菌种的衰退、复壮和保藏
食用菌菌种保藏原理以及衰退菌种的菌种复壮
食用菌菌种保藏原理以及衰退菌种的菌种复壮今天要和大家介绍的是食用菌菌种保藏原理以及衰退菌种的菌种复壮，这是食用菌生产过程中少不了的步骤。
一、菌种贮藏原理食用菌菌种是国家重要的种质资源。
菌种保藏是食用菌生产中的一项必不可少的环节。
食用菌和其他生物一样，都具有遗传性和变异性。
遗传性保证了子代遗传特征的相对稳定，为菌种贮藏提供了条件；变异性使子代的性状与亲本相比会发生某些改变，给菌种的保藏带来了困难。
食用菌菌种在长期的栽培和保藏过程中，由于传代次数过多或不利环境条件的影响，常常会导致菌种衰退，丧失其优良性状。
因此，要想在一定时间内使菌种的生活力、纯度和优良性状稳定地保存下来，就应该采取一定的措施，进行菌种保藏工作。
菌种保藏的目的是在特定条件下，降低菌种的代谢速度，使其处于休眠或半休眠状态，在一定的保藏期内，确保菌种的纯度，防止病虫害感染，以保持菌种的优良性状，当条件适宜时又可以重新恢复生长繁殖。
菌种保藏的基本原理是采用低温、干燥、饥饿、缺氧等方法，以抑制菌丝生长，降低代谢速度，使菌丝处于休眠或半休眠状态，并保证菌种的纯度。
二、菌种复壮从衰退的群体中找出尚未衰退的个体，进行分离、培养，从而达到恢复菌种优良性状的过程就叫菌种复壮。
在实际生产中，多是在菌种尚未退化之前进行菌种复壮。
(一)菌种复壮原理生物以遗传变异为基础，通过自然选择和人工选择得以进化。
变异提供了选择的基础，选择保存了适应环境的个体，保存的个体使遗传特征得以遗传。
如此再变异、再选择、再遗传，循环往复，使生物得以不断进化。
菌种复壮就是依据这个原理进行的。
(二)菌种复壮方法1.挑选健壮菌丝进行接种：每次转接菌种时都挑选健壮菌丝进行接种是防止菌种衰退的有效、简便的措施。
2.进行分离复壮：从衰退的群体中找出尚未衰退的个体，通过分离进行复壮。
如菌丝分离，用无菌水将斜面上的菌丝稀释，再将菌丝体放入装有无菌蒸馏水的三角瓶中摇匀，然后转接到平板培养基上，使菌丝分布均匀，适宜条件培养至萌发成菌落。
微生物的菌种保藏技术—微生物菌种的衰退与复壮
一、菌种的衰退
菌种衰退的原因
1. 有关基因的负突变 2. 育种后未经很好的分离纯化 3. 培养条件的改变 4. 污染杂菌
一、菌种的衰退
防止衰退的措施
1）减少传代次数； 2）创造良好的培养条件； 3）利用单核体传代
4）经常进行纯种分离，并对相 应的性状指标进行检查；
5）采用有效的菌种保藏方法；
二、菌种的复壮（rejuvenation）
变异有正变（自发突变）和负 变两种。
菌种退化的 主要原因是基因的 负突变。
一、菌种的衰退
衰退：菌种出现或表现出负变性状 菌种衰退的原因：大量群体中的自发突变
纯菌种
自发突变
传代增殖
不纯菌种
突变个体
பைடு நூலகம்
衰退菌种 原始个体
一、菌种的衰退
菌种衰退的现象
1. 菌落和细胞形态改变 2. 生长速度缓慢，产孢子越来越少； 3. 生产性能下降：代谢产物生产能力或其对宿主寄生能力下降 4. 对生长环境的适应能力减弱
使衰退的菌种恢复原来优良性状
狭义的复壮是指在菌种已发生 衰退的情况下，通过纯种分离 和生产性能测定等方法，从衰 退的群体中找出未衰退的个体， 以达到恢复该菌原有典型性状 的措施。
广义的复壮是指在菌种的生产性 能未衰退前就有意识的经常、进 行纯种的分离和生产性能测定工 作，以期菌种的生产性能逐步提 高。实际上是利用自发突变（正 变）不断地从生产中选种。
思考与讨论、任务
思考与讨论：我学到什么？
1、菌种的退化：定义、现象原因及防 治衰退的措施 2、菌种的复壮：定义、复壮的方法
任务 1、怎样防止菌种的衰退？ 2、怎样判断菌种的衰退？
模块九 微生物的菌种保藏技术
Microbial culture preservation technology
07遗传变异-3菌种保藏
3.菌种保藏的方法
措施
低温
干燥 缺氧 避光 缺乏营养 添加保护剂 添加酸度中和剂
（1）斜面保藏法
方法：接种适宜斜面培养基→培养→4℃保藏 措施：低温，4℃ 适用：各大类 保藏期：1~6个月，定时传代 用橡皮塞代替棉塞，可适当延长保藏时间
（2）石蜡油封藏法
方法：斜面或半固体接种 → 培养 → 加无菌液 体石蜡高出培养基1cm→4~15℃保藏 措施：低温，隔氧 适用：不能利用石油的各大类 保藏期：1~2年 优点：简便
菌种的复壮措施：
①纯种分离法
②通过宿主体复壮 ③淘汰已衰退的个体
平板表面涂布法 菌落纯 （菌种纯） 纯种分离法 细胞纯 （菌株纯） 平板划线分离法
琼脂培养基浇注法
用“分离小室”进行单细胞分离 用显微操纵器进行单细胞分离 用菌丝尖端切割法进行单细胞分离
C1: first set of streaks C3:
（3）砂土管保藏法
方法：孢子或芽孢悬液 → 加入无菌砂土管中→ 干燥→ 封口 → 保藏 措施：无营养，缺氧，干燥 适用：产孢子（芽孢）微生物 保藏期：1~10年
（4）冷冻真空干燥保藏
方法：菌种培养 → 用保护剂悬浮 → 加入安瓿 管中→低温冻结（-25～-40℃）→抽真空干燥 → 真空封口 → 检查真空度 → 保藏
菌种保藏机构：
中国微生物菌种保藏委员会(CCCM) 中国典型培养物保藏中心（CCTCC） 美国典型菌种保藏中心(ATCC) 英国国家典型菌种保藏所（NCTC） 美国北部地区研究实验室（NRRL） 国家水生动植物病原库（APCCAM）
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菌种的复壮与保藏(陈)
➢石蜡油封藏法 • 措施：阻隔了空气，使菌体处于缺氧状态下，而
且又防止了水分挥发。
• 方法：液体石蜡150～170℃烘箱内灭菌lh；或121℃高压蒸
汽灭菌60～80min，再置于80℃的烘箱内烘干除去水分→倒入菌 种管中（高出1cm） → 4℃保存。
• 适用：霉菌、酵母菌、放线菌、好氧性细菌(xìjūn)等 • 保藏期：1～2年，或更长
常用的保护剂有脱脂牛奶、血清、淀粉、葡聚糖等高 分子物质。
第三十四页，共四十六页。
复苏方法： —— 先用70%酒精棉花擦拭安瓿上部， —— 将安瓿管顶部烧热， —— 用无菌棉签沾冷水，在顶部擦一圈，顶
部出现裂纹，用挫刀或镊子颈部轻叩一下， 敲下已开裂的安瓿管的顶端， —— 用无菌水或培养液溶解菌块，使用无菌 吸管移入新鲜培养基上，进行(jìnxíng)适温培养。
第二十九页，共四十六页。
➢ 砂土管干燥保藏法 • 措施(cuòshī)：无营养，缺氧，干燥 • 方法：孢子或芽孢悬液 → 加入无菌砂
土管中→ 干燥→ 封口 → 5℃保藏 • 适用：产孢子的丝状真菌、放线菌；有
芽孢的细菌 • 保藏期：1~10年或更长
第三十页，共四十六页。
沙土 管制作 (shātǔ)
另一方面，传代次数越多，群体中个别的衰退型细胞数量增加 并占据优势越快，致使群体表型出现衰退。
第六页，共四十六页。
3、不适宜的培养和保藏条件 不适宜的培养和保藏条件是加速菌种衰退的另一个重要原因。
不良的培养条件如营养成分、温度、湿度、pH值、通气(tōng qì)量 等和保藏条件如营养、含水量、温度、氧气等，不仅会诱发衰退 型细胞的出现，还会促进衰退细胞迅速繁殖，在数量上大大超过 正常细胞，造成菌种衰退。
菌种的衰退、复壮和保藏
菌种的衰退、复壮和保藏1. 内容1.菌种的衰退：菌种退化是指由于自发突变的结果，而使某一物种有一系列生物学性状发生量变或质变的现象（群体中退化细胞在数量上占一定数值后，表现出菌种生产性能下降的现象）。
具体表现为：⏹原有的形态性状变得不典型了；⏹生长速度变慢，产生的孢子变少，或颜色改变，甚至变形；⏹代谢产物生产能力下降，在生理上常指产量的下降；⏹致病菌对宿主侵染力的下降；⏹对外界不良条件包括低温、高温或噬菌体侵染等抵抗能力的下降；等等。
2.衰退菌种的复壮狭义的复壮仅是一种消极的措施，指的是在菌种已发生衰退的情况下，通过纯种分离和测定典型性状、生产性能等指标，从已衰退的群体中筛选出少数尚未退化的个体，以达到恢复原菌株固有性状的相应措施。
广义的复壮则应是一项积极的措施，即在菌种的典型特征或生产性状尚未衰退前，就经常有意识地采取纯种分离和生产性状的测定工作，以期从中选择自发的正变个体。
（1）衰退的防止:⏹控制传代的次数⏹创造良好的培养条件⏹利用不易衰退的细胞传代⏹采用有效的菌种保藏方法（2）菌种的复壮⏹纯种分离法⏹通过宿主体复壮对于因长期在人工培养基上移种传代而衰退的病原菌，可接种到相应的昆虫或动、植物宿主体中，通过这种特殊的活的“选择性培养基”一至多次选择，就可从典型的病灶部位分离到恢复原始毒力的复壮菌株。
⏹淘汰已衰退的个体（3）菌种的保藏⏹原理人为地创造合适的环境条件，使微生物的代谢处于不活泼、生长繁殖受抑制的休眠状态。
这些人工环境主要从低温、干燥、缺氧三方面设计。
⏹常用的方法：冷冻干燥保藏法、液氮保藏法、斜面保藏法、液体石蜡覆盖保藏法、载体保藏法、悬液保藏法、寄主保藏法等。
2. 练习一．填空1.某纯种微生物群体中的个别个体由于发生自发突变的结果，而使该物种原有一系列生物学性状发生衰退性的量变或质变的现象，叫做_____。
答案：衰退2. ______属于第三代的生物武器，包括高致病力的病原体和抗药菌等。
菌种繁育—菌种退化与复壮(食用菌生产技术课件)
长，都能会引起食用菌菌种退化。保藏期间如果斜面母种出现子实体，有菌盖形成的情况下，条件 合适就会有孢子弹射到斜面上萌发出菌丝，有性繁殖和无性繁殖混在一起，食用菌菌种发生退化。
二、防衰措施
一、菌种退化
表现
（1）菌丝体生长缓慢、丛生，长势 稀疏、尖端生长不整齐，整齐度下降 。
（2）对环境条件（氧气、温度、酸 碱度、二氧化碳）、杂菌等的抵抗力 变弱，生活力衰退。
（3）品种变劣，出菇迟，产量降低 ，出菇潮次不明显等。
最终都是产量和质量连续性的下降。
一、菌种退化
根源
内因 菌种的遗传物质发生了负变 外因 操作不当：传代过多，条件不适宜
一、菌种退化
根源
内因 菌种的遗传物质发生了负变 外因 操作不当：传代过多，条件不适宜
外因1：培养环境不适合 温度、湿度、通气、光照、PH值、培养基过于丰富或过于贫瘠等，均可造成菌种失去自我调节的能
力，丧失应该具有的优良种性。 外因2：转代次数过多 实际的食用菌生产中，采用不规范的菌种培养和制作，转代的次数越多，引起食用菌菌种退化的可
菌种退化与复壮
目录
一、菌种退化 二、防衰措施 三、菌种复壮
一、菌种退化
概念
食用菌菌种退化是指在正常栽培条件下，食用菌菌种的优良性状及典型 性由于菌丝体的遗传物质发生变异而在传代过程中逐渐丧失的现象。
菌种退化不是某一次转代突然出现的，也不是短时间发生的。只有群体 中退化菌丝在数量上占一定优势后，才有表现，是从量变到质变的渐变 结果，需要较长的时间。食用菌产量和质量的下降是食用菌菌种退化的 最终结果。
菌种生长的四个阶段
菌种生长的四个阶段
菌种生长的四个阶段是：
1. 潜伏期：在此阶段，菌种进入一个休眠状态，准备开始生长。
在这个阶段，菌种通过吸收营养物质和水分来增加其体积和质量。
2. 对数增长期：在这个阶段，菌种开始快速生长和繁殖。
菌群数量以指数方式增加，菌丝网络扩展，并形成新的孢子。
在这个阶段，菌种对于适宜的温度、湿度和营养物质非常敏感，因此提供适宜的环境条件非常重要。
3. 稳定期：在这个阶段，菌种开始达到一个稳定的生长状态。
菌群数量不再继续增加，而是保持相对稳定。
此时，菌种可能会产生更多的代谢产物，如酸、酶或药物。
4. 衰退期：在这个阶段，菌种的生长速度开始减缓并逐渐停止。
此时，菌种的资源和营养物质可能已经消耗殆尽，或者环境条件发生了变化，不再适合菌种的生长。
菌群数量开始减少，菌丝网络也开始退化。
菌种的衰退复壮和保藏
2、菌种保藏方法
1）斜面菌种低温保藏法---利用低温对微生 物生命活动有抑制作用的原理进行保藏。 把斜面菌种、固体穿刺培养物或菌悬液 等,直接放入4～5℃冰箱中。保藏时间一 般不超过3个月,到时必须进行移接传代, 再放回冰箱。
2）砂土管保藏法---将干燥砂粒与细土混合 后灭菌制成砂土管,然后接种保藏 。若把 砂土管放在低温或抽气后密封,效果更佳。 此法适用于产孢子及芽孢菌种的保藏。 保藏期1～10年 3）石蜡油封藏法---向培养好的菌种斜面上, 加入灭菌石蜡油,高出斜面1cm,然后蜡封 管口,放入冰箱。该法既可防止培养基水 分蒸发,又能使菌种与空气隔绝。保藏期 1～ 2年
美国的“美国典型菌种收藏所”(ATCC)，保藏 方式主要采用冷冻干燥和液氮超低温冻结法。
2、衰退的防止
（1）控制传代次数 （2）创造良好的培养条件 （3）利用不易衰退的细胞传代 （4）采用有效的菌种保藏方法
二、菌种的复壮
1、复壮的定义：
狭义复壮：指的是在菌种已在发生衰退的情况下，通 过纯种分离和测定典型性状，生产性能等指标，从 已衰退的群体中筛迁出少数尚未退化的个体，以达 到恢复原菌株固有的性状的相应措施。 广义的复壮：是一项积极的措施，即在菌种的典型特 征或生产性状尚未衰退前，主经常有意识地采服纯 种分离和生产性状的测定工作，以期众中选择到自 发的正变个体。
第五节 菌种的衰退、复壮和保藏
一、菌种的衰退及其防治 1、衰退：是指由于自发突变的结果，而使某种 原有一系列生物学性状发生量变或质变的现象。 如原有形态性状变得不典型了，生长速度变慢， 代谢产物生产能力下降，致病菌对宿主侵染力 的下降，对外界不良条件包括低温、高温或噬 菌体侵染等抵抗能力的下降等。
3、菌种保藏中心
我国由于1979年7月成立了中国微生物菌种 保藏管理委员会(CCCCM),
菌种为什么会退化？如何防止菌种退化以及复壮菌种呢？
菌种为什么会退化？如何防止菌种退化以及复壮菌种呢？在食用菌生产中，由于各种原因，常使菌种遗传物质发生变异，进而出现优良性状减退或消失、产量降低、质量下降等现象，这就是菌种退化。
（一）菌种退化：1.菌种退化的实质：菌种退化的实质是遗传物质发生了可遗传的变异。
菌种退化是一个从量变到质变的渐变过程，当发生有害变异的个体在群体中显著增多，以致占据优势时才会表现出来。
对于群体来说，个别细胞的退化变异会随着细胞的分裂而逐步增加，使衰退的个体逐渐增多，最后使整个群体发生严重的衰退。
虽然菌种退化现象普遍存在，但可以采取适当措施延缓其退化进程，将群体的退化控制在最低限度。
尽管个体的变异可能是一个瞬时的过程，但菌种退化却需要较长的时间。
因此，在退化的菌种中，经常有少数尚未退化的个体，这是菌种复壮的基础。
2.菌种退化的原因与表现：菌种退化的主要原因是交叉感染、自体杂交、基因突变、培养条件不适等，病毒感染也会引起菌种退化。
食用菌菌种感染病毒后，病毒数量不仅会随着菌丝体的扩大繁殖而增加，而且还会通过带毒的孢子传给下一代。
当菌种携带一定浓度的病毒粒子时，在栽培中就会表现出产量降低、质量下降等退化现象。
菌种退化除了与其自身的遗传特性和所处的环境密切相关之外，还受转管次数、机械创伤等外界因素影响。
菌种退化的主要表现是理想的优良性状逐渐丧失，继而出现菌丝生长势弱、代谢能力下降、产量降低、易受病虫害感染等。
3.防止菌种衰退的措施：在某种意义上，菌种退化是必然发生的现象，但依然可以采取多种措施防止菌种过早衰退。
（1）控制母种转管次数：从理论上讲，菌种可以进行多次转接；但由于在操作中菌丝受机械创伤等影响，会使菌种产生突变，而多数突变对菌种是不利的。
因此在可能的情况下，尽量减少转管次数。
实践证明，生产上用的菌种转接控制在5代范围内较为合适。
（2）防止菌种混杂在菌种转接、出菇管理等过程中，加强品种隔离管理，减少品种间相互混杂的机会，防止不同品种的孢子四处传播，以保证优良品种的遗传特性相对稳定。
菌种的衰退、复壮和保藏
第五节菌种的衰退、复壮和保藏性状稳定的菌种是微生物学工作最重要的基本要求，否则生产或科研都无法正常进行。
影响微生物菌种稳定性的因素有变异、污染、死亡。
由于微生物的多样性，不同的微生物往往对不同的保藏方法有不同的适应性，迄今为止尚没有一种方法能被证明对所有的微生物均适宜。
因此，在具体选择保藏方法时必须对被保藏菌株的特性、保藏物的使用特点及现有条件等进行综合考虑。
对于一些比较重要的微生物菌株，则要尽可能多的采用各种不同的手段进行保藏，以免因某种方法的失败而导致菌种的丧失。
一、斜面冰箱保藏法一种短期、过渡的保藏方法，用新鲜斜面接种后，置最适条件下培养到菌体或孢子生长丰满于4℃冰箱保存。
保存期3月到6月。
二、沙土管保藏法适合于产孢子或芽孢的微生物。
首先，将沙与土洗净、烘干、过筛，按沙与土的比例为1—2：1混合均匀，分装于小试管中，料高1厘米左右，121C间歇灭菌三次，烘干备用。
一般沙80目，土80一100目。
其次，将孢子制成悬浮液，接入沙土管。
或将斜面孢子刮下直接与沙土混合，置干燥器中用真空泵抽干，冰箱内保存。
保存期1年左右。
三、菌丝速冻法不产孢子或芽孢的M可用甘油菌丝速冻法。
该法保藏温度为-20℃，为避免M受损伤致死，需甘油作保护剂。
甘油最终浓度为25％。
操作：①、配制浓度为50％的甘油溶液，121℃灭菌后备用；②、制备菌悬液，一般浓度为108～1010个/mL；③、菌悬液和甘油溶液等体积混合均匀，置-20℃保藏。
四、石蜡油封存法向培养成熟的菌种斜面上，倒入一层灭过菌的石蜡油，量高出斜面1cm，然后保存在冰箱中。
此法适于不能利用石蜡油作碳源的细菌、霉菌、酵母等M的保存。
保存期约1年五、真空冷冻干燥保藏法是目前国内外较理想的常用方法。
其基本原理是在较低温度下(-18℃)，快速地将细胞冻结，并且保持细胞完整，然后在真空中使水分升华。
在这样的环境中，M的生长和代谢暂时停止，不易发生变异。
菌种可保存5年左右。
菌种的衰退
每克耕作层土壤含菌量十倍递减
细菌（~108）
>放线菌（~107，孢子） >霉菌（~106，孢子） >酵母菌（~105） >藻类（~104）
>原生动物（~103）
二、水体中的微生物 1. 淡水微生物
1）数量和种类与接触的土壤有密切关系； 2）吸附于悬浮在水中的有机物上及水底； 3）多能运动，有些具有很异常的形态（例如柄细菌）； 4）靠近城市或城市下游水中的微生物多，并且有很多对健康 不利的细菌，因此不宜作为饮用水源； 5）水体自身存在自我净化作用： 水中的病原微生物会对水质产生重要影响
肠道中的正常菌群，大肠杆菌，一旦进入泌尿系统，引起尿路感染。 人体表面的正常菌群，一旦它们进入伤口也会引起感染。 条件致病菌：人体的正常微生物菌群一旦进入非正常聚居部位， 或生态结构发生改变而引起人类疾病的微生物。
可通过口服某些活的微生物制剂 来治疗由于正常菌群失调而导致的腹泻。 •含蜡状芽孢杆菌（B.cereus）的“促菌生”， •含地衣芽孢杆菌的“整肠生”、 •枯草芽孢杆菌和肠球菌的“妈咪爱”、
上述过程又称富营养化作用，它是水体受到污染 并使水体自身的正常生态失去平衡的结果。
“水花”或“水华”（water bloom）：
藻类（主要是微藻）的大量繁殖使水体(淡水水体)出现颜色， 并变得浑浊，许多藻类团块漂浮在水面上形成。
赤潮或红潮（red tides）：
在海洋中，某些甲藻类大量繁殖也可形成水花，从而使 海水出现红色或褐色。
饮用水的微生物指标： a）致病菌一般对营养要求苛刻，因此在一般的水中只能存活2~3天； 总菌数： < 100个/ml b）水表微生物会受辐射等作用而被杀灭； 大肠杆菌：< 3 个/L c）原生动物等的吞噬作用； d）由固形物吸附再沉积到水底；
第九章菌种保藏与专利保护
④真空冷冻干燥法 加有保护剂的菌悬液在冻结状态下予以真空干燥。 适用于各种微生物，便于大量保藏，菌种存活时间 长，是目前最好的保藏方法之一。
⑤液氮超低温保藏法 将菌种置于保护剂中，预冻后保存在液氮超低温冰 箱中（ -196℃）。 适用于各种微生物，便于大量保藏，菌种存活时间 长，是目前最好的保藏方法之一。
连续在活宿主上（内）移种
半固体琼脂柱 液体介质（蒸馏水、糖液、其它溶液） 藏在玻璃管内 吸附在合适的载体上
常用菌种保藏的方法
①低温保藏法
方法：菌种管置4℃冰箱保藏，定时传代 原理：低温下，微生物代谢强度明显下降 。 ②石蜡油低温保藏法： 橡皮塞取代棉塞、加石蜡油。
③干燥保藏法
将菌种置于土壤、细纱、滤纸、硅胶等干燥材料 上保藏。如砂土管法，适用于放线菌、芽孢菌和某 些真菌保藏，保藏时间几至几十年。
（三）几种常用菌种保藏方法的比较
方法名称
冰箱保藏法（斜面） 冰箱保藏法（半固体） 石蜡油封藏法* 沙土保藏法
主要措施
低温 低温 低温、缺氧 干燥、无营养
适宜菌种
各大类 细菌、酵母菌 各大类** 产孢子微生物
保藏 期
3~6月 6~12月 1~2年 1~10年
评价
简便 简便 简便 简便 有效
冷冻干燥法
干燥、无氧、低 温、有保护剂
各大类
5~15年 以上
简便 有效
（四）主要菌种保藏机构 P216
菌种保藏机构的任务：广泛收集科研和生产菌
种、菌株，并加以妥善保管，使之达到不 死、不衰、不乱以及便于研究、交换和使 用的目的。
菌种保藏机构：
中国微生物菌种保藏委员会(CCCCM) 美国的典型菌种保藏中心(ATCC) 英国国家典型菌种保藏所（NCTC） 法国里昂巴斯德研究所（IPL）
菌种保存方法和菌种的衰退复壮
菌种保存方法和菌种的衰退复壮菌种保存方法微生物具有容易变异的特性，因此，在保藏过程中，必须使微生物的代谢处于最不活跃或相对静止的状态，才能在一定的时间内使其不发生变异而又保持生活能力。
低温、干燥和隔绝空气是使微生物代谢能力降低的重要因素，所以，菌种保藏方法虽多，但都是根据这三个因素而设计的。
保藏方法大致可分为以下几种：1．传代培养保藏法又有斜面培养、穿刺培养、疱肉培养基培养等（后者作保藏厌氧细菌用），培养后于4—6℃冰箱内保存。
2．液体石蜡覆盖保藏法是传代培养的变相方法，能够适当延长保藏时间，它是在斜面培养物和穿刺培养物上面覆盖灭菌的液体石蜡，一方面可防止因培养基水分蒸发而引起菌种死亡，另一方面可阻止氧气进入，以减弱代谢作用。
3．载体保藏法是将微生物吸附在适当的载体，如土壤、沙子、硅胶、滤纸上，而后进行干燥的保藏法，例如沙土保藏法和滤纸保藏法应用相当广泛。
4．寄主保藏法用于目前尚不能在人工培养基上生长的微生物，如病毒、立克次氏体、螺旋体等，它们必须在生活的动物、昆虫、鸡胚内感染并传代，此法相当于一般微生物的传代培养保藏法。
病毒等微生物亦可用其他方法如液氮保藏法5．冷冻保藏法可分低温冰箱（-20—-30℃，-50—-80℃）、干冰酒精快速冻结（约-70℃）和液氮（-196℃）等保藏法。
6．冷冻干燥保藏法先使微生物在极低温度（-70℃左右）下快速冷冻，然后在减压下利用升华现象除去水分（真空干燥）。
有些方法如滤纸保藏法、液氮保藏法和冷冻干燥保藏法等均需使用保护剂来制备细胞悬液，以防止因冷冻或水分不断升华对细胞的损害。
保护性溶质可通过氢和离子键对水和细胞所产生的亲和力来稳定细胞成分的构型。
保护剂有牛乳、血清、糖类、甘油、二甲亚砜等。
三、器材细菌、酵母菌，放线菌和霉菌；肉膏蛋白胨斜面培养基，灭菌脱脂牛乳，灭菌水，化学纯的液体石蜡，甘油，五氧化二磷，河沙，瘦黄土或红土，冰块、食盐，干冰，95％酒精，10％盐酸，无水氯化钙；灭菌吸管，灭菌滴管，灭菌培养皿，管形安瓿管，泪滴形安瓿管（长颈球形底），40目与100目筛子，油纸，滤纸条（0．5×1．2c m），干燥器，真空泵，真空压力表，喷灯，L形五通管，冰箱，低温冰箱（-30℃），液氮冷冻保藏器。
菌种保藏和复苏-精简版
菌种保藏和复苏-精简版菌种的保藏与复苏⼀、菌种保藏（⼀）菌种保藏的定义菌种保藏（culture preservation）是指将微⽣物菌种⽤各种适宜的⽅法妥善保藏，避免死亡、污染，保持其原有性状基本稳定。
菌种保藏有许多的⽅法，其共同的⽬标是把菌株的优良性状保存下来，防⽌退化、死亡或杂菌污染。
（⼆）菌种保藏的原理微⽣物具有容易变异的特性，因此，在保藏过程中，必须使微⽣物的代谢处于最不活跃或相对静⽌的状态，才能在⼀定的时间内使其不发⽣变异⽽⼜保持⽣活能⼒。
低温、⼲燥和隔绝空⽓是使微⽣物代谢能⼒降低的重要因素，所以，菌种保藏⽅法虽多，但⼤都是根据这三个因素⽽设计的。
其中低温是保藏菌种的重要因素，也是常⽤的⼀种简单易⾏的⽅法。
在作低温保藏时，注意尽量不损伤细胞。
在缓慢冷冻时，胞外基质⼀般较快结冰⽽形成冰晶使基质浓度增⾼，造成细胞⽔分外渗⽽⼤量脱⽔，可能使细胞死亡。
如快速降温，胞内也很快形成冰晶，胞内外渗透压基本平衡，同时胞内冰晶较⼩，对细胞及原⽣质膜的损伤也较⼩，菌株不易死亡，影响也较⼩。
与低温相关的保藏⽅法，如冷冻⼲燥法、超低温保藏法等，都是利⽤低温条件下细胞与环境的特殊平衡原理⽽设计的。
（三）菌种保藏的⽅法本实验室常⽤菌种保藏⽅法主要有：1.低温保藏法将菌种接种在适宜的固体或液体培养基上，待菌⽣长充分以后，转移⾄4°C冰箱中保存。
平板在4°C存放时，最好⽤封⼝膜封⼝，不能长时间存放，⼀般7-10天，最多不应超过2个星期（特殊菌株可能时间更短，如铜绿假单胞菌只能存放3天）。
此法仅⽤于⼯作⽤菌种的短期保存，并应随时检查其污染杂菌和变异等情况，发现异常情况，应经灭活处理后销毁。
2.⽢油冷冻管保藏法菌种长时间冻存应放于液氮或者-80 °C冰箱，利⽤10-15%的⽢油进⾏冻存。
⽢油的作⽤：⽢油能够提⾼⽔体的粘稠度，使其冰点提⾼，防⽌细胞内部产⽣冰晶造成细胞的损害，⼀般使⽤⽢油的终浓度在10%-20%，该范围外的浓度会对细胞产⽣毒性，如果是保存带有质粒的菌种建议⽢油终浓度为8-10%，⽢油浓度太⾼会导致质粒的不稳定。
第七章菌种的保藏与复壮-第二章-菌种的保藏与复壮
一、菌种保藏
• 工业微生物菌种保藏与其他目的
的菌种保藏要求有所不同。工业 微生物菌种保藏，是要使菌种生 产能力和与生产工艺相适应的优 良性状保持稳定，当然做不到绝 对不变，只是力求把这种衰退现 象推迟减缓到最低限度。
菌种保藏
• 菌种保藏有许多的方法，其共同的目标是
(二)低温定期移植法
• 把培养好的斜面菌种放在低温干燥处保存，
定期移植，一般3～6个月移植一次(视菌种 特征而定)。也可以用穿刺培养，定期移植 法保藏细菌，其效果也较好。穿刺培养是 将含 0.6 ％～ 0.8 ％的琼脂培养基装试管灭 菌后直立冷凝后，用接种针尖挑取少量菌 体，垂直刺入琼脂培养基中心，放在适当 温度下培养，待菌长好后即可放低温保存， 此法较斜面保存有利，大肠杆菌可保藏2年 以上不发生明显变异。
• 在沙土保藏初期，菌死亡率高，以后逐渐减慢，
存活下来的孢子在以后保存期间稳定性较好， 保藏的有效时间与菌种存活率的关系见图2-10。 • 用沙土管保藏的某些抗生素产生菌保藏期可达 18 年 ( 土霉素和链霉素产生菌 ) 到 22 年 ( 新霉素 产生菌 ) ，但对利福霉素、卡那霉素、四环素 等容易产生变异的菌种，就不适合作长期的沙 土管保存。
第八章 菌种的保藏与复壮
•
菌种衰退的基本原因是变异， 变异是不可避免的，而减缓变异速 度则是可能的。变异速度与菌种所 处的环境有密切的关系，不良环境 条件能促进变异，频繁或过多传代 也是造成衰退变异的重要原因。为 菌种创造良好条件，减缓菌种衰退， 这就是菌种保藏与复壮工作。
衰退：
菌种在培养或保藏过程中，由于自发突 变的存在，出现某些原有优良生产性状 的劣化、遗传标记的丢失等现象，称为 菌种的衰退。 衰退的原因：①基因突变， ②分离现象。
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课外学习资源
中国工业微生物菌种保藏管理中心 /
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微生物学
菌种的衰退、复壮和保藏（ 课时） 第八章 菌种的衰退、复壮和保藏（4课时）
食品教研室
性状稳定的菌种是微生物学工作最重要的基本 要求，否则生产或科研都无法正常进行。 影响微生物菌种稳定性的因素：
a）变异； ）变异； b）污染； ）污染； c）死亡. ）死亡
一、菌种的衰退(degenration)
特点
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2.矿油保藏法
矿油 处理 灭菌：152kpa、30min 去水：40~50℃烘至无色透明
无菌检验 ？ 注入种管 口堵胶塞 淹没斜面约
3.自然基质保藏法
麦粒浸透、煮熟 基质的处理 麸皮拌湿 灭菌 接种 培养 装管
干燥器去水
防衰老 特点 保藏时间长 转接后生长旺 易污染，灭菌要彻底
使菌种 不降低或不丧失其优良性 原理 以尽量延长使用时间
创造不利于菌种生长的一切条件， 使其代谢处于休眠状态。
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低温
缺营养
不利 条件
干燥
无氧
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（二）常用保藏法（以CICC为例） 以母种形式保藏 1.斜面低温法 斜面菌种置4~6℃冰箱中（3~6个月） 简便 保藏时间短 易污染及退化 不适于草菇等菌类
b）通过寄主体进行复壮； 2. 有意识地利用微生物会发生自发突变的特性，在日常的菌种 有意识地利用微生物会发生自发突变的特性， 维护工作中不断筛选“正变”个体(广义复壮 积极措施) 广义复壮， 维护工作中不断筛选“正变”个体 广义复壮，积极措施 。
纯种的分离方法
平板划线分离法 平板涂布分离法 平板倾注分离法 用“分离小室”进行单细胞分离 显微操纵器进行单细胞分离 菌丝尖端切割法进行单细胞分离
1. 衰退的表现 1）原有形态形状变得不典型； 2）生长速度变慢； 3）代谢产物生产能力下降； 4）致病菌对宿主侵袭力下降； 5）对外界不良环境的抵抗力下降。
2. 衰退的原因
1）根本原因在于基因自发突变 根本原因在于基因自发突变； 根本原因在于基因自发突变 2）传代次数的影响，使负突变株的比例逐渐占 了优势； 3）与培养条件有关。
菌落纯
细胞纯
三、菌种保藏
基本要求：
在一定时间内使菌种不死、不变、 在一定时间内使菌种不死、不变、不乱
培养基传代培养 斜面、平板 生活态 寄主传代培养 冷冻 干燥
液氮、低温冰箱 沙土管、冷冻真空干燥
基本方法：
休眠态
学习情景法
菌种保藏
（一）保藏目的及原理 （二）常用保藏法 （三）保藏注意
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（一）保藏目的及原理 目的 不死亡 不生长 不污染
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（三）保藏注意
用保种培养基 及时保藏（菌丝占斜面2/3） 最好换胶塞 用时活化 严防棉塞受潮
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作业题
1.设计菌种保藏的依据是什么？ 2. 怎样防止菌种的衰退？ 3.怎样判断菌种的衰退？ 4.自然基质保藏法是怎样进行的？有何优缺点？
思考、讨论题
1.栽培时为何不用母种作菌种？ 2.母种扩成原种的目的是什么？ 3.接种操作应注意哪些环节？
衰退是发生在微生物细胞群体中的一 个由量变到质变的逐步演变的过程。
3.衰退的防止
保证菌种的纯培养 严格控制传代次数 用适宜菌龄的菌种 用适宜培养条件及保藏条件
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二、菌种的复壮（rejuvenation） 菌种的复壮
1. 从衰退的菌种群体中把少数个体再找出来，重新获得具有 从衰退的菌种群体中把少数个体再找出来， 狭义复壮， 原有典型性状的菌种(狭义复壮 消极措施)。 原有典型性状的菌种 狭义复壮，消极措施 。 a）纯种分离;