小动物生物发光活体成像的条件优化与技术扩展研究

［作者简介］ 王 豫，女，硕士，实验师，研究方向：放射生物学和肿
瘤实验治疗
［ ［
作者 通讯
单作位者］］万 军 周方事平数医坤据学，Ｔ科ｅｌ：学０１院０－６放６９射３１与２１辐７，射Ｅ医－ｍ学ａｉｌ研： ｚ究ｈｏ所ｕｐ，ｋ北＠京ｂｍ ｉ．１ａ０ｃ０．８ｃ５ｎ０
法可对标记物在动物个体中的分布、增长等进行活 体检测。 为了进一步提高此技术的检测灵敏度，扩 展可检测的技术参数范围，本研究观察了小鼠毛发 对光信号成像的影响，并将生物发光信号与 Ｘ 线两 者结合起来，扩展活体成像的检测效率和适用范围， 为今后小动物成像技术的推广奠定有力的基础。
美国 Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｌｉｇｈｔ 公司。
区域内的信号与细胞数是成正比的。
理 １．１．３ 实验仪器 小动物活体成像仪（ 德国伯托
ＬＢ９８３ ＮＣ１００Ｕ）。 １．２ 实验方法
ｏ
１将．２早．１先 构稳建定的克稳隆定癌高细表胞株达在的体荧内光发素光酶强细度胞的株检乳测腺’癌 ：ｙ
细胞（４Ｔ－１－Ｌｕｃ ＋）进行胰酶消化计数并调整细胞浓
２ 结果
随着时间的延长，小鼠的原位瘤越来越大，实时显示 肿瘤的信号值逐渐增强。
２．１ 生物发光成像检测的灵敏度
２．３ 生物发光结合 Ｘ 线的活体成像
Ｂ ＢＡＬＢ ／ｃ 小 鼠 皮 下 注 射 乳 腺 癌 细 胞 （ ４Ｔ－１－
由于标记细胞在动物体内复杂的定位，直观的
Ｌｕｃ ＋），注万入方荧数光据素酶底物后 ５ ｍｉｎ 开始成像检测。 观测技术虽然可以从动物体表的信号水平直接获得
恶性肿瘤是严重威胁人类健康的重大疾病，人 们对肿瘤发生机制和治疗新药的研究一直没有中断 过，好的实验动物模型和观察方法对于开展此类研 究是非常重要的。 活体成像技术是指应用影像学的 方法，对活体状态下的生物学过程进行组织、细胞和 分子水平的定性和定量研究，随着分子影像学技术 的发展，在医学、生物学、药学等相关领域应用迅速 扩展［１ ～３］ 。 利用生物发光（ ｂｉｏｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ ） 技术标 记肿瘤细胞，经皮下、静脉或原位接种后，该检测方
毛处理。 图 ２Ａ 中的检测结果可以清楚的看出，能 检测到皮下注射 ５０ 个发光细胞的信号值。 在图 ２Ｂ 中也显出信号值随注射细胞的浓度增加而上升，可
ｄｉｇｏ 软件处理，计算出此区域发出的光子数，检测其 见信号区域内的信号与细胞数也是成正比的。
发光细胞在活体动物内的灵敏度（ 参数：曝光时间
５ ｍｉｎ，ｂｉｎｎｉｎｇ 值 ４ ×４）。
１．２．４ 建立 Ｘ 线结合生物发光成像检测 采用 ｉｎ－ 与底物反应即可产生光信号，从成像图 ３ 中可以看
ｄｉｇｏ 分子成像系统，将人乳腺癌细胞（４Ｔ－１－Ｌｕｃ ＋） 皮 出，肿瘤接种 １ 周后可检测到荧光信号并见清晰的
下接种 １ ×１０６ ／ｍｌ 于裸鼠肺原位，接种 ２０ ｄ 后检测 皮下肿瘤，表明细胞在裸鼠体内不断增殖形成肿瘤；
裸小鼠右前肢的皮下接种（１ ×１０５ ／ｍｌ），在肿瘤接 ２．２ 裸鼠在体肿瘤的生物发光成像
种 １ 周后开始成像检测，获得肿瘤组织中活细胞的
将已经构建的人肝癌细胞（ Ｈｕｈ－７－Ｌｕｃ ＋） 皮下
丽ａ００ 光子值（参数：曝光时间 ３ ｍｉｎ，ｂｉｎｎｉｎｇ 值 ４ ×４）。
接种 １ ×１０５ ，实验中观察到肿瘤接种在皮下后通过
（４Ｔ－１－Ｌｕｃ ＋）； 人 肝 癌 细 胞 株 （ Ｈｕｈ－７－Ｌｕｃ ＋）， 在 含 个发光细胞可测得明显的信号值。 当皮下注射 ５０
１０％胎牛血清的 ＤＭＥＭ 培养液（Ｇｉｂｃｏ 公司）中，５％ 个发光细胞时，系统采集不到信号。 图 １Ｂ 中显示
ａＯ ０００ ａ０００ ａ００ 色０ 色 ０ ＣＯ２ ３７℃孵箱恒温培养。 Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ 发光底物购自 出信号值随注射细胞的浓度增加而上升，可见信号
发光，通过 Ｘ 线模块成像 信号 作为 明 场 （ 结 构 图 ２ 周后红色区域信号增强，表明肿瘤体积逐渐生长，
像），检测发光信号作为暗场（检测功能图像），并进 ４ 周时，信号区有空白区域，表明肿瘤中心出现营养
行拟合（ 参数：曝光时间 １ ｍｉｎ，ｂｉｎｎｉｎｇ 值 ４ ×４）。
缺乏性坏死，没有荧光信号产生。 可以清楚地看到
［中图分类号］ Ｒ４４５．１，Ｒ８１２
［ 文献标志码］ Ａ
［文章编号］ １６７４－９９６０（２０１３）０４－０２７１－０３ ＤＯＩ：１０．７６４４ ／ｊ．ｉｓｓｎ．１６７４－９９６０．２０１３．０４．００８
Ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ ｏｆ ｂｉｏｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ ｉｍａｇｉｎｇ ｉｎ ｖｉｖｏ ｉｎ ｓｍａｌｌ ａｎｉｍａｌｓ
×３００ １．２．２ 排除干扰因素的发光检测 上述实验是在
ＢＡＬＢ ／ｃ 小鼠未脱毛的情况下检测的。 由于小动物
毛发有相应阻挡信号的作用，所以我们做了同批次
小鼠的脱毛与未脱毛的对比实验。 将上述实验动物
进行局部的 脱 毛 处 理 后， 重 复 上 述 步 骤 检 测 成 像。
（参数：曝光时间 ５ ｍｉｎ，ｂｉｎｎｉｎｇ 值 ４ ×４）。
倡Ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇ ａｕｔｈｏｒ，Ｔｅｌ：０１０－６６９３１２１７， Ｅ－ｍａｉｌ： ｚｈｏｕｐｋ＠ｂｍｉ．ａｃ．ｃｎ
［Ａｂｓｔｒａｃｔ］ Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ Ｔｏ ｅｘｐｌｏｒｅ ｔｈｅ ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ ａｎｄ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ａｐｐｌｉｃａｂｉｌｉｔｙ ｏｆ ｂｉｏｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ ｉｎ ｖｉｖｏ ｉｍａｇｉｎｇ ｔｅｃｈ－ ｎｉｑｕｅ ａｎｄ ｔｏ ａｃｈｉｅｖｅ ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ ａｎｄ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ ．Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｂｒｅａｓｔ ｃａｎｃｅｒ ｃｅｌｌｓ ４Ｔ－１－ Ｌｕｃ ＋ ｏｒ ｌｉｖｅｒ ｃａｎｃｅｒ ｃｅｌｌｓ Ｈｕｈ －７－Ｌｕｃ ＋ ｗｉｔｈ ｓｔａｂｌｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ ｗｅｒｅ ｉｍｐｌａｎｔｅｄ ｓｕｂｃｕｔａｎｅｏｕｓｌｙ ｉｎｔｏ ＢＡＬＢ ／ｃ ｍｉｃｅ．Ｔｈｅ ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ ａｎｄ ｅｆｆｅｃｔ ｏｎ ｔｈｅ ｈａｉｒ ｗｅｒｅ ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅｄ ｕｓｉｎｇ ｔｈｅ ｓｍａｌｌ ａｎｉｍａｌ ｉｎ ｖｉｖｏ ｉｍａｇｅｒ ｏｆ ｂｉｏｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ ｓｉｇ － ｎａｌｓ．Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ ｗａｓ ｐｅｒｆｏｒｍｅｄ ｂｙ ｃｏｍｂｉｎｉｎｇ ｂｉｏｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ ｗｉｔｈ Ｘ －ｒａｙ．Ｒｅｓｕｌｔｓ Ｔｈｅ ｈａｉｒ ａｓ ｓｈｏｗｅｄ ａｒｅ ｏｂｖｉ － ｏｕｓ ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｂｉｏｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ ｓｉｇｎａｌｓ ｅｍｉｔｔｅｄ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｃａｎｃｅｒ ｃｅｌｌｓ ｉｍｐｌａｎｔｅｄ ｉｎ ＢＡＬＢ ／ｃ ｍｉｃｅ．Ｔｈｅ ｏｐｔｉｃａｌ ｓｉｇｎａｌ ｃｏｕｌｄ ｂｅ ｄｅｔｅｃｔｅｄ ｉｎ ｔｈｅ ｃｅｌｌｕｌａｒ ｍａｓｓ ｏｆ ５０ ｃｅｌｌｓ ｗｈｅｎ ｌｏｃａｌ ｈａｉｒ ｗａｓ ｒｅｍｏｖｅｄ ．Ｔｈｅ ｉｍａｇｉｎｇ ｍｏｄｅｌ ｅｓｔａｂ－ ｌｉｓｈｅｄ ｂｙ ｃｏｍｂｉｎｉｎｇ Ｘ－ｒａｙ ｗｉｔｈ ｂｉｏｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ ｃｏｕｌｄ ｎｏｔ ｏｎｌｙ ｄｅｔｅｃｔ ｔｈｅ ｓｔｒｅｎｇｔｈ ｏｆ ｏｐｔｉｃａｌ ｓｉｇｎａｌｓ ｅｍｉｔｔｅｄ ， ｂｕｔ ａｌｓｏ ｃｌｅａｒ－ ｌｙ ｌｏｃａｔｅ ｓｏｍｅ ｏｒｇａｎｓ ａｎｄ ｔｈｅ ｏｒｉｇｉｎ ｏｆ ｏｐｔｉｃａｌ ｓｉｇｎａｌｓ ｏｒ ｐａｔｈｏｌｏｇｉｃａｌ ｔｉｓｓｕｅ ．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ Ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｂｉｏｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ ｉｍａｇｉｎｇ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ ｈａｓ ｂｅｅｎ ａｃｈｉｅｖｅｄ ．Ａ ｉｍａｇｉｎｇ ｍｏｄｅｌ ｏｆ ｃｏｍｂｉｎｉｎｇ Ｘ －ｒａｙ ａｎｄ ｂｉｏｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ ｉｓ ｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄ ｆｏｒ ｔｈｅ ｐｕｒ － ｐｏｓｅ ｏｆ ｗｉｄｅｎｉｎｇ ｔｈｅ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｓｍａｌｌ ａｎｉｍａｌ ｉｎ ｖｉｖｏ ｉｍａｇｉｎｇ． ［Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ］ ｉｍａｇｉｎｇ ｉｎ ｖｉｖｏ；ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ；ｂｉｏｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ；Ｘ－ｒａｙ；ｃａｎｃｅｒ ｃｅｌｌ
粥Ｊ ００ 度为 ５ ×１０５ ／ｍｌ。 用 ＰＢＳ 将其梯度稀释，吸取混合
均匀的细胞 １００ μｌ，实施 ＢＡＬＢ ／ｃ 小鼠的皮下注射。
图 １ ＢＡＬＢ ／ｃ 小鼠皮下注射发光 细胞与底物 混合物 的 生 物 发光成像结果（ 不脱毛）
本组实验共 ６ 只小鼠，分别注射终浓度为５０ ０００、
Ａ ．肿 瘤 细 胞 的 体 内 成 像 ； Ｂ ．体 内 肿 瘤 细 胞 的 光 子 值
图 ２ ＢＡＬＢ ／ｃ 小鼠皮下注射稳转 发光细胞与 底物混 合 物 的
ｏ口寸００ １．２．３ 活体动物肿瘤的生物发光成像 将已经构
生物发光成像结果（ 局部脱毛处理） Ａ ．肿 瘤 细 胞 的 体 内 成 像 ； Ｂ ．体 内 肿 瘤 细 胞 的 光 子 值
建好的人肝癌细胞（ Ｈｕｈ－７－Ｌｕｃ ＋），进行雄性 ｎｕ ／ｎｕ
军事医学 ２０１３ 年 ４ 月 第 ３７ 卷 第 ４ 期 Ｍｉｌ Ｍｅｄ Ｓｃｉ，Ｖｏｌ ３７， Ｎｏ ４， Ａｐｒ， ２０１３
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小动物生物发光活体成像的条件优化与技术扩展研究
王 豫，关 华，宋 曼，王晓迪，高 毅，周平坤
［摘要］ 目的 为发掘生物发光活体成像技术的灵敏性和应用潜力，进行在体检测条件的优化和技术扩展。 方法
卅 ５０００、５００、５０、５ 个细胞，以及一个仅注射底物的小
鼠作为空白对照。 实验动物于成像前注射２００ μｌ
在相同条件下对同批次 ＢＡＬＢ ／ｃ 小鼠进行了脱
被３００ 荧光素酶底物（１５wk.baidu.comｍｇ ／ｍｌ） ５ ｍｉｎ 后，戊巴比妥钠麻
醉放入成像暗箱平台，ｉｎｄｉｇｏ 操作软件完成图像分 析过程。 图像处理及数据分析采用仪器配备的 ｉｎ－
通过建立 Ｘ 结合发光的检测模型，实现了既能检测发光信号值强度大小，又能比较清晰地观测到部分脏器和发光
体（病变组织）的部位。 结论 实现了生物发光活体成像技术的检测条件优化，建立了 Ｘ 线结合发光新的检测模
式，为扩展小动物活体成像的应用范围奠定了基础。
［关键词］ 活体成像技术；荧光素酶；生物发光；Ｘ 线；癌细胞
ＷＡＮＧ Ｙｕ， ＧＵＡＮ Ｈｕａ， ＳＯＮＧ Ｍａｎ， ＷＡＮＧ Ｘｉａｏ－ｄｉ， ＧＡＯ Ｙｉ， ＺＨＯＵ Ｐｉｎｇ－ｋｕｎ倡
（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｒａｄｉａｔｉｏｎ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ， Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｍｉｌｉｔａｒｙ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ， Ｂｅｉｊｉｎｇ １００８５０，Ｃｈｉｎａ）
将稳定高表达荧光素酶的乳腺癌细胞（４Ｔ－１－Ｌｕｃ ＋） 和肝癌细胞（ Ｈｕｈ－７－Ｌｕｃ ＋） 接种于 ＢＡＬＢ ／ｃ 小鼠体内，通过活体
成像仪进行生物发光检测灵敏度和毛发的影响分析，利用生物发光结合 Ｘ 线扩展活体成像技术。 结果 毛发对小
鼠皮下接种的肿瘤细胞的生物发光成像有干扰作用，在局部剃除毛发小鼠内体可以检测到 ５０ 个细胞的光信号值。
１ 材料与方法
１．１ 材料 １．１．１ 实验动物 ＳＰＦ 级雄性 ＢＡＬＢ ／ｃ 小鼠，６ ～８ 周龄，体质量（２０ ±２）ｇ。 ＳＰＦ 级雄性 ｎｕ ／ｎｕ 裸小鼠， ６ ～８ 周龄，体质量（１８ ±２）ｇ。 均购自军事医学科学 院实验动物中心。 动物质量合格证号： ＳＣＸＫ－（ 军）
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军事医学 ２０１３ 年 ４ 月 第 ３７ 卷 第 ４ 期 Ｍｉｌ Ｍｅｄ Ｓｃｉ，Ｖｏｌ ３７， Ｎｏ ４， Ａｐｒ， ２０１３
２００７ －００４ 。 １．１．２ 实验细胞与试剂 采用本实验室早先构建
湖晒山辩 图 １Ａ 由左至右为依次注射细胞浓度为 ５０ ０００、
５０００、５００、５０、５ 以及空白对照小鼠。 从图 １Ａ 中可
的稳定高表达的荧光素酶细胞株：人乳腺癌细胞株 以看出，在此条件下曝光时间 ５ ｍｉｎ，皮下注射 ５００