脐带血检测

血样保存
脐带血的收集需要一定的周期，采集好的血样在送检前，倾斜放置在冰箱的冷藏层 或冰柜的冷藏柜中4℃保存，待全部血样收集好后送检。
血清分离
血样取出后，注射器平放或倾斜，扩大血清的析出面积,4℃静置半小时以上，35004000rpm离心5-10分钟。取上层清液（即为血清），再-20℃保持
核酸提取
2. 调整免疫程序，增加副猪、链球疫苗。 3. 增加保健药物的品种和投放时间。
4. 全进全出、消毒、空栏、
5. 产房+保育一体做绩效。
效果如何？为什么？
猪场管理人员的苦恼
为什么连这 些小病都搞 不定？！
猪场疾病冰山理论 只 关 注 这 一 块 显 然 是 不 够 的
临床表现
可见部分
隐藏部分
霉菌毒素
“脐带血”检测理论知识
技术服务部 2015. 09.14
提
纲
典型的保育猪临床病例
疾病发生的模式和机理
脐带血 检测的原理 脐带血检测的方法和流程
一、猪场疾病发生的现状
浩浩荡荡搬新家
Khampee K. Danny Yu
关 节 肿 大
一、客户做出的反应
我们的老板是如何应对的呢？
1. 怀疑饲料不好，换料！！
能通过特洛伊木马模式进入胎儿的病毒也可以通过随机碰撞模式进入。
特洛伊木马模式示意图
病毒被母体外周 单核细胞捕获
病毒随单核细胞 透过6层组织
病毒进入 胎儿血液
五、垂直感染的危害
胎儿被感染后的结局 病毒透过6层组织，进入胎儿血液循环系统后，进入靶细胞，大 量复制，侵害胎儿。胎儿被侵害后可能的几种结局：
常规的核酸提取技术： 苯酚抽提DNA法，（圆环，伪狂犬属于DNA病毒） Trizol抽提 RNA法，（猪瘟，蓝耳属于RNA病毒） 注意事项： （1） （ 2） 防止DNA酶的污染 抽提的核酸均保存在-20℃环境
基因扩增
1. 原理：采用聚合酶链式反应， 2. 原料：dNTP、引物、模板DNA、Taq DNA聚合酶以及Mg2+的加量（或浓度）根 据不同的基因进行调整， 3. 条件：在各阶段不同温度进行变性，退火，延伸，放大扩增特定的DNA片段，可以 根据引物的不同，反应温度的不同扩增不同的基因，
妊娠70天以前—取决于病毒毒力及是否有靶细胞
1）绝大部分死亡 2）极少部分存活，出生后免疫耐受
妊娠70天以后—取决于病毒毒力和胎儿免疫力
3）部分死亡 4）部分存活，出生后成为带毒仔猪
产房仔猪遭受垂直感染，进而引发保育临床疾病爆发的图示
六、如何判定猪场是否有垂直感染
1. 公猪血清检测？ 2. 母猪血清检测？ 3. 哺乳仔猪血清检测？ 4. 保育猪血清检测？ 5. 生长育肥猪血清检测？
其他病毒
疾病防控手段
切断传播途径 保护易感猪群
消 灭 传 染 源
有一定效果
难度大
很有必要
二、保育猪被感染的途径
思考：为什么有时候加药、消毒、 打疫苗对控制疾病效果不理想？
环境当中病原 群体间
妊 娠 母 猪
代次间
哺 乳 仔 猪
保 育 仔 猪
三、垂直传播与水平传播
1. 内部来的：妊娠母猪传给胎儿，出生后成为阳性仔猪，不断散 毒传给阴性仔猪，导致保育阶段发病，—垂直传播 2. 外来的：上批猪留下来的病毒没有消灭干净，导致下批猪被感 染—水平传播
采脐带血 血清分离 核酸提取
测序
扩增基因的鉴定
基因扩增
脐带血采样
“脐带血”采样方法：2ml（5 ml）的一次性注射器采的脐带血样1-3ml ；
样品数量的选取：从同一时段或同一批次分娩仔猪中，随机抽30窝，每窝2头，共得 60份血样（依据统计学原理，60个样本可以将猪群中99%的猪群病毒感染情况反映 出来）
胎 儿 微 血 管 壁 内 皮 细 胞 层
三、特殊情况下病毒如何透过这六层组织
1. 随机碰撞模式：
血中病毒数量足够多； 病毒体型足够小—细小病毒、圆环病毒；
细胞间隙足够大—妊娠后期胎盘细胞间隙增大，病毒更容易通过
细胞 10000-100000nm 细胞间隙 15-20nm H2O 0.4nm O2 0.34nm CO2 0.33nm
左上图 刚出生的仔猪 右上图 仔猪脐带 左下图 未吃初乳的仔猪
2、PCR(聚合酶链式反应)检测方法检测病原。
可以检测的病原有：蓝耳、圆环、猪瘟、伪狂、细小 脐带血检测病原与抗体优势比较 测病原 经济性 精确度 指导性 综合比较 成本低 灵敏度高 可以基因测序 优势明显 测抗体 成本高 灵敏度低 无法确定病原
扩增基因的鉴定
扩增基因通过琼脂糖凝胶电泳的方法来进行鉴定。该原理用琼脂或琼脂糖作支持介 质的一种电泳方法。对于分子量较大的样品，如大分子核酸、病毒等，一般可采用 孔径较大的琼脂糖凝胶进行电泳分离。通过紫外仪对电泳分离的结果进行观察，得 出结论
测序
通过鉴定出特异的基因，确定出特异的病毒。但是必须通过基因测序的手段对扩增 基因的序列进行析对比，确定该病毒的分型，确定后对猪场疫苗的使用有非常大的 指导作用
收费标准
脐带血收集好后每3-5份混成一个混样检测，太少增加检测成本，太多造成灵敏度下 降。 DNA病毒：圆环、伪狂 20元每个混样 RNA病毒：蓝耳、猪瘟 50元每个混样
THANKS
针对猪群采取的免疫、加药以及消毒措施都只能 阻断水平传播，对于垂直传播没有阻断效果。
四、垂直传播是怎么发生的？
1. 正常情况下，母体保护胎儿免受病原的侵袭 2. 特殊情况下，病毒透过保护层，感染胎儿
母体对胎儿的保护
1. 母体与胎儿的联系纽带是脐带，脐带中流淌着血液，胎儿血与 母体血互不交融，需要透过6层组织才能实现物质的交换。 2. 这6层组织是母体微血管壁的内皮细胞层、结缔组织层、子宫 内膜的上皮层、胎儿绒毛膜的滋胚层、胎儿绒毛芯的结缔组织 层和胎儿微血管壁内皮细胞层
PCV PPV FMDV CSFV PRRSV PRV
17nm 20nm 22-30nm 40-50nm 50-65nm 150-180nm
随机碰撞模式示意图
透过条件：
细胞间隙
病毒数量足够多
病毒体积足够小
病毒
细胞间隙足够大
2、特洛伊木马模式：病原借助外周单核/巨噬细胞为介质，透过胎盘屏障
感染胎儿。比如猪瘟、伪狂犬、圆环。
最好的方法就是检测初生仔猪的脐带血
脐带血检测结果 的运用
第一阶段——通过“脐带血”检测查看哪些仔猪受到感染，一旦一窝仔猪中有个别 感染，那么就证明该头母猪肯定在妊娠的某个过程被该病毒感染。
感染的仔猪不停的排毒，威胁同窝同批阴性的仔猪。哺乳期间由于有母源抗体的保护仔猪大多 表现健康良好，断奶时膘肥体壮。但是断奶后仔猪母源抗体快速下降，同时断奶应激、环境、 食物变化，并窝争斗等影响仔猪抵抗力下降很快，这个时候就容易被感染，感染到一定的比例 ，就会出现疾病爆发。
六层组织示意图
母体wk.baidu.com液
胎儿血液
1.氧、二氧化碳和许多小 分子依靠扩散与渗透； 2.大分子如蛋白质、抗体 、激素等则依靠主动转运 和吞饮转运。 3. 病原一般不能通过；
母 体 微 血 管 壁 内 皮 细 胞 层
结 缔 组 织 层
子 宫 内 膜 的 上 皮 层
胎 儿 绒 毛 膜 的 滋 胚 层
胎 儿 绒 毛 芯 的 结 缔 组 织 层
第二阶段——为了避免上述情况的发生，就需要加强母猪的免疫，使母猪产出病毒
阴性的仔猪，以保证后续对仔猪的免疫效果。 第三阶段——经过针对性的免疫措施后，通过脐带血的检测，能够知道母猪批次间 产出的仔猪是否为全阴性。以此指导免疫工作以及评价免疫效果
七、脐带血与脐带血检测方法
1. 脐带血的定义 “脐带血”——狭义是指胎儿经母体娩出，未吃食初乳，留存在 脐带上的血液（我们采集的对象） “脐带血”——广义是指刚出生没有吃初乳的仔猪血液。
我们推荐客户只检测蓝耳和圆环
这是由病毒的特性决定的 口蹄疫、病毒性腹泻—病毒不形成病毒血症； 猪瘟、伪狂—有成熟的疫苗和净化方案； 细小—多侵害1-2胎母猪，疫苗免疫效果确切； 乙脑—季节性发病，疫苗效果确切； 圆环—终身带毒，疫苗昂贵，有猪场免疫不到位；
蓝耳—疫苗不成熟，最难控制，净化难度大。
八、脐带血抗原检测流程