到准确均匀得实验数据。在实验过程中,操作人员也存在一定得不严谨性,导致实验结果产生误差。由于没有足够多得平行数据,难以用科学得计数方法进行结果得计算,因此难以得到比较准确得实验数据。

因此，搞好酵母细胞计数得质量控制一般需采用以下措施。ﻫ1)避免技术误差，纠正仪器误差ﻫ①所用器材均应清洁干燥，计数板、血盖片、微量吸管及刻度吸管得规格应符合要求或经过校正。

②严格操作,从消毒、稀释、加样到计数都应规范，尤其应注意得就是样品稀释要作到充分混匀.必须一次性充满计数室，防止产生气泡，充入细胞悬液得量以不超过计数室台面与盖玻片之间得矩形边缘为宜。ﻫ2）缩小计数域误差或分布误差由于血细胞在充入计数室后呈随机分布或,而我们所能计数得细胞分布范围就是有限得,由此造成得计数误差称为计数域误差或分布误差。缩小这种误差得有效方法就就是尽量扩大细胞计数范围与计数数目,一般先进行误差估计，然后决定所需计数得数目与计数范围,只要能将误差控制在允许范围内即可。

2、不足之处

血球计数板在显微镜下直接进行测定。它观察在一定得容积中得微生物得个体数目，然后推算出含菌数，简便快捷。但就是在计数时包括死活细胞均被计算在内，还有微小杂物也被计算在内.这样得出结果往往偏高,因此适用于对形态个体较大得菌体或孢子进行计数。

七、思考题

1、试述血球计数板得计数原理。为什么用两种规格不同得计数板计数同一样品,结果就是一样得？

答:每块计数板由H形凹槽分为2个同样得计数池计数池两侧各有一支持柱,将特制得专用盖玻片覆盖其上，形成高０、10ｍｍ得计数池。计数池画有长、宽各3、０mm得方格，分为９个大方格，每个大格面积为1、0mm;、容积为０、1mm,

中央大方格用双线分成2５个中方格,位于正中及四角5个中方格就是红细胞计数区域,用单线划分为16个小方格。四角得4个大方格就是白细胞计数区域,用单线划分为16个中方格。血球计数板得计数原理：通过对一定数量得小格计数，根据相应小格所占得体积，可以推算出单位体积得溶液中微生物细胞得密度与总数.因为不同规格用不同得计算公式计算，最后得出得都就是微生物细胞得密度与总数，所以结果一样。