神经毒理学方法_附件

四、分子生物学方法 神经生物学研究中常用的分子生物学方 法有基因的分子克隆，克隆后的基因在人 工体外系统或细胞中的表达，PCR扩增核酸 分子技术，原位杂交技术，基因芯片等。 如：2002年张增利报道了农药对小鼠脑 细胞组织c-fos、c-jun、mRNA 表达的影响； 2002年逯晓波报道了铅对幼鼠海马区Bcl-2、 Fas 蛋白表达的影响；2004年丁晓蓉综述了 基因芯片与脑衰老的研究进展。
可以说，神经毒理学的研究方法很多， 任何研究神经科学的方法如神经生物学、 神经生理学、神经生化学、神经病理学、 神经药理学、分子神经生物学等方法都适 用于神经毒理学。
虽说神经毒理学的研究方法很多，但是 这些方法是互为补充的，有些指标也只有 在结合其他相关指标时才能很好地予以解 释，实际上，由于神经系统的复杂性，单 一的指标是不可能全面评价神经毒性，因 此将不同指标组合起来进行成套实验是神 经毒性评价的主要研究方向。
具体方法如下：

一、动物神经系统疾病模型
1、帕金森病 经灵长目动物实验， MPTP(1-甲基4-苯基-1，2，3，6-四氢 吡啶) 作为能提供人类非常有意义的PD 动物模型而被接 受
2、迟发型神经病 鸡作为某些有机磷中毒后引起 迟发型神经病（OPIDN）的模型已被国际学术界 公认。

二、神经行为功能测试组合

三、学习和记忆功能测试
（一）、人体试验 韦克斯勒记忆量表、韦克斯勒成人智力量表和 临床记忆量表主要用来测试人的认知和记忆的能 力。 （二）、动物试验 1、小鼠Y型迷宫实验 2、小鼠跳台实验 3、小鼠避暗实验 4、大鼠穿梭实验（双向回避实验） 5、小鼠水迷宫实验

四、运动功能测试
（一）、人体试验 手提转速度试验 目标瞄准追击试验 简单 反应Fra Baidu bibliotek间试验

神经毒理学研究方法



一、神经行为功能评价方法 二、神经毒性评价方法 三、行为发育毒性测试方法
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神经行为功能评价方法


行为是机体神经系统功能的最终输出结果， 是神经系统功能的综合体现，就目前状况 而言，是较理想的体检测试评价指标，可 为评价各种神经毒物的毒效应提供有意义 的定性和定量依据。 其特点：行为改变往往出现在器质性损害 之前
神经毒理学方法
神经毒理学

是研究外源化学物对神经系统各部分所引 起的结构和功能损坏作用的一门学科。它 主要应用神经解剖、神经病理、神经生化、 神经药理和分子生物学的学科的理论和技 术，研究神经毒物在机体内的代谢、毒性 效应发生的类型、特征、主要的临床表现 及其生化和分子机制，为中毒防止提供科 学依据。神经毒理学可看作既属于毒理学 分支,又深深扎根与神经科学的一门交叉学 科

动物实验和离体实验的研究和应用应 遵守优化、减少及替代（refinement 、 reduction、 replacement）3R原则。
动物实验：需要建立神经系统毒性损伤的 动物模型。然后可以应用 生理、 生化和分子生物学的方法检 测。 此外，转基因或基因剔除动物的实验为 从基因水平研究毒作用的种属差异提供了 可能。

五、脑成像技术 脑成像技术很多，有颅骨X射线成像技 术、同位素脑扫描、计算机断层扫描、核 磁共振成像、正电子发射断层扫描术及单 光子发射计算机断层摄影等。
如1997年姜锋杰报道了慢性锰中毒颅脑 CT的改变，为锰中毒的诊断提供了新的参 考依据。
行为发育毒性测试方法

一、行为发育毒性测试组合 二、行为发育毒性研究组合 如：2005年胡前胜报道了宫内铅暴露对大鼠 神经行为发育的影响，2009年李洪钧报道 了孕中期铅暴露对婴儿神经行为发育影响 的研究。

此外，我个人认为神经毒理学研究方法还 可根据试验的样本来源分为： 一、人体研究 二、动物实验 三、离体组织或细胞实验


就人体研究而言，其研究方法与动物实验， 离体实验有明显的不同，除了对一些特殊 的志愿者研究外，所有的神经毒效应不能 采用人体进行研究。只能在接触某些神经 毒物或中毒后进行某些神经系统功能的临 床观察和检测；测定外周血、尿等替代指 标，作为评价接触神经毒物的生物标志物； 死后的组织病理学检查。
（二）、动物试验 活动度测定 运动协调功能测试 痛觉测定
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神经毒性评价方法
一、神经病理学方法 神经病理形态或组织化学改变是确认神经损 害及其病变可逆性程度的重要手段，也是确认神 经毒性的最经典方法。一般的研究思路，先进行 肉眼观察，并辅以脑的绝对和相对重量；其次， 在光学显微镜下观察基本病变，确定病变的脑区 后，可进一步取材作电镜检查。为了确认神经毒 性的细胞特异性及某些特殊生化过程的影响，需 用神经系统组织化学等方法检查。
方法和技术
学科

任何一种方法和技术决定于它所要解决的 问题，反过来，方法和技术的发展必然带 来某一学科的发展。鉴于神经毒理学的特 点，其研究方法必显示此学科的特点，即 神经毒理学研究方法。
传统毒理学研究方法

1.体内试验：也称为整体动物试验。实验多采用 哺乳动物，常用8种：大鼠、小鼠、家兔、豚鼠、 仓鼠、狗、雪貂（白鼬）和猴等。其结果原则上 可外推到人。

二、生理与生物化学方法
目前应用脑内微透技术，微穿技术，磁共振光 谱技术，高效液相色谱法，免疫印迹法，放射免 疫分析法等测定神经中枢神经递质的释放量及其 变化。 如：2003年李红玉报道了电磁辐射对大鼠海马 氨基酸类神经递质水平的影响；胡卫萱报道了甲 基汞对脑组织有极大的亲和性，2008年Yumi等发 现组氨酸可减少脑水肿面积的增加
1、FIOH测试组合 （ Finland‘s Institute of Occupational Health,芬兰职业卫生研究所 ）测试 组合
2、WHO-NCTB测试组合 WHO选定的神经行为核 心测试组合（neurobehavioral core test battery,NCTB）
3、NES方法 神经行为评价系统(neurobehavioral evaluation system)是1986年Lets和Baker提出的一组 利用计算机进行测试的测试组合。
可使用光镜、电镜、激光扫描共聚焦显 微镜、免疫组织化学、原位杂交法，受体 定位法、荧光素示踪技术和放射性核素示 踪技术对神经系统进行形态学观察和功能 活动形态定位。
如：1998年阮素云报道了低浓度铅对大鼠血 脑屏障超微结构的损害； 2001年赫秋月报 道了丙烯酰胺对小鼠小脑浦肯野细胞的病 理改变；2003年杨芳报道不同浓度锂对大 鼠原代培养大脑皮层神经元的影响。


离体实验 最常见的办法是从动物体分离得到的神 经细胞，在尽量模拟体内环境的体外条件 下，使神经细胞仍保持存活、增殖、发育 和分化能力，为下一步进行神经毒理学研 究提供所需要材料，然后根据实验设计， 可应用生理学、生物化学方和分子生物学 方法检测。
主要参考书目



《毒理学基础》 主编：王心如 《现代毒理学概论》 主编：顾祖维 《现代毒理学基础》 主编：祝寿芬 《医学神经生物学》 主编：关新民 《毒理学试验方法与技术》 主编：王心如

三、神经电生理学方法
神经电生理学指标在实验和人群的临床研究中 都得到了较为广发的应用，可使用脑电图，感觉 诱发电位，肌电图等测试神经系统的电活动，离 体的单个神经细胞可用斑片钳和膜片钳技术评价 单个细胞的单个离子通道及其受体的电活动。 如：2002年阮迪云应用膜片钳技术和原位杂 交技术研究了铅对钾通道亚单位和NMDA受体亚 单位的影响；2003年桑楠等报道了二氧化硫衍生 物对大鼠海马神经元外向钾电流特性的影响。
2.体外试验：利用游离器官、培养的细胞进行， 多用于外源化学物对机体急性毒作用的初步筛检、 作用机制和代谢转化过程的深入研究。体外试验 系统缺乏整体毒物动力学过程，并且难以研究慢 性毒作用。


3.人体观察（急性中毒事故、受控的临床实 验），可以直接获得关于人体的毒理学资 料，临床毒理学主要研究仅限于低浓度、 短时间的接触，并且毒作用应有可逆性。 4.流行病学研究：对人群的直接观察中取得 动物实验所不能获得的资料，优点是接触 条件真实。但流行病学研究干扰因素多。