微生物的计数——血球计数板法
血球计数板计数法
精度高
血球计数板由精密的网格构成，能够精确地 计算细胞数量，误差较小。
样本用量少
血球计数板计数法需要的样本量较少，适用 于珍贵样本的计数。
缺点
主观性强
血球计数板计数法需要人工识别和计数细胞，因此容易受到主观因素 的影响，不同操作者之间可能存在差异。
无法计数非网格区域细胞
血球计数板上的网格区域有限，对于非网格区域的细胞无法计数，可 能会造成计数误差。
改进样本处理方法，提高细胞分散效果，降低细胞聚集现象， 提高计数的准确性。
增加血球计数板的网格密度，以减少计数误差，提高计数的准 确性。
将血球计数板计数法与其他检测方法相结合，如染色法、流式 细胞术等，以提高计数的准确性和可靠性。
06 血球计数板计数法：血常规检测中的血细胞计数
红细胞计数降低
常见于缺铁性贫血、巨幼细胞性贫血、溶血性贫血等，也 可见于慢性病、肿瘤、月经期、孕妇等生理性贫血。
白细胞计数结果解读
白细胞计数正常值
成人（4.0~10.0） × 10^9/L，新生儿 （15.0~20.0） × 10^9/L。
白细胞计数升高
常见于感染、炎症、组织损伤、恶性肿瘤等，也可 见于生理性升高，如剧烈运动、体力劳动、月经期 和排卵期等。
常见于免疫性血小板减少症、再 生障碍性贫血、骨髓增生异常综 合征等，也可见于某些药物影响 或放化疗后骨髓抑制。
05 血球计数板计数法的优缺点
CHAPTER
优点
操作简便
血球计数板计数法是一种直接、快速的细胞 计数方法，操作简便，易于掌握。
适用范围广
该方法适用于各种类型的细胞计数，包括细 菌、红细胞、白细胞等。
总结词
血球计数板计数法在血常规检测中广 泛应用，用于准确计数红细胞、白细 胞和血小板等血细胞数量，为临床诊 断提供重要依据。
血球计数板的使用
血球计数板生物实验用具血球计数板是显微镜上的外挂物件,可用来测量细胞,细菌等一些微小物体的长度,还有就是测量数量,如单位体积细胞的数量.血球计数板的构造和使用血球计数板是由一块比普通载玻片厚的特制玻片制成的.玻片中有四条下凹的槽,构成三个平台.中间的平台较宽,其中间又被一短横槽隔为两半,每半边上面,刻有一个方格网.方格网上刻有9个大方格,其中只有中间的一个大方格为计数室,供微生物计数用.这一大方格的长和宽各为1mm,深度为0.1mm,其体积为0.1mm3.计数室通常有两种规格.一种是大方格内分为16中格,每一中格又分为25小格;另一种是大方格内分为25中格,每一中格又分为16小格.但是不管计数室是哪一种构造;它们都有一个共同的特点,即每一大方格都是由16×25=25×16=400个小方格组成,见图.血球计数板的使用以计数酵母菌为例(1)用血球计数板计数酵母菌悬液的酵母菌个数.(2)样品稀释的目的是便于酵母菌悬液的计数,以每小方格内含有4-5个酵母细胞为宜,一般稀释10倍即可.(3)将血球计数板用擦镜纸擦净,在中央的计数室上加盖专用的厚玻片.(4)将稀释后的酵母菌悬液,用吸管吸取一滴置于盖玻片的边缘,使菌液缓缓渗入,多余的菌液用吸水纸吸取,捎待片刻,使酵母菌全部沉降到血球计数室内.(5)计数时,如果使用16格×25格规格的计数室,要按对角线位,取左上,右上,左下,右下4个中格(即100个小格)的酵母菌数.如果规格为25格×16格的计数板,除了取其4个对角方位外,还需再数中央的一个中格(即80个小方格)的酵母菌数.(6)当遇到位于大格线上的酵母菌,一般只计数大方格的上方和右方线上的酵母细胞(或只计数下方和左方线上的酵母细胞).(7)对每个样品计数三次,取其平均值,按下列公式计算每1ml菌液中所含的酵母菌个数.3.计算公式(1)16格×25格的血球计数板计算公式:酵母细胞数/ml=100小格内酵母细胞个数/100×400×104×稀释倍数(2)25格x16格的血球计数板计算公式:酵母细胞数/ml=80小格内酵母细胞个数/80×400×104×稀释倍数4.血球计数板的清洁血球汁数板使用后,用自来水冲洗,切勿用硬物洗刷,洗后自行晾干或用吹风机吹干,或用95%的乙醇,无水乙醇,丙酮等有机溶剂脱水使其干燥.通过镜检观察每小格内是否残留菌体或其他沉淀物.若不干净,则必须重复清洗直到干净为止.实验六微生物的显微直接计数法一、实验目的了解血球计数板的构造、计数原理和计数方法，掌握显微镜下直接计数的技能。
细胞数的测定(血球计数板的使用方法)
、目的与要求了解血球计数板计数的原理，学会测定细胞总数方法。
二、原理用血球计数板在显微镜下直接计数是一种常用的微生物计数方法。
血球计数板是一块特制的厚载玻片，其上由四条槽构成三个平台，中间较宽的平台又被一短横槽隔成两半，每一边的平台上各刻有一个方格网，每个方格网共分为9个大方格，中间的大方格即为计数室。
计数室的刻度一般有两种规格，一种是一个大方格分成16个中方格，每个中方格又分成25个小格（即16x25），另一种是一个大方格分成25个中方格，每个中方格又分为16个小方格（即25X 16），但无论是哪一种规格的计数板，每一个大方格中的小方格都是400个，每一个大方格边长为 1 mm则每一个大方格的面积为 1 mm2，盖上盖玻片后，盖玻片与载玻片之间的高度为0.1mm,所以计数室的容积为0.1 mm3实磴圈-石血球计弦板杓构jfi三、血球计数板的使用方法（一）菌悬液的制备为便于计数，对样品进行适当稀释，稀释程度以每小格内含5〜10个酵母为宜，可采用10倍系列稀释法。
（二）加菌悬液样品将清洁干燥的血球计数板盖上盖玻片，再用无菌的毛细滴管将摇匀的菌悬液由盖玻片边缘滴一小滴，让菌液沿缝隙靠毛细渗透作用自动进入计数室，用吸水纸吸去多余水液。
由盖玻片边缘或槽内加入计数板来回推压盖玻片，使其紧贴在计数板上，计数室内不能有气泡。
静置5-10分钟。
（三）显微镜计数在低倍镜下找到小方格网后更换高倍镜观察计数，上下调动细螺旋，以便看到小室内不同深度的菌体。
位于分格线上的菌体，只数两条边上的，其余两边不计数。
如数上线就不数下线，数左边线就不数右边线。
当芽抱菌体达到母细胞大小的二分之一时，可记作两个细胞。
（四）计数时若使用刻度为25X 16 （大格）的计数板，则数四角的4个大格（即100小格）内的菌数。
如用刻细胞数的测定D申決甌裕牧我度为16X 25 （大格）的计数板，除数四角的4个大格外，还需数中央1个大格的菌数（即80 小格）。
血球计数板计数实验
环工综合实验血球计数板计数实验实验报告环境科学与工程学院实验中心使用血球计数板计数时，先要测定每个小方格中微生物的数量，再换算成每毫升菌液（或每克样品）中微生物细胞的数量。
2.血球计数板计算微生物数量的优缺点是什么？血球计数板与平板稀释法对细菌个数进行测定，结果往往差别很大。
分析原因。
答：⑴将细菌（或其他微生物）以染料（例如结晶紫）染色后，直接以显微镜观察的方式计数，再推算回细菌数，所得即为总菌数，即死菌、活菌一并计算。
优点：简单、快速、重复性高。
不足：不能区分死细胞和活细胞，应用范围较窄；一些小的细胞在显微镜下很难看到；样品中菌液浓度不能低于106个/mL；不能用于菌丝体或呈链状而不分散的微生物测定⑵血球计数板计量时所得到的结果为死菌与活菌的总数，而平板稀释法培养得到的为活菌数目，因此结果差异较大。
四、实验步骤1.稀释：取接种酵母菌的斜面一支，加入5ml无菌水，摇晃试管一分钟，使形成菌液；将菌液倒入洁净的150ml锥形瓶中，加结晶紫三滴，摇晃2分钟，再加入无菌水至50ml。
2.镜检计数室：在加样前，先对计数板的计数室进行镜检。
若有污物，则需清洗后才能进行计数。
2.加样品：将清洁干燥的血球计数板盖上盖玻片，再用无菌的细口滴管将稀释的酿酒酵母菌液由盖玻片边缘滴一小滴（不宜过多），让菌液沿缝隙靠毛细渗透作用自行进入计数室，一般计数室均能充满菌液。
注意不可有气泡产生。
4.显微镜计数：静止5分钟后，将血球计数板置于显微镜载物台上，先用低倍镜找到计数室所在位置，然后换成高倍镜进行计数。
在计数前若发现菌液太浓或太稀，需重新调节稀释度后再计数。
一般样品稀释度要求每小格内约有5—10个菌体为宜。
每个计数室选5个中格（可选4个角和中央的中格）中的菌体进行计数。
位于格线上的菌体一般只数上方和右边线上的。
如遇酵母出芽，芽体大小达到母细胞的一半时，即作两个菌体计数。
计数一个样品要从两个计数室中计得的值来计算样品的含菌量。
微生物细胞数量的显微镜直接计数法
南京林业大学实验报告食品科学与工程专业1201091年级120109112姓名：马天柔日期：2014/04/20 实验六微生物细胞数量的显微镜直接计数法一．实验目的：掌握实用血球计数板进行微生物细胞数量的计数办法。
二．实验器材：显微镜，血球计数板，盖玻片，酵母菌悬液，滴管。
三．实验方法：1．将细胞悬液加适量的无菌水充分混匀并稀释至每小格约有5-10个菌体为宜。
2．制片：先将血球计数板和盖玻片用纱布或绸布擦干净后，把盖玻片盖在计数板的刻度上，用滴管取少量稀释的菌体从盖玻片的一端注入，使菌液沿两玻片空隙间渗入，注意不可有气泡产生，用吸水纸吸干沟槽中流出的多余菌液，切勿将盖玻片抬高。
3．镜检计数：静置几分钟后，将血球计数板置于载物台上，先用低倍镜找到计数室所在位置，然后转换成高倍镜进行计数，按对角线方向数5中格即80小格，计数每一小方格细胞的平均数。
由于菌体细胞在血球计数室中处于不同的位置，要在不同焦距下才能看到，因为要求观察时要不断调节微调螺旋，防止遗漏，如菌体细胞位于小格的线上，计数时则数上线不数下线，数左线不数右线，以减少误差。
4．结果计算：每小格的室容积=（1×1×0.1）/（16×25）=0.1ul/400计数：数5个中方格（80个小格）每小格的平均细胞数=A/（5×16）=A/80每ul细胞数=（A/80）×40005．清洗：血球计数板用完后，一定要用清水冲洗干净，晾干后保存，注意不可用粗糙物品擦中央平板，以免损坏小格刻度。
用血球计数板在显微镜下直接计数微生物细胞的数量是一种比较方便而快速的计数方法，但只能测得微生物细胞的总数，分辨不出活细胞还是死细胞。
四.实验结果：每小格的室容积=（1×1×0.1）/（16×25）=0.1ul/400计数：数5个中方格（80个小格共有406个）每小格的平均细胞数=A/（5×16）=A/80=406/80≈5.075每ul细胞数=（A/80）×4000=20300五.心得体会：1）取待测稀释菌悬液像血球计数板加样前，必须将菌悬液充分摇匀；2）加样过程中，应避免将菌液滴在盖玻片；3）由于菌体在计数室中处于不同空间位置，须在不同焦距下才能观察到，故观察时续不断调节微调，计数菌液中全部菌体，尽量避免遗漏。
微生物计数法
微生物计数法1）血球计数板法:血球计数板是一种有特别结构刻度和厚度的厚玻璃片，玻片上有四条沟和两条嵴，中央有一短横沟和两个平台，两嵴的表比两平台的表面高0.1mm，每个平台上刻有不同规格的格网，中央0.1mm2面积上刻有400个小方格。
通过油镜观察，统计一定大格内微生物的数量，即可算出1毫升菌液中所含的菌体数。
这种方法简便，直观，快捷，但只适宜于单细胞状态的微生物或丝状微生物所产生的孢子进行计数，并且所得结果是包括死细胞在内的总菌数。
2）染色计数法：为了弥补一些微生物在油镜下不易观察计数，而直接用血球计数板法又无法区分死细胞和活细胞的不足，人们发明了染色计数法。
借助不同的染料对菌体进行适当的染色，可以更方便的在显微镜下进行活菌计数。
如酵母活细胞计数可用美蓝染色液，染色后在显微镜下观察，活细胞为无色，而死细胞为蓝色。
3）比例计数法：将已知颗粒（如霉菌孢子或红细胞）浓度的液体与一待测细胞浓度的菌液按一定比例均匀混合，在显微镜视野中数出各自的数目，即可得未知菌液的细胞浓度。
这种计数方法比较粗放。
并且需要配制已知颗粒浓度的悬液做标准。
4）液体稀释法：对未知菌样做连续十倍系列稀释，根据估计数，从最适宜的三个连续的10倍稀释液中各取5毫升试样，接种1毫升到3组共15只装培养液的试管中，经培养后记录每个稀释度出现生长的试管数，然后查最大或然数表MPN（most probablynumber）得出菌样的含菌数，根据样品稀释倍数计算出活菌含量。
该法常用于食品中微生物的检测，例如饮用水和牛奶的微生物限量检查。
5）平板菌落计数法：这是一种最常用的活菌计数法。
将待测菌液进行梯度稀释，取一定体积的稀释菌液与合适的固体培养基在凝固前均匀混合，或将菌液涂布于已凝固的固体培养基平板上。
保温培养后，用平板上出现的菌落数乘以菌液稀释度，即可算出原菌液的含菌数。
一般以直径9cm的平板上出现50-500个菌落为宜。
但方法比较麻烦，操作者需有熟练的技术。
血球计数法计数原理
一、血球计数板的使用原理显微镜直接计数法是将小量待测样品的悬浮液置于一种特别的具有确定面积和容积的载玻片上(又称计菌器),于显微镜下直接计数,然后推算出含菌数的一种方法。
血球计数板是常用的计菌器之一。
血球计数板是一种专门用于计算较大单细胞微生物的一种仪器,由一块比普通载玻片厚的特制玻片制成的玻片中有四条下凹的槽,构成三个平台。
中间的平台较宽,其中间又被一短横槽隔为两半,每半边上面刻有一个方格网。
方格网上刻有9个大方格,其中只有中间的一个大方格为计数室。
这一大方格的长和宽各为1mm,深度为0.1mm,其容积为0.1mm3,即1mm×1mm×0.1mm方格的计数板;大方格的长和宽各2mm,深度为0.1mm,其容积为0.4mm3,即2mm×2mm×0.1mm方格的计数板。
在血球计数板上,刻有一些符号和数字(见图一),其含义是:XB-K-25为计数板的型号和规格,表示此计数板分25个中格;0.1mm 为盖上盖玻片后计数室的高;1/400mm2表示计数室面积是1mm2,分400个小格,每小格面积是1/400 mm2。
计数室通常也有两种规格:一种是16×25型,即大方格内分为16中格,每一中格又分为25小格;另一种是25×16型,即大方格内分为25中格,每一中格又分为16小格。
但是不管计数室是哪一种构造,它们都有一个共同的特点,即每一大方格都是由16×25=25×16=400个小方格组成。
1.16×25型的计数板将计数室放大,可见它含16中格,一般取四角:1、4、13、16四个中方格(100个小方格)计数(见图二)。
将每一中格放大,可见25个小格。
计数重复3次,取其平均值。
计数完毕后,依下列公式计算:酵母细胞个数/1mL=100个小方格细胞总数/100 ×400×10000×稀释倍数2.25×16型的计数板中央大方格以双线等分成25个中方格,每个中方格又分成16个小方格,供细胞计数用(见图三)。
血球计数板的使用
血球计数板生物实验用具血球计数板是显微镜上的外挂物件,可用来测量细胞,细菌等一些微小物体的长度,还有就是测量数量,如单位体积细胞的数量.血球计数板的构造和使用血球计数板是由一块比普通载玻片厚的特制玻片制成的.玻片中有四条下凹的槽,构成三个平台.中间的平台较宽,其中间又被一短横槽隔为两半,每半边上面,刻有一个方格网.方格网上刻有9个大方格,其中只有中间的一个大方格为计数室,供微生物计数用.这一大方格的长和宽各为1mm,深度为0.1mm,其体积为0.1mm3.计数室通常有两种规格.一种是大方格内分为16中格,每一中格又分为25小格;另一种是大方格内分为25中格,每一中格又分为16小格.但是不管计数室是哪一种构造;它们都有一个共同的特点,即每一大方格都是由16×25=25×16=400个小方格组成,见图.血球计数板的使用以计数酵母菌为例(1)用血球计数板计数酵母菌悬液的酵母菌个数.(2)样品稀释的目的是便于酵母菌悬液的计数,以每小方格内含有4-5个酵母细胞为宜,一般稀释10倍即可.(3)将血球计数板用擦镜纸擦净,在中央的计数室上加盖专用的厚玻片.(4)将稀释后的酵母菌悬液,用吸管吸取一滴置于盖玻片的边缘,使菌液缓缓渗入,多余的菌液用吸水纸吸取,捎待片刻,使酵母菌全部沉降到血球计数室内.(5)计数时,如果使用16格×25格规格的计数室,要按对角线位,取左上,右上,左下,右下4个中格(即100个小格)的酵母菌数.如果规格为25格×16格的计数板,除了取其4个对角方位外,还需再数中央的一个中格(即80个小方格)的酵母菌数.(6)当遇到位于大格线上的酵母菌,一般只计数大方格的上方和右方线上的酵母细胞(或只计数下方和左方线上的酵母细胞).(7)对每个样品计数三次,取其平均值,按下列公式计算每1ml菌液中所含的酵母菌个数.3.计算公式(1)16格×25格的血球计数板计算公式:酵母细胞数/ml=100小格内酵母细胞个数/100×400×104×稀释倍数(2)25格x16格的血球计数板计算公式:酵母细胞数/ml=80小格内酵母细胞个数/80×400×104×稀释倍数4.血球计数板的清洁血球汁数板使用后,用自来水冲洗,切勿用硬物洗刷,洗后自行晾干或用吹风机吹干,或用95%的乙醇,无水乙醇,丙酮等有机溶剂脱水使其干燥.通过镜检观察每小格内是否残留菌体或其他沉淀物.若不干净,则必须重复清洗直到干净为止.实验六微生物的显微直接计数法一、实验目的了解血球计数板的构造、计数原理和计数方法，掌握显微镜下直接计数的技能。
血球计数板实验报告
一、实验目的1. 熟悉血球计数板的使用方法。
2. 学习微生物计数的基本原理和操作技巧。
3. 通过计数，了解酵母菌种群数量的变化规律。
二、实验原理血球计数板是一种常用的微生物计数工具，其计数原理是将一定稀释度的微生物悬液滴入计数室中，在显微镜下直接计数。
血球计数板通常由厚玻璃制成，中间有两个计数池，每个计数池内画有9个大方格，大方格内再分为25个中方格，每个中方格又分为16个小方格。
通过计数大方格内的微生物数量，可以计算出单位体积内微生物的总数。
三、实验材料1. 血球计数板2. 显微镜3. 酵母菌悬液4. 稀释液5. 移液器6. 试管7. 玻璃棒四、实验步骤1. 将血球计数板和盖片用擦试干净，并将盖片盖在计数板上。
2. 用移液器吸取适量酵母菌悬液，滴入计数池边缘，使悬液自行渗入计数池中。
3. 待悬液稳定后，将计数板置于显微镜载物台上，调整显微镜焦距，使计数室清晰可见。
4. 选择计数室中的一个大方格，按照从左上角到右下角的顺序，依次计数大方格内的微生物数量。
5. 计数完成后，计算每个大方格的平均微生物数量。
6. 根据稀释倍数，计算出单位体积内微生物的总数。
五、实验结果与分析本次实验共计数了5个大方格，每个大方格的平均微生物数量分别为：200、250、300、350、400。
根据稀释倍数，计算出单位体积内酵母菌的总数约为2.5×10^6个/mL。
从实验结果可以看出，酵母菌种群数量在一定时间内呈现增长趋势，这与酵母菌的生长特性相符。
六、实验总结1. 血球计数板是一种简单、方便、准确的微生物计数工具。
2. 在进行微生物计数时，应注意操作规范，避免误差。
3. 通过本次实验，加深了对微生物计数原理和操作技巧的理解。
七、注意事项1. 计数前应确保血球计数板和盖片干净、无尘。
2. 滴加悬液时，应避免产生气泡。
3. 计数时，应尽量保持显微镜焦距不变。
4. 计数过程中，应避免人为误差。
通过本次实验，我们掌握了血球计数板的使用方法，并了解了酵母菌种群数量的变化规律。
微生物显微镜直接计数法和死活细胞的鉴定
实验四 微生物显微镜直接计数法和死活细胞的鉴定 以及四大类微生物菌落形态的比较和识别微生物显微镜直接计数法一、实验目的1、学习使用血球记数板测定微生物数量的方法。
2、学习并掌握形态观察及死活细胞的鉴别方法。
二、实验原理酵母菌显微直接计数—血球计数板三、实验材料显微镜、血球记数板、酵母菌悬液、盖玻片、无菌滴管、吸水纸、擦镜纸.四、实验步骤1、取清洁无油的血球计数板，在计数室上面加盖血盖片。
2、取酵母菌液，摇匀，用滴管由盖玻片边缘滴一小滴，使菌液自行渗入，计数室内不得有气泡。
3、用10×(40x)镜观察并将计数室移至视野中央。
4、在10×(40x)镜下计数：计数5个中格的平均值，最后再换算到每mL 菌液中的含菌数。
注意事项：计上不计下，计左不计右。
出芽计一半。
五、实验结果将显微计数结果记录于下表中。
T 表示五个中方格中的总菌数。
各中格中菌数T二室平均值个/ml12345第一室第二室六、问题与讨论在显微镜下直接测定微生物数量有什么优缺点？有何改进方法？②酵母菌死活细胞的鉴定一、实验原理美蓝是一种无毒的染料，它的氧化型呈蓝色，还原型无色。
用美蓝对酵母的活细胞进行染色时，由于细胞的新陈代谢作用，细胞内具有较强的还原能力，使美蓝由蓝色的氧化型变为无色的还原型。
因此，具有还原能力的酵母活细胞是无色的，而死细胞或代谢作用微弱的衰老细胞则呈蓝色，借此即可对酵母菌的死活细胞进行鉴别。
二、实验材料酵母菌悬液、0.1 ％吕氏碱性美蓝染色液显微镜、载玻片、盖玻片。
三、实验步骤美蓝镜片的观察1）在载玻片中央加一滴0.1%吕氏碱性美蓝染色掖，然后按无菌操作用吸取计数时酵母菌样品液放在染液中，混合均匀。
2）用镊子取一块盖玻片，先将一边与菌液接触，然后慢慢将盖玻片放下使其盖在菌液上。
3）将制片放置约1min后镜检，低倍镜到高倍镜观察，根据颜色来区别死活细胞。
注意事项1、加染液不宜过多或过少，否则，在盖上盖玻片时，菌液会溢出或出现大量气泡而影响观察。
实验—血球计数板的使用
一、血球计数板的使用原理显微镜直接计数法是将小量待测样品的悬浮液置于一种特别的具有确定面积和容积的载玻片上（又称计菌器），于显微镜下直接计数，然后推算出含菌数的一种方法。
血球计数板是常用的计菌器之一。
血球计数板是一种专门用于计算较大单细胞微生物的一种仪器，由一块比普通载玻片厚的特制玻片制成的玻片中有四条下凹的槽，构成三个平台。
中间的平台较宽，其中间又被一短横槽隔为两半，每半边上面刻有一个方格网。
方格网上刻有9个大方格，其中只有中间的一个大方格为计数室。
这一大方格的长和宽各为1mm，深度为0.1mm，其容积为0.1mm3，即1mm×1mm×0.1mm方格的计数板；大方格的长和宽各2mm，深度为0.1mm，其容积为0.4mm3，即2mm×2mm×0.1mm方格的计数板。
在血球计数板上，刻有一些符号和数字，其含义是：XB-K-25为计数板的型号和规格，表示此计数板分25个中格；0.1mm 为盖上盖玻片后计数室的高；1/400mm2表示计数室面积是1mm2，分400个小格，每小格面积是1/400 mm2。
计数室通常也有两种规格：一种是16×25型，即大方格内分为16中格，每一中格又分为25小格；另一种是25×16型，即大方格内分为25中格，每一中格又分为16小格。
但是不管计数室是哪一种构造，它们都有一个共同的特点，即每一大方格都是由16×25=25×16=400个小方格组成。
1．16×25型的计数板将计数室放大，可见它含16中格，一般取四角：1、4、13、16四个中方格（100个小方格）计数。
将每一中格放大，可见25个小格。
计数重复3次，取其平均值。
计数完毕后，依下列公式计算：酵母细胞个数／1mL=100个小方格细胞总数/100 ×400×10000×稀释倍数2．25×16型的计数板中央大方格以双线等分成25个中方格，每个中方格又分成16个小方格，供细胞计数用。
血球计数板
血球计数板血球计数板被用以对人体内红、白血球进行显微计数之用，也常用于计算一些细菌、真菌、酵母等微生物的数量，是一种常见的生物学工具1含义血球计数板用优质厚玻璃制成。
每块计数板由H形凹槽分为2个同样的计数池。
计数池两侧各有一支持柱，将特制的专用盖玻片覆盖其上，形成高0.10mm的计数池。
计数池画有长、宽各3.0mm的方格，分为9个大方格，每个大格面积为1.0毫米X1.0毫米=1.0平方毫米;容积为1.0平方毫米X0.1毫米=0.1立方毫米。
其中，中央大方格用双线分成25个中方格，位于正中及四角5个中方格是红细胞计数区域（图中浅红色区域），每个中方格用单线划分为16个小方格。
四角的4个大方格是白细胞计数区域（图中浅蓝色区域），每个大方格用单线划分为16个中方格。
根椐国际标准局（NBS）规定，大方格每边长度允许误差为±1%。
说明：上图红色方框代表一个大方格；绿色方框代表一个中方格，两种中方格的面积不一样大；蓝色方框代表一个小方格。
2基本构造血球计数板是一块特制的厚型载玻片，载玻片上有四个槽构成三个平台。
中间的平台较宽，其中间又被一短横槽分隔成两半，每个半边上面各刻有一小方格网，每个方格网共分九个大方格，中央的一大方格作为计数用，称为计数区。
计数区的刻度有两种：一种是计数区分为16个中方格（大方格用三线隔开），而每个中方格又分成25个小方格；另一种是一个计数区分成25个中方格（中方格之间用双线分开），而每个中方格又分成16个小方格。
但是不管计数区是哪一种构造，它们都有一个共同特点，即计数区都由400个小方格组成。
计数区边长为1mm，则计数区的面积为lmm2，每个小方格的面积为1/400mm2。
盖上盖玻片后，计数区的高度为0.1mm，所以每个计数区的体积为0.1mm3，每个小方格的体积为1/4000mm3。
使用血球计数板计数时，先要测定每个小方格中微生物的数量，再换算成每毫升菌液（或每克样品）中微生物细胞的数量。
微生物实验显微镜直接计数法
1.血球计数板法
利用计数板上有固定体积和精确刻度的两个计数室进行
计数，是常用的在显微镜下对细胞数目进行计数的方法。
（1）计数室体积：正方形，边长为1mm，深0.1mm→盖上 盖玻片后，容积为0.1mm3。 （2）计数室刻度的规格
具有直观、快速等优点，但误差较大，不适合细菌计数。
16×25型：16个中方格，每个中方格分25个小格；
25×16型：25个中方格，每个中方格分16个小格。
计数室
（3）计数和计算方法
我们采用的是25×16的，计数时查5个中方格的总
菌数。如图：
5个方格的总菌数
计算：1个计数室的总菌数=A/5×25×B
稀释倍数
1g（ml）样品中的总菌数=A/5×25×10×1000×B
=50,000A×B个
三、实验材料
1.菌种：酵母菌（Saccharomyces cerevisiae）悬液(已
稀释100倍)
2.器具：显微镜、血球计数板、吸管、盖玻片。
四、实验步骤
1.检查计数板
检查计数板是否有破损。
2.镜检计数室
在加样前，先对计数板的计数室进行镜检。若有污物， 则需清洗后才能进行计数。
3.加样品
在清洁干燥的血球计数板盖上盖玻片，再用细口滴管 让菌液沿缝隙靠毛细渗透作用自行进入计数室，一般
六、作业
显微直接计数结果
÷Ð · Ö · ½ · ñ Ö Ð ¾ ú Ê ý 1 Ú Ò µ » Ê Ò Байду номын сангаас ¶ µ þ Ê Ò 2 3 4 5
5个中格总数
þ Ê ¶ Ò
A
B
100
ú Ê ¾ ý /ml Æ ½ ¾ ù Ö µ
食品微生物实验技术--实验八血球计数板的使用及运用
五、思考题
1．计算每毫升(每克 所测样品的含菌数 ．计算每毫升 每克 所测样品的含菌数? 每克)所测样品的含菌数 2．用血球计数板测定微生物细胞数量有何 ． 优缺点?
5 .清洗：计数完毕后，血球计数 清洗： 清洗 计数完毕后， 板直接用水冲洗， 板直接用水冲洗，然后吸干或晾 最后用擦镜纸包好收藏， 干，最后用擦镜纸包好收藏，注 意不得用粗糙物品擦抹中央平板， 意不得用粗糙物品擦抹中央平板， 以免损坏小格刻度。 以免损坏小格刻度。
(二) 配制下次用培养基 二
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
1.明胶液化培养基（试管柱体） : 28支/班 明胶液化培养基（试管柱体） 明胶液化培养基 支班 2.糖发酵培养基 每种糖28支/班 ,乳糖 2.糖发酵培养基: 每种糖28支/班 ,乳糖/葡 糖发酵培养基: 乳糖/葡 萄糖发酵液, 萄糖发酵液 9mL/支 支 3.淀粉培养基 三角瓶装 500mL /班 淀粉培养基(三角瓶装 淀粉培养基 三角瓶装): 班
4. 测定菌数：静置几分钟后，先置低倍镜下观察，找到中央平台上 测定菌数：静置几分钟后，先置低倍镜下观察， 的小方格网后，转换高倍镜进行计数。计数时，如用16× 规格 的小方格网后，转换高倍镜进行计数。计数时，如用 ×25规格 的计数板，则取左上，右上，左下，右下四种格(共 个小格)的 的计数板，则取左上，右上，左下，右下四种格 共100个小格 的 个小格 酵母菌数；如用25× 规格的计数板 则除了取左上，右上， 规格的计数板， 酵母菌数；如用 ×16规格的计数板，则除了取左上，右上，左 右下四个中格外，还需加数中央的一个中格(共 个小格 个小格)的 下，右下四个中格外，还需加数中央的一个中格 共80个小格 的 酵母菌。在分别求出100个小格或 个小格的酵母菌平均菌数后， 个小格或80个小格的酵母菌平均菌数后 酵母菌。在分别求出 个小格或 个小格的酵母菌平均菌数后， 按下式计算： 按下式计算： 每毫升菌液的菌数=每小格平均菌数× 每毫升菌液的菌数 每小格平均菌数×4000×1000×稀释倍数 每小格平均菌数 × ×
用血球计数板计数酵母菌个数的计算方法
用血球计数板计数酵母菌个数的计算方法血球计数板是一种用于计数细胞的装置，通常用于测定血液中各类细胞的数量。
然而，血球计数板也可以应用于计数其他类型的微生物，如酵母菌。
下面将详细介绍使用血球计数板计数酵母菌个数的计算方法。
1.准备工作-准备血球计数板：将血球计数板放在平整、干净的工作台上。
-准备显微镜：确保显微镜的放大倍数适合酵母菌的观察。
2.制备样品-培养酵母菌：选择适用于酵母菌的培养基，并在温度适宜的条件下培养酵母菌至合适的生长阶段。
-稀释样品：取适量酵母菌培养物，并使用物理或化学方法将其稀释至适宜的浓度。
常规稀释范围为10^-1至10^-73.接种样品-将适量的稀释后的酵母菌样品吸入移液管中。
-用移液管加样品到血球计数板的一个大格中。
重复这个过程，直到填充至少3个大格。
-轻轻拍打血球计数板，以使酵母菌分布均匀。
4.观察和计数-将装有血球计数板的试管放置在显微镜下，以便于观察。
-调节显微镜的焦距，以清晰地观察酵母菌。
-随机选择一个大格开始计数。
对于每个大格，观察所有四个角以及中央的九个小格。
计数以一个有效酵母菌可见于格子线与其相交的点为依据。
-对于每个大格中酵母菌的计数结果，将计数值乘以10（表示小格数），然后累加得到总数。
例如，如果一个大格中计数到45个酵母菌，总数应为45x10=450。
-重复以上步骤，直到至少3个大格被计数。
如果计数结果在这些大格之间差异较大，则需要继续计数至一个统一的结果。
5.计算酵母菌的浓度-计算平均数：将各个大格的计数结果相加，并除以计数的大格数，得到平均数。
-计算总体浓度：将平均数乘以初始的稀释倍数。
例如，如果初始稀释倍数为10^-4且平均数为80，总体浓度应为80x10^4=800,000CFU/mL （菌落形成单位/毫升）。
-根据需要，可以根据大格的面积进行进一步的修正。
需要注意的是，血球计数板通常用于测量血液细胞的数量，而不是酵母菌等微生物。
因此，使用血球计数板计数酵母菌需要一些修正和适应。
微生物计数法
微生物计数法微生物计数法1）血球计数板法:血球计数板是一种有特别结构刻度和厚度的厚玻璃片，玻片上有四条沟和两条嵴，中央有一短横沟和两个平台，两嵴的表比两平台的表面高0.1mm，每个平台上刻有不同规格的格网，中央0.1mm2面积上刻有400个小方格。
通过油镜观察，统计一定大格内微生物的数量，即可算出1毫升菌液中所含的菌体数。
这种方法简便，直观，快捷，但只适宜于单细胞状态的微生物或丝状微生物所产生的孢子进行计数，并且所得结果是包括死细胞在内的总菌数。
2）染色计数法：为了弥补一些微生物在油镜下不易观察计数，而直接用血球计数板法又无法区分死细胞和活细胞的不足，人们发明了染色计数法。
借助不同的染料对菌体进行适当的染色，可以更方便的在显微镜下进行活菌计数。
如酵母活细胞计数可用美蓝染色液，染色后在显微镜下观察，活细胞为无色，而死细胞为蓝色。
3）比例计数法：将已知颗粒（如霉菌孢子或红细胞）浓度的液体与一待测细胞浓度的菌液按一定比例均匀混合，在显微镜视野中数出各自的数目，即可得未知菌液的细胞浓度。
这种计数方法比较粗放。
并且需要配制已知颗粒浓度的悬液做标准。
4）液体稀释法：对未知菌样做连续十倍系列稀释，根据估计数，从最适宜的三个连续的10倍稀释液中各取5毫升试样，接种1毫升到3组共15只装培养液的试管中，经培养后记录每个稀释度出现生长的试管数，然后查最大或然数表MPN（most probablynumber）得出菌样的含菌数，根据样品稀释倍数计算出活菌含量。
该法常用于食品中微生物的检测，例如饮用水和牛奶的微生物限量检查。
5）平板菌落计数法：这是一种最常用的活菌计数法。
将待测菌液进行梯度稀释，取一定体积的稀释菌液与合适的固体培养基在凝固前均匀混合，或将菌液涂布于已凝固的固体培养基平板上。
保温培养后，用平板上出现的菌落数乘以菌液稀释度，即可算出原菌液的含菌数。
一般以直径9cm的平板上出现50-500个菌落为宜。
但方法比较麻烦，操作者需有熟练的技术。
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微生物得计数——血球计数板法
【摘要】测定微生物细胞数量得方法很多，有分光光度法、显微直接计数法与平板计数法。
分光光度法比较简便，易操作，但就是会使数据严重偏大。
而平板计数法则会使实验数据严重偏小.ﻫ显微计数法适用于各种含单细胞菌体得纯培养悬浮液,如有杂菌或杂质，常不易分辨.菌体较大得酵母菌或霉菌孢子可采用血球计数板,一般细菌则采用彼得罗夫·霍泽(PetｒｏｆHausｓｅr)细菌计数板。
两种计数板得原理与部件相同，只就是细菌计数板较薄,可以使用油镜观察。
而血球计数板较厚,不能使用油镜，计数板下部得细菌不易瞧清.本实验采用血球计数板法，主要目得就是了解血球计数板法得构造与使用方法，学会用血球计数板对酵母菌细胞进行计数。
一、实验目得与要求
１、了解微生物计数常用得三种方法：分光光度法;平板计数法；血球计数板法。
2、了解血球计数板得构造与使用方法。
3、学会用血球计数板对酵母细胞进行计数。
二、基本原理
利用血球计数板在显微镜下直接计数，就是一种常用得微生物计数方法。
此法得优点就是直观、快速.将经过适当稀释得菌悬液（或孢子悬液）放在血球计数板载玻片与盖玻片之间得计数室中，在显微镜下进行计数。
由于计数室得容积就是一定得（０、1mｍ2），所以可以根据在显微镜下观察到得微生物数目来换算成单位体积内得微生物总数目。
由于此法计得得就是活菌体与死菌体得总与，故又称为总菌计数法.
血球计数板,通常就是一块特制得载玻片，其上由四条槽构成三个平台。
中间得平台又被一短横槽隔成两半，每一边得平台上各刻有一个方格网,每个方格网共分九个大方格,中间得大方格即为计数室，微生物得计数就在计数室中进行。
计数室得刻度一般有两种规格,一种就是一个大方格分成１６个中方格，而每个中方格又分成25个小方格;另一种就是一个大方格分成25个中方格，而每个中方格又分成16个小方格。
但无论就是哪种规格得计数板,每一个大方格中
得小方格数都就是相同得,即1６×25=400小方格。
每一个大方格边长为１mm，则每一大方格得面积为1ｍm2，盖上盖玻片后，载玻片与盖玻片之间得高度为0.1mm，所以计数室得容积为０.1ｍm３。
在计数时，通常数五个中方格得总菌数，然后求得每个中方格得平均值，再乘上16或25，就得出一个大方格中得总菌数，然后再换算成1ml菌液中得总菌数.
下面以一个大方格有2５个中方格得计数板为例进行计算：设五个中方格中总菌数为A，菌液稀释倍数为B，那么，一个大方格中得总菌数
因1ml=1cm３＝1000mm３，
＝50００0A·B（个)
同理,如果就是16个中方格得计数板，设五个中方格得总菌数为A’,则三、实验材料
1)菌种：酿酒酵母菌
２）用品:显微镜、血球计数板、酒精灯、盖玻片、接种环、番红染液、胶头滴管。
四、实验方法
1、实验流程图
2、实验步骤
1)镜检计数室:在加样前，先对计数板得计数室进行镜检。
若有污物,则需清洗后才能进行计数.
２）将酿酒酵母菌悬液进行适当稀释，菌液如不浓,可不必稀释。
3）取洁净得血球计数板一块，在计数区上盖上一块盖玻片。
然后在显微镜下找到计数室。
若计数室沾有杂质或者菌体，要用蒸馏水冲洗计数板,用滤纸吸干其上得水分。
然后再放到显微镜下找到计数室。
4）将酵母菌悬液摇匀,用滴管吸取少许，从计数板中间平台两侧得沟槽内沿盖玻片得下边缘摘入一小滴(不宜过多)，让菌悬液利用液体得表面张力充满计数区，勿使气泡产生,并用吸水纸吸去沟槽中流出得多余菌悬液.
5）静置片刻,先在低倍镜下找到计数区后，再转换高倍镜观察并计数。
由于生活细胞得折光率与水得折光率相近，观察时应减弱光照得强度.
6）计数时若计数区就是由1６个大方格组成，按对角线方位，数左上、左下、右上、右下得4个大方格（即100小格)得菌数。
如果就是25个大方格组成得计数区,除数上述四个大方格外，还需数中央l个大方格得菌数（即80个小格）。
如菌体位于大方格得双线上，计数时则数上线不数下线,数左线不数右线，以减少误差.本实验采用２5格×１６格得血球计数板。
计数时应数５个大方格。
７)计数.每个样品重复计数２—3次（每次数值不应相差过大,否则应重新操作），求出每一个小格中细胞平均数（N),按公式计算出每ml(ｇ)菌悬液所含酵母菌细胞数量。
８）测数完毕,取下盖玻片，用水将血球计数板冲洗干净，切勿用硬物洗刷或抹擦,以免损坏网格刻度。
洗净后自行晾干或用吹风机吹干，放入盒内保存.
9)计算结果。
可用以下公式进行计算
(１）１6格×25格得血球计数板计算公式:ﻫ细胞数/ml=１00小格内细胞个数／100×40０×10０00×稀释倍数
(2）25格×16格得血球计数板计算公式:
细胞数/ml=８０小格内细胞个数/80×4００×100０0×稀释倍数
五、实验结果
六、结论与分析
1、误差来源
本次试验中我们组用得就是2号酵母培养液,就是本次试验所用得酵母培养液中浓度最高得培养液。
但就是经过老师分析,实验数据仍然偏大得一点.产生这种误差得原因大概如下:
①酵母细胞计数得误差分别来源于技术误差与固有误差.其中由于操作人员不注意细节，器材处理、使用不当，稀释不准确,细胞识别错误等因素所造成得误差属技术误差;而由于仪器（计数板、盖片、吸管等)不够准确与精密带来得误差称仪器误差，由于细胞分布不均匀等因素带来得细胞计数误差属于分布误差或计数域误差（)。
②由于时间得关系,实验计数得次数太少，难以得到准确均匀得实验数据。
在实验过程中,操作人员也存在一定得不严谨性,导致实验结果产生误差。
由于没有足够多得平行数据,难以用科学得计数方法进行结果得计算,因此难以得到比较准确得实验数据。
因此，搞好酵母细胞计数得质量控制一般需采用以下措施。
ﻫ1)避免技术误差，纠正仪器误差ﻫ①所用器材均应清洁干燥，计数板、血盖片、微量吸管及刻度吸管得规格应符合要求或经过校正。
②严格操作,从消毒、稀释、加样到计数都应规范，尤其应注意得就是样品稀释要作到充分混匀.必须一次性充满计数室，防止产生气泡，充入细胞悬液得量以不超过计数室台面与盖玻片之间得矩形边缘为宜。
ﻫ2）缩小计数域误差或分布误差由于血细胞在充入计数室后呈随机分布或,而我们所能计数得细胞分布范围就是有限得,由此造成得计数误差称为计数域误差或分布误差。
缩小这种误差得有效方法就就是尽量扩大细胞计数范围与计数数目,一般先进行误差估计，然后决定所需计数得数目与计数范围,只要能将误差控制在允许范围内即可。
2、不足之处
血球计数板在显微镜下直接进行测定。
它观察在一定得容积中得微生物得个体数目，然后推算出含菌数，简便快捷。
但就是在计数时包括死活细胞均被计算在内，还有微小杂物也被计算在内.这样得出结果往往偏高,因此适用于对形态个体较大得菌体或孢子进行计数。
七、思考题
1、试述血球计数板得计数原理。
为什么用两种规格不同得计数板计数同一样品,结果就是一样得？
答:每块计数板由H形凹槽分为2个同样得计数池计数池两侧各有一支持柱,将特制得专用盖玻片覆盖其上，形成高０、10ｍｍ得计数池。
计数池画有长、宽各3、０mm得方格，分为９个大方格，每个大格面积为1、0mm;、容积为０、1mm,
中央大方格用双线分成2５个中方格,位于正中及四角5个中方格就是红细胞计数区域,用单线划分为16个小方格。
四角得4个大方格就是白细胞计数区域,用单线划分为16个中方格。
血球计数板得计数原理：通过对一定数量得小格计数，根据相应小格所占得体积，可以推算出单位体积得溶液中微生物细胞得密度与总数.因为不同规格用不同得计算公式计算，最后得出得都就是微生物细胞得密度与总数，所以结果一样。