菌种的复壮与保藏(陈)
食用菌菌种保藏原理以及衰退菌种的菌种复壮
食用菌菌种保藏原理以及衰退菌种的菌种复壮今天要和大家介绍的是食用菌菌种保藏原理以及衰退菌种的菌种复壮，这是食用菌生产过程中少不了的步骤。
一、菌种贮藏原理食用菌菌种是国家重要的种质资源。
菌种保藏是食用菌生产中的一项必不可少的环节。
食用菌和其他生物一样，都具有遗传性和变异性。
遗传性保证了子代遗传特征的相对稳定，为菌种贮藏提供了条件；变异性使子代的性状与亲本相比会发生某些改变，给菌种的保藏带来了困难。
食用菌菌种在长期的栽培和保藏过程中，由于传代次数过多或不利环境条件的影响，常常会导致菌种衰退，丧失其优良性状。
因此，要想在一定时间内使菌种的生活力、纯度和优良性状稳定地保存下来，就应该采取一定的措施，进行菌种保藏工作。
菌种保藏的目的是在特定条件下，降低菌种的代谢速度，使其处于休眠或半休眠状态，在一定的保藏期内，确保菌种的纯度，防止病虫害感染，以保持菌种的优良性状，当条件适宜时又可以重新恢复生长繁殖。
菌种保藏的基本原理是采用低温、干燥、饥饿、缺氧等方法，以抑制菌丝生长，降低代谢速度，使菌丝处于休眠或半休眠状态，并保证菌种的纯度。
二、菌种复壮从衰退的群体中找出尚未衰退的个体，进行分离、培养，从而达到恢复菌种优良性状的过程就叫菌种复壮。
在实际生产中，多是在菌种尚未退化之前进行菌种复壮。
(一)菌种复壮原理生物以遗传变异为基础，通过自然选择和人工选择得以进化。
变异提供了选择的基础，选择保存了适应环境的个体，保存的个体使遗传特征得以遗传。
如此再变异、再选择、再遗传，循环往复，使生物得以不断进化。
菌种复壮就是依据这个原理进行的。
(二)菌种复壮方法1.挑选健壮菌丝进行接种：每次转接菌种时都挑选健壮菌丝进行接种是防止菌种衰退的有效、简便的措施。
2.进行分离复壮：从衰退的群体中找出尚未衰退的个体，通过分离进行复壮。
如菌丝分离，用无菌水将斜面上的菌丝稀释，再将菌丝体放入装有无菌蒸馏水的三角瓶中摇匀，然后转接到平板培养基上，使菌丝分布均匀，适宜条件培养至萌发成菌落。
菌种保藏方法及复壮技术
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菌种保藏方法及复壮技术菌种保藏的原理是通过干燥、低温、缺氧、避光、缺乏营养等方法，使菌种的代谢水平降低，乃至完全停止，达到半休眠或完全休眠的状态，而在一定时间内得到保存。
需要时再通过提供适宜的生长条件使保藏物恢复活力，使菌种在较长期的保藏之后仍然保持着原有的生命力、典型的形态特征、优良生产性能。
目前常用的菌种保藏方法有以下几种。
1菌种保藏方法1.1斜面低温保藏法将需要保藏的菌种，接种在适宜的斜面培养基上，菌丝长满斜面时，用硫酸纸包扎棉塞，旋转在4℃的冰箱保藏。
由于微生物的新陈代谢活动未停止，试管内培养基易失水变干，因此，保藏时间较短，转管次数多，不适于长期保藏。
每隔六个月转管一次。
草菇菌种不耐低温，需保藏在10~12℃，或在草菇菌落上灌注3~4毫升的防冻剂（10%的甘油）。
如菌丝长满斜面后，在无菌条件下，用无菌橡皮塞代替棉塞，并用石蜡密封，即可在室温或冰箱中保藏。
这种方法可防止杂菌污染，隔绝氧气，避免培养基干燥，使用方便。
1.2液体石蜡保藏法石蜡防止培养基水分蒸发，隔绝斜面菌丝与空气接触，降低微生物代谢活性，使其处于休眠状态，因此能延长微生物的生命，保持菌种优良的种性。
一般可保藏3~5年，是一种中长期的菌种保藏方法。
液体石蜡选用化学纯的，在121℃下高温灭菌30分钟，再将液体石蜡在160℃烘箱中保温1~2小时，蒸发掉液体石蜡中的水，或将高压灭菌后的液体石蜡放置在40~60℃温箱中，使灭菌后的液体石蜡层由乳白色变成无色透明。
在无菌条件下，将灭菌除水的液体石蜡用无菌吸管罐到长满菌丝的斜面试管中，液体石蜡要高出斜面尖端1厘米左右，然后用无毒泡沫试管塞塞好，直立地放在试管架上或罐头瓶中，置于冰箱或室温中保藏。
液体石蜡灌注过多，移种时不方便；过少，时间长容易干涸。
如将棉塞齐试管中剪平，用石蜡溶封，或用无菌橡皮塞代替棉塞，可延长保藏时间。
菌种的保藏与复壮
(二)低温定期移植法
• 把培养好的斜面菌种放在低温干燥处保存，
定期移植，一般3～6个月移植一次(视菌种 特征而定)。也可以用穿刺培养，定期移植 法保藏细菌，其效果也较好。穿刺培养是 将含0.6％～0.8％的琼脂培养基装试管灭 菌后直立冷凝后，用接种针尖挑取少量菌 体，垂直刺入琼脂培养基中心，放在适当 温度下培养，待菌长好后即可放低温保存， 此法较斜面保存有利，大肠杆菌可保藏2年 以上不发生明显变异。
• (2)保护剂 不同种类的保护剂对不同
微生物的作用是不同的，如个别菌种在 脱脂乳作保护剂的情况下死亡率高达 99.99%，而采用葡聚糖等混和保护剂时 死亡率大大减少。一般情况下，那些容 易保存的菌种对保护剂的要求不很严格， 而不易保存的菌种对保护剂的要求却很 苛刻。因此，选择好的保护剂是冷冻干 燥保存菌种的关键因素。
(六)真空冷冻干燥法
• (3)菌种准备及分装 菌种要求为生长良好
的纯种，菌龄以处于稳定期为好，孢子是 新鲜的。每支长好的斜面加2～3ml保护剂， 用接种环将菌苔轻轻刮起(注意勿刮起培养 基)，制成菌悬液。如用液体培养的菌种， 则需经离心收集和用灭菌生理盐水洗涤细 胞，收集的菌体用保护剂悬浮制成菌悬液。 悬液中菌数要求达到10 8～10 10cfu/ml 为宜。悬液制备完成尽快分装和冻结。分 装安瓿时可用灭菌的长滴入安瓿管底部， 装量可依据冷冻干燥机效能而定。
(六)真空冷冻干燥法
• (4)预冻 分装好的安瓿管需要进行预冻，即放在-
30～40℃下冻结20～60min，也可以用干冰和无水 乙醇冻5～10min。
• (5)冷冻干燥 经预冻的安瓿放入干燥箱中开始
抽真空干燥。此时干燥箱温度控制在-30℃以下， 并尽快使真度达到66Pa以下。此后可还渐升温以加 速水分升华，但升温不宜过快，以免引起样品融化。 干燥时间视冻干机效率、样品装量及性质等而寂， 以样品最终水分含量达到1%～3%为准。具体操作时 是根据冻干样品呈酥块工松散片状；真空度接近空 载时最高真空；样品温度与管外温度接近。 完毕将安瓿管在真空下用火焰烧熔密封，并用高频 真空检测真空度。
菌种的衰退、复壮和保藏
菌种的衰退、复壮和保藏1. 内容1.菌种的衰退：菌种退化是指由于自发突变的结果，而使某一物种有一系列生物学性状发生量变或质变的现象（群体中退化细胞在数量上占一定数值后，表现出菌种生产性能下降的现象）。
具体表现为：⏹原有的形态性状变得不典型了；⏹生长速度变慢，产生的孢子变少，或颜色改变，甚至变形；⏹代谢产物生产能力下降，在生理上常指产量的下降；⏹致病菌对宿主侵染力的下降；⏹对外界不良条件包括低温、高温或噬菌体侵染等抵抗能力的下降；等等。
2.衰退菌种的复壮狭义的复壮仅是一种消极的措施，指的是在菌种已发生衰退的情况下，通过纯种分离和测定典型性状、生产性能等指标，从已衰退的群体中筛选出少数尚未退化的个体，以达到恢复原菌株固有性状的相应措施。
广义的复壮则应是一项积极的措施，即在菌种的典型特征或生产性状尚未衰退前，就经常有意识地采取纯种分离和生产性状的测定工作，以期从中选择自发的正变个体。
（1）衰退的防止:⏹控制传代的次数⏹创造良好的培养条件⏹利用不易衰退的细胞传代⏹采用有效的菌种保藏方法（2）菌种的复壮⏹纯种分离法⏹通过宿主体复壮对于因长期在人工培养基上移种传代而衰退的病原菌，可接种到相应的昆虫或动、植物宿主体中，通过这种特殊的活的“选择性培养基”一至多次选择，就可从典型的病灶部位分离到恢复原始毒力的复壮菌株。
⏹淘汰已衰退的个体（3）菌种的保藏⏹原理人为地创造合适的环境条件，使微生物的代谢处于不活泼、生长繁殖受抑制的休眠状态。
这些人工环境主要从低温、干燥、缺氧三方面设计。
⏹常用的方法：冷冻干燥保藏法、液氮保藏法、斜面保藏法、液体石蜡覆盖保藏法、载体保藏法、悬液保藏法、寄主保藏法等。
2. 练习一．填空1.某纯种微生物群体中的个别个体由于发生自发突变的结果，而使该物种原有一系列生物学性状发生衰退性的量变或质变的现象，叫做_____。
答案：衰退2. ______属于第三代的生物武器，包括高致病力的病原体和抗药菌等。
菌种的衰退复壮和保藏
2、菌种保藏方法
1）斜面菌种低温保藏法---利用低温对微生 物生命活动有抑制作用的原理进行保藏。 把斜面菌种、固体穿刺培养物或菌悬液 等,直接放入4～5℃冰箱中。保藏时间一 般不超过3个月,到时必须进行移接传代, 再放回冰箱。
2）砂土管保藏法---将干燥砂粒与细土混合 后灭菌制成砂土管,然后接种保藏 。若把 砂土管放在低温或抽气后密封,效果更佳。 此法适用于产孢子及芽孢菌种的保藏。 保藏期1～10年 3）石蜡油封藏法---向培养好的菌种斜面上, 加入灭菌石蜡油,高出斜面1cm,然后蜡封 管口,放入冰箱。该法既可防止培养基水 分蒸发,又能使菌种与空气隔绝。保藏期 1～ 2年
美国的“美国典型菌种收藏所”(ATCC)，保藏 方式主要采用冷冻干燥和液氮超低温冻结法。
2、衰退的防止
（1）控制传代次数 （2）创造良好的培养条件 （3）利用不易衰退的细胞传代 （4）采用有效的菌种保藏方法
二、菌种的复壮
1、复壮的定义：
狭义复壮：指的是在菌种已在发生衰退的情况下，通 过纯种分离和测定典型性状，生产性能等指标，从 已衰退的群体中筛迁出少数尚未退化的个体，以达 到恢复原菌株固有的性状的相应措施。 广义的复壮：是一项积极的措施，即在菌种的典型特 征或生产性状尚未衰退前，主经常有意识地采服纯 种分离和生产性状的测定工作，以期众中选择到自 发的正变个体。
第五节 菌种的衰退、复壮和保藏
一、菌种的衰退及其防治 1、衰退：是指由于自发突变的结果，而使某种 原有一系列生物学性状发生量变或质变的现象。 如原有形态性状变得不典型了，生长速度变慢， 代谢产物生产能力下降，致病菌对宿主侵染力 的下降，对外界不良条件包括低温、高温或噬 菌体侵染等抵抗能力的下降等。
3、菌种保藏中心
我国由于1979年7月成立了中国微生物菌种 保藏管理委员会(CCCCM),
菌种为什么会退化？如何防止菌种退化以及复壮菌种呢？
菌种为什么会退化？如何防止菌种退化以及复壮菌种呢？在食用菌生产中，由于各种原因，常使菌种遗传物质发生变异，进而出现优良性状减退或消失、产量降低、质量下降等现象，这就是菌种退化。
（一）菌种退化：1.菌种退化的实质：菌种退化的实质是遗传物质发生了可遗传的变异。
菌种退化是一个从量变到质变的渐变过程，当发生有害变异的个体在群体中显著增多，以致占据优势时才会表现出来。
对于群体来说，个别细胞的退化变异会随着细胞的分裂而逐步增加，使衰退的个体逐渐增多，最后使整个群体发生严重的衰退。
虽然菌种退化现象普遍存在，但可以采取适当措施延缓其退化进程，将群体的退化控制在最低限度。
尽管个体的变异可能是一个瞬时的过程，但菌种退化却需要较长的时间。
因此，在退化的菌种中，经常有少数尚未退化的个体，这是菌种复壮的基础。
2.菌种退化的原因与表现：菌种退化的主要原因是交叉感染、自体杂交、基因突变、培养条件不适等，病毒感染也会引起菌种退化。
食用菌菌种感染病毒后，病毒数量不仅会随着菌丝体的扩大繁殖而增加，而且还会通过带毒的孢子传给下一代。
当菌种携带一定浓度的病毒粒子时，在栽培中就会表现出产量降低、质量下降等退化现象。
菌种退化除了与其自身的遗传特性和所处的环境密切相关之外，还受转管次数、机械创伤等外界因素影响。
菌种退化的主要表现是理想的优良性状逐渐丧失，继而出现菌丝生长势弱、代谢能力下降、产量降低、易受病虫害感染等。
3.防止菌种衰退的措施：在某种意义上，菌种退化是必然发生的现象，但依然可以采取多种措施防止菌种过早衰退。
（1）控制母种转管次数：从理论上讲，菌种可以进行多次转接；但由于在操作中菌丝受机械创伤等影响，会使菌种产生突变，而多数突变对菌种是不利的。
因此在可能的情况下，尽量减少转管次数。
实践证明，生产上用的菌种转接控制在5代范围内较为合适。
（2）防止菌种混杂在菌种转接、出菇管理等过程中，加强品种隔离管理，减少品种间相互混杂的机会，防止不同品种的孢子四处传播，以保证优良品种的遗传特性相对稳定。
食用菌技术复习题答案
第一章食用菌基础1.名词解释菌丝：在培养基上向各个方向呈辐射状延伸、分支的每一根细线，称为菌丝。
细胞管状，壁薄、透明，细胞内含有一个、两个或多个细胞核。
菌丝体：是由基质内无数纤细的菌丝交织而成的丝状体或网状体。
单核菌丝：由担孢子萌发后，先形成没有隔膜的多核初生菌丝，然后再形成许多隔膜，使之成为每个细胞仅有一个细胞核的菌丝，称为单核菌丝。
双核菌丝：担子菌类食用菌中，单核菌丝仅占很短时间，两个单核菌丝很快结合，发生质配，但不核配，形成每个细胞内含有二个细胞核的菌丝，称双核菌丝。
锁状联合：是双核菌丝细胞分裂的一种特殊形式，先在双核菌丝的顶端细胞的两核之间的细胞壁上产生一个小突起，形似小分枝，分枝向下弯曲，其顶端与细胞的另一处融合，在显微镜下观察，形似一把锁，故称为“锁状联合”菌核：真菌在生活过程中由菌丝密集而形成的块状或颗粒状的休眠体。
菌索：由菌丝密集而成的绳索状的结构。
其外貌与根相似，故又称根状菌索。
子座：由菌丝密集而成的容纳子实体的垫状结构。
子实体：是食用菌的繁殖器官，是由分化的菌丝体组成，能产生孢子的菌体或菇体。
菌褶：菌盖下面辐射状生长的薄片叫菌褶。
孢子：是一种有繁殖功能的休眠细胞，分为有性孢子和无性孢子两大类。
菌柄：位于菌褶下方，是菌盖的支持物。
菌环：有些食用菌在幼小时，菌柄和菌盖之间有一包膜相连，子实体长大时，该膜破裂，一部分留在菌盖边缘，一部分留在菌柄上。
留在菌柄上的称为菌环。
菌托：有些食用菌幼年时，其菌蕾的外包着一层膜。
菌蕾长大，外膜破裂，留在菌柄基部的残膜称为菌托。
同宗配合：由一个担孢子萌发的两条单核菌丝能进行结合而生育后代者，称为同宗结合或自交亲和。
初级同宗配合：由同核体产生的同宗结合，如草菇：细胞内两个核没有遗传性差异。
（次级同宗配合：由异核体产生的同宗结合，如双孢蘑菇：担子上只生两个担孢子，每个担孢子含有一对异核体。
异宗配合：多数食用菌的单核菌丝有性别之分，常用“－”与“＋”表示。
菌种的衰退、复壮和保藏
第五节菌种的衰退、复壮和保藏性状稳定的菌种是微生物学工作最重要的基本要求，否则生产或科研都无法正常进行。
影响微生物菌种稳定性的因素有变异、污染、死亡。
由于微生物的多样性，不同的微生物往往对不同的保藏方法有不同的适应性，迄今为止尚没有一种方法能被证明对所有的微生物均适宜。
因此，在具体选择保藏方法时必须对被保藏菌株的特性、保藏物的使用特点及现有条件等进行综合考虑。
对于一些比较重要的微生物菌株，则要尽可能多的采用各种不同的手段进行保藏，以免因某种方法的失败而导致菌种的丧失。
一、斜面冰箱保藏法一种短期、过渡的保藏方法，用新鲜斜面接种后，置最适条件下培养到菌体或孢子生长丰满于4℃冰箱保存。
保存期3月到6月。
二、沙土管保藏法适合于产孢子或芽孢的微生物。
首先，将沙与土洗净、烘干、过筛，按沙与土的比例为1—2：1混合均匀，分装于小试管中，料高1厘米左右，121C间歇灭菌三次，烘干备用。
一般沙80目，土80一100目。
其次，将孢子制成悬浮液，接入沙土管。
或将斜面孢子刮下直接与沙土混合，置干燥器中用真空泵抽干，冰箱内保存。
保存期1年左右。
三、菌丝速冻法不产孢子或芽孢的M可用甘油菌丝速冻法。
该法保藏温度为-20℃，为避免M受损伤致死，需甘油作保护剂。
甘油最终浓度为25％。
操作：①、配制浓度为50％的甘油溶液，121℃灭菌后备用；②、制备菌悬液，一般浓度为108～1010个/mL；③、菌悬液和甘油溶液等体积混合均匀，置-20℃保藏。
四、石蜡油封存法向培养成熟的菌种斜面上，倒入一层灭过菌的石蜡油，量高出斜面1cm，然后保存在冰箱中。
此法适于不能利用石蜡油作碳源的细菌、霉菌、酵母等M的保存。
保存期约1年五、真空冷冻干燥保藏法是目前国内外较理想的常用方法。
其基本原理是在较低温度下(-18℃)，快速地将细胞冻结，并且保持细胞完整，然后在真空中使水分升华。
在这样的环境中，M的生长和代谢暂时停止，不易发生变异。
菌种可保存5年左右。
菌种的管理和保藏
生物安全：加 强生物安全管 理防止菌种泄
漏和污染
应用拓展：扩 大菌种保藏的 应用领域如食 品、医药、环
保等
感谢观看
汇报人：
菌种保藏设施与设备
低Байду номын сангаас冰箱： 用于保存菌 种温度控制 在-20℃以下
超低温冰箱： 用于长期保 存菌种温度 控制在-80℃
以下
干燥器：用 于干燥菌种 防止菌种受
潮
培养基：用 于培养菌种 提供营养物
质
灭菌锅：用 于灭菌防止
菌种污染
生物安全柜： 用于操作菌 种防止菌种 污染和传播
01
菌种保藏的应用
农业领域
生物能源：用于 生产生物燃料如 乙醇、生物柴油 等
医学领域
疫苗生产：用于生产疫苗提高疫苗的质量和产量 抗生素生产：用于生产抗生素提高抗生素的产量和质量 生物制药：用于生物制药提高药物的疗效和安全性 基因工程：用于基因工程提高基因工程的效率和准确性
环境领域
土壤修复：利用 微生物降解污染 物改善土壤质量
菌种保藏技术
低温保藏：将菌种置于低温环境中如冰 箱、冷库等
真空保藏：将菌种置于真空环境中如 真空包装、真空罐等
干燥保藏：将菌种干燥后置于干燥环 境中如干燥器、干燥箱等
化学保藏：将菌种置于化学环境中如 化学试剂、化学溶液等
液氮保藏：将菌种置于液氮环境中如液 氮罐、液氮冷冻机等
辐射保藏：将菌种置于辐射环境中如 紫外线、伽马射线等
命名规则：采用拉丁文或英文进 行命名
命名示例：Escherichi coli K12
菌种鉴定与保藏
菌种鉴定：通过形态学、生理生化和分子生物学等方法进行鉴定 菌种保藏：包括低温保藏、干燥保藏、液氮保藏等方法 菌种管理：包括菌种登记、菌种库管理、菌种使用等环节 菌种保藏的重要性：确保菌种的纯度和活性防止菌种退化和污染
第六章 菌种复壮衰退及保藏(与“菌种”相关文档)共44张PPT
（5）采用有效的菌种保藏方法
菌种保藏的温度、所用的培养基等可影响自发突变。
（二）菌种的复壮（rejuvenation）
1. 定义
狭义的复壮：
是指菌种已发生衰退后，通过纯种分离和测定典型
性状、生产性能等指标，从已衰退的群体中筛选出 少数尚未退化的个体，以达到恢复原菌株固有性状 的相应措施。
（3）淘汰已衰退的个体
S. microflavus“5406”农用抗生菌的分生孢 子，采用－10～－30℃的低温处理5～7天，退 化的个体死亡，留下的10％～20％个体是未退 化的。
二、菌种的保藏
菌种（culture，stock culture）
是一种极其重要和珍贵的生物资源。
菌种保藏（preservation，conservation，maintenance）
纯种分离的方法
粗放
“菌落纯”水平（pure culture in colony lever）
“菌株纯”水平（pure culture in strain lever）
精细
（2）通过宿主体复壮
针对病原菌
衰退的病原菌 接种
活的 “选择性培养基
”
相应的昆虫或动、植物宿主体内
多次选择
从典型的病灶部分分离到恢复原始独立的复壮菌株
（1）定期移植保藏法
操作方法：
将菌种接种在斜面、液体或穿刺培养基上，待生 长完全后，置普通冰箱4℃保藏，湿度50％～70％ 以下，棉塞换成不通气橡皮塞更好。
（国一立） 典国型内菌种收藏馆（NCTC）
抗东生京素 大菌学种应保用藏微管生理物中研心究所（TAM）
创微造生一 物个菌适落合形原态种或的个生体长形条态件的，变就化可；在一定程度上防止菌种衰退 ；
菌种复壮
衰退（degeneration）：菌种在培养或保藏过程中，由于自发突变的存在，出现某些原有优良生产性状的劣化、遗传标记的丢失等现象，称为菌种的衰退。
菌种衰退不是突然发生的，而是从量变到质变的逐步演变过程。
开始时，在群体细胞中仅有个别细胞发生自发突变（一般均为负变），不会使群体菌株性能发生改变。
经过连续传代，群体中的负变个体达到一定数量，发展成为优势群体，从而使整个群体表现为严重的衰退。
经分析发现，导致这一现象的原因有以下几方面。
1. 基因突变（1）有关基因发生负突变导致菌种衰退菌种衰退的主要原因是有关基因的负突变。
如果控制产量的基因发生负突变，则表现为产量下降；如果控制孢子生成的基因发生负突变，则产生孢子的能力下降。
菌种在移种传代过程中会发生自发突变。
虽然自发突变的几率很低(一般为10-6～10-9)，尤其是对于某一特定基因来说，突变频率更低。
但是由于微生物具有极高的代谢繁殖能力，随着传代次数增加，衰退细胞的数目就会不断增加，在数量上逐渐占优势，最终成为一株衰退了的菌株。
（2）表型延迟造成菌种衰退表型延迟现象也会造成菌种衰退。
如，在诱变育种过程中，经常会发现某菌株初筛时产量较高，进行复筛时产量却下降了。
）质粒脱落导致菌种衰退3（质粒脱落导致菌种衰退的情况在抗生素生产中较多，不少抗生素的合成是受质粒控制的。
当菌株细胞由于自发突变或外界条件影响（如高温），致使控制产量的质粒脱落或者核内DNA和质粒复制不一致，即DNA复制速度超过质粒，经多次传代后，某些细胞中就不具有对产量起决定作用的质粒，这类细胞数量不断提高达到优势，则菌种表现为衰退。
2. 连续传代连续传代是加速菌种衰退的一个重要原因。
一方面，传代次数越多，发生自发突变（尤其是负突变）的几率越高；另一方面，传代次数越多，群体中个别的衰退型细胞数量增加并占据优势越快，致使群体表型出现衰退。
3. 不适宜的培养和保藏条件不适宜的培养和保藏条件是加速菌种衰退的另一个重要原因。
第二章菌种选育、保藏与复壮
（一）样品采集
① 原则
样品来源越广泛，获得新菌种的可能性越大。
② 土壤采样方法
土壤的细有菌机、质放线含菌量：和耕通地风、状菜园况和（近5～郊土25壤cm；深度） 土壤的酵p母H和菌植：果被园状树况根的土壤中；
•pH＜7.0 ：霉菌、酵母菌居多 地理条霉件 菌：动植物残体及霉腐土层中； 季•p节H7.条0黑件～曲7.霉5：：细稻菌场、、谷放物线堆菌积丰处富。
黑曲霉
黑曲霉 栖土曲霉 根霉 毛霉 青霉菌 木霉菌 黄曲霉菌 红曲霉
产物 谷氨酸 肌苷酸 淀粉酶 蛋白酶
葡萄糖异构酶
酒精 单细胞蛋白 乳糖酶 柠檬酸 柚苷酶、酸性蛋白
酶 单宁酶、糖化酶 蛋白酶 糖化酶、甾体激素 蛋白酶 葡萄糖氧化酶 纤维素酶 淀粉酶 糖化酶、红曲色素
用途 食用、医药 食用、医药 葡萄糖、糊精、酒精发酵、啤酒酿造 酱油速酿、饲料
❖ 控制传代次数：不超过7代，易变异的不过5代 ❖ 砂土管、冻干管保藏的原种，开启不能超过3次，以防污染。 ❖ 选择良好保藏方法：保证菌不死、不衰、保存活性及原有典型性状 ❖ 良好的培养条件：注意斜面菌株的培养条件（保藏、活化培养基） ❖ 采用不同类型的细胞进行接种
产孢子霉菌 细菌
二、菌种的复壮
❖ 自然选育的定义
利用微生物在一定条件下产生自发变异，通过分离、筛选，排除劣质性 状的菌株，选择出维持原有生产水平或具有更优良生产性能的高产菌株， 达到纯化与复壮菌种、保持稳定生产性能的目的。其主要原理是微生物 群体分离。
❖ 自然选育的方法
（1）通过表现形态淘汰不良菌株； （2）考察目的代谢产物产量； （3）进行遗传基因型纯度试验，考察菌种纯度； （4）传代稳定性试验：斜面传3-5代。
❖ 菌种退化的主要表现 ① 产量下降，目的代谢产物减少，原料转化率下降； ② 生长速度缓慢，目的代谢产物合成能力下降，发酵周期延长； ③ 产孢子能力变弱，孢子形成数量减少； ④ 抗逆性减弱； ⑤ 形态畸形等。
菌种保藏与复苏
定期移植法亦称传代培养保藏法，包括斜面培养、穿刺培养、液体培养等。
是指将菌种接种于适宜的培养基中，最适条件下培养，待生长充分后，于4～6℃进行保存并间隔一定时间进行移植培养的菌种保藏方法。
操作步骤如下：1 培养基制备1.1 器皿准备培养基制备过程中所用的一些玻璃器皿，如三角瓶、试管、培养皿、烧杯、吸管等，经洗涤、干燥、包装、灭菌后使用。
1.2 溶解培养基配料先在烧杯中放适量水，按培养基配方称取各项材料，依次将缓冲化合物、主要元素、微量元素、维生素等材料加入水中溶解，最后加足水量，搅拌均匀。
1.3 调pH值配料溶解后将培养基冷却至室温，根据要求加稀酸（0.1mol/L盐酸）或稀碱(10%氢氧化钠)调pH值。
加酸或碱液时要缓慢、少量、多次搅拌，防止局部过碱或过酸而导致测量不准确和营养成分被破坏。
1.4 加凝固剂配制固体培养基时需加凝固剂，如琼脂、明胶等。
将凝固剂加入液体培养基中，加热并不断搅拌至融解，再补足所蒸发水分。
1.5 过滤分装在二层纱布中间夹入脱脂棉，将配好的培养基趁热过滤并分装。
斜面培养基分装量约为试管高度的四分之一(4～5mL)，穿刺培养基分装量以试管高度的二分之一为宜。
分装过程中勿使培养基沾污管口，以免弄湿棉塞造成污染。
1.6 包扎标记将试管加棉塞，外面包扎一层牛皮纸或铝箔并注明培养基名称及配制日期。
1.7 灭菌根据要求将培养基灭菌，通常蒸汽灭菌为121℃，15～20min。
1.8 斜面摆放灭菌后及时摆放斜面，斜面长度不超过试管管长的二分之一为宜。
1.9 无菌检查将灭菌的培养基放入培养箱中作无菌检验，通常30℃培养1～3天。
无菌检查合格后将其保存于4℃下备用。
2接种2.1 斜面接种2.1.1 点接把菌种点接在斜面中部偏下方处。
适用于扩散型生长及绒毛状气生菌丝类霉菌（如毛霉、根霉等）。
2.1.2 中央划线从斜面中央自下而上划一直线。
适用于细菌和酵母菌等。
2.1.3 稀波状蜿蜒划线法从斜面底部自下而上划“之”字形线。
菌种保存方法和菌种的衰退复壮
菌种保存方法和菌种的衰退复壮菌种保存方法微生物具有容易变异的特性，因此，在保藏过程中，必须使微生物的代谢处于最不活跃或相对静止的状态，才能在一定的时间内使其不发生变异而又保持生活能力。
低温、干燥和隔绝空气是使微生物代谢能力降低的重要因素，所以，菌种保藏方法虽多，但都是根据这三个因素而设计的。
保藏方法大致可分为以下几种：1．传代培养保藏法又有斜面培养、穿刺培养、疱肉培养基培养等（后者作保藏厌氧细菌用），培养后于4—6℃冰箱内保存。
2．液体石蜡覆盖保藏法是传代培养的变相方法，能够适当延长保藏时间，它是在斜面培养物和穿刺培养物上面覆盖灭菌的液体石蜡，一方面可防止因培养基水分蒸发而引起菌种死亡，另一方面可阻止氧气进入，以减弱代谢作用。
3．载体保藏法是将微生物吸附在适当的载体，如土壤、沙子、硅胶、滤纸上，而后进行干燥的保藏法，例如沙土保藏法和滤纸保藏法应用相当广泛。
4．寄主保藏法用于目前尚不能在人工培养基上生长的微生物，如病毒、立克次氏体、螺旋体等，它们必须在生活的动物、昆虫、鸡胚内感染并传代，此法相当于一般微生物的传代培养保藏法。
病毒等微生物亦可用其他方法如液氮保藏法5．冷冻保藏法可分低温冰箱（-20—-30℃，-50—-80℃）、干冰酒精快速冻结（约-70℃）和液氮（-196℃）等保藏法。
6．冷冻干燥保藏法先使微生物在极低温度（-70℃左右）下快速冷冻，然后在减压下利用升华现象除去水分（真空干燥）。
有些方法如滤纸保藏法、液氮保藏法和冷冻干燥保藏法等均需使用保护剂来制备细胞悬液，以防止因冷冻或水分不断升华对细胞的损害。
保护性溶质可通过氢和离子键对水和细胞所产生的亲和力来稳定细胞成分的构型。
保护剂有牛乳、血清、糖类、甘油、二甲亚砜等。
三、器材细菌、酵母菌，放线菌和霉菌；肉膏蛋白胨斜面培养基，灭菌脱脂牛乳，灭菌水，化学纯的液体石蜡，甘油，五氧化二磷，河沙，瘦黄土或红土，冰块、食盐，干冰，95％酒精，10％盐酸，无水氯化钙；灭菌吸管，灭菌滴管，灭菌培养皿，管形安瓿管，泪滴形安瓿管（长颈球形底），40目与100目筛子，油纸，滤纸条（0．5×1．2c m），干燥器，真空泵，真空压力表，喷灯，L形五通管，冰箱，低温冰箱（-30℃），液氮冷冻保藏器。
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• 向培养好的斜面培养物中注入3～5mL无菌水，洗 下细胞或孢子制成菌悬液。用无菌吸管吸取菌悬 液，均匀滴入沙土管中，每管0.2～0.5mL。放线 菌和霉菌可直接挑取孢子拌入沙土管中。 • 真空抽去沙土管中水分。 • 将沙土管用火焰熔封后存放于低温(4～6℃)干燥 处保藏，每隔半年检查一次菌种存活性及纯度。 或将沙土管直接用牛皮纸或塑料纸包好，置干燥 器内保存。 • 保藏时间2～10年。
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培养： 将接种后的培养基放入培养箱中，在适宜的条件下培养 至细胞稳定期或得到成熟孢子。细菌培养温度一般为30～ 37℃，真菌培养温度一般为25～28℃。 保藏： 培养好的菌种于4～6℃保存，根据要求每3～6个月移植 一次。某些菌种，如芽裂酵母，阿舒假囊酵母，棉病囊霉 等，须1～3个月移植一次。 保藏湿度用相对湿度表示，通常为50%～70%。 斜面菌种应保藏相继三代培养物以便对照，防止因意外 和污染造成损失。
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复苏方法： —— 先用70%酒精棉花擦拭安瓿上部， —— 将安瓿管顶部烧热， —— 用无菌棉签沾冷水，在顶部擦一圈，顶 部出现裂纹，用挫刀或镊子颈部轻叩一下， 敲下已开裂的安瓿管的顶端， —— 用无菌水或培养液溶解菌块，使用无菌 吸管移入新鲜培养基上，进行适温培养。
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6、定期进行分离纯化 定期进行分离纯化，对相应指标进行检查，也是有效 防止菌种衰退的方法。
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二、菌种的复壮
侠义的复壮 ：菌种已经发生衰退后，再通过纯
种分离和性能的测定等方法，从衰退的群体中 找出尚未衰退的少数个体，以达到恢复该菌种 原有典型性状的一种措施。
3 菌种保藏的基本措施是低温、干燥、真空。
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• 世界上国际知识产权组织承认的法定保藏机构有 28家。 Ex： 美国的标准菌种保藏所（ATCC） 美国农业部农业研究服务部（ARS） 英国国立标准菌种保藏所（NCTC） 我国：中国科学院微生物研究所的普通微 生物菌种保藏管理中心（CCGMC） 武汉大学的中国典型培养物保藏中心 （CCTCC）
第三章
菌种的衰退、复壮与保藏
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第一节
菌种的衰退和复壮
一、菌种的衰退
菌种衰退（degeneration）是指菌种经 过长期人工培养或保藏，由于自发突变的作 用而引起某些优良特性变弱或消失的现象。
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（一）菌种衰退的具体表现
1、菌落和细胞形态改变。每一种微生物在一定的培养条件 下都有一定的形态特征，如果典型的形态特征逐渐减少， 就表现为衰退。 2、生长速度缓慢，产孢子越来越小。 3、代谢产物生产能力的下降，即出现负突变。 4、致病菌对宿主侵染能力下降。
石蜡油封藏法 • 措施：阻隔了空气，使菌体处于缺氧状态下，而
且又防止了水分挥发。
• 方法：液体石蜡150～170℃烘箱内灭菌lh；或121℃高
压蒸汽灭菌60～80min，再置于80℃的烘箱内烘干除去水 分→倒入菌种管中（高出1cm） → 4℃保存。
• 适用：霉菌、酵母菌、放线菌、好氧性细菌等 • 保藏期：1～2年，或更长
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二、微生物菌种保藏技术
原理：根据微生物的生理生化特性，人为地创造 条件，使孢子或菌体处于代谢不活泼，生长繁殖 受到抑制的休眠状态，以减少菌种的变异。一般 可通过保持培养基营养成分在最低水平，缺氧状 态，干燥和低温等。
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•斜面保藏法 •穿刺保藏法 •石蜡油封藏法 •沙土管干燥保藏法
60目筛
弃去大颗粒及杂质 去除有机物
80目筛
去掉细沙
吸铁石
10％～20％的 盐酸浸泡24h 水洗至中性 烘干或晒干
土：取地面下40～60cm非耕作层贫瘠且粘性较小的土，研碎， 100目过筛,水洗至中性，烘干。
将处理后的沙、土按质量比2∶1混合。混匀的沙土分装入 安瓿管或小试管中，高度为1cm左右，塞好棉塞，121℃湿热灭 菌30min。
5、对外界不良条件（包括低温、高温或噬菌体侵染等）抵 抗能力的下降等。
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总之，退化是发生在群体细胞中的一个从量变到 质变的逐步演变过程，由于个别突变细胞表现生 长优势，导致在群体中最后数量占优势。
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（二）菌种衰退的原因
1、基因突变 （1）有关基因发生负突变导致菌种衰退 菌种衰退的主要原因是有关基因的负突变。 （2）表型延迟造成菌种衰退 如，在诱变育种过程中，经常会发现某菌株初筛时产 量较高，进行复筛时产量却下降了。
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砂土管干燥保藏法 • 措施：无营养，缺氧，干燥 • 方法：孢子或芽孢悬液 → 加入无菌砂 土管中→ 干燥→ 封口 → 5℃保藏 • 适用：产孢子的丝状真菌、放线菌；有 芽孢的细菌 • 保藏期：1~10年或更长
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沙土管制作
沙：
河沙 吸去铁质
广义的复壮 ：一种积极的措施，即在菌种的生
产性能尚未衰退前经常有意识地进行纯种分离 和生产性能的测定工作，使菌种地生产性能逐 步提高。
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复壮措施方法
• • • • 纯种分离法 寄主体内复壮法 淘汰法 遗传育种法
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1、纯种分离法
通过纯种分离,可将衰退菌种细胞群体中一部分仍保 持原有典型性状的单细胞分离出来,经扩大培养,就可恢复 原菌株的典型性状。 “菌落纯”的水平——稀释平板法、涂布平板法、平板划线 法等方法获得单菌落。 “细胞纯”即“菌株纯”的水平——培养皿或凹玻片等作分 离室的方法、显微操纵器的纯种分离法。
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沙土管恢复培养
无菌条件下打开沙土管， 取部分沙土粒于适宜的斜 面培养基上，长出菌落后 再转接一次。或取沙土粒 于适宜的液体培养基中， 增殖培养后再转接斜面。
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真空冷冻干燥保藏法：
措施：低温、干燥，缺氧，保护剂 方法：菌种培养 → 用保护剂悬浮→ 加入安醅管中→低温冻结（-25~-40℃）→ 抽真空→ 真空封口 → 4-5℃保藏 适用：各大类（不产孢子的丝状真菌除外） 保藏期：5~10年或更长 常用的保护剂有脱脂牛奶、血清、淀粉、葡 聚糖等高分子物质。
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3、不适宜的培养和保藏条件 不适宜的培养和保藏条件是加速菌种衰退的另一个重 要原因。不良的培养条件如营养成分、温度、湿度、pH值、 通气量等和保藏条件如营养、含水量、温度、氧气等，不 仅会诱发衰退型细胞的出现，还会促进衰退细胞迅速繁殖， 在数量上大大超过正常细胞，造成菌种衰退。
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（三）菌种衰退的防治
1、控制传代次数
即尽量避免不必要的移种和传代，将必要的传代降低到最低 限度，以减少自发突变的机率。
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2、创造良好的培养条件
1)结构类似物抗性菌株在保藏培养基中应添加相应药物，及时淘汰回复 突变细胞。 2)基因工程菌添加抗生素于培养基中防止质粒的丢失。
（3）质粒脱落导致菌种衰退
质粒脱落导致菌种衰退的情况在抗生素生产中较多， 不少抗生素的合成是受质粒控制的。
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2、连续传代 连续传代是加速菌种衰退的一个重要原因。 一方面，传代次数越多，发生自发突变（尤其是负突 变）的几率越高； 另一方面，传代次数越多，群体中个别的衰退型细胞 数量增加并占据优势越快，致使群体表型出现衰退。
长期保藏——砂土保藏法、冷冻干燥保藏法及液氮保藏法等方法。
对于比较重要的菌种，尽可能采用多种保藏方法。
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5、讲究菌种选育技术
在菌种选育时，应尽量使用单核细胞或孢子，并采用较高剂量使 单链突变而使另一单链丧失作为模板的能力,避免表型延迟现象。同 时，在诱变处理后应进行充分的后培养及分离纯化，以保证菌种的纯 度。
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4、遗传育种法
即把退化的菌种，重新进行遗传育种，从中再选出高 产而不易退化的稳定性较好的生产菌种。
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第二节 菌种的保藏
一、理想的菌种保藏方法应具备的条件
1 经长期保藏后菌种存活健在； 2 保证高产突变株不改变表型和基因型，特别是不改 变初级代谢产物和次级代谢产物生产的高产能力。
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3、淘汰法
将衰退菌种进行一定的处理（如药物，低温、高温 等），往往可以起到淘汰已衰退个体而达到复壮的目的。 例如： 有人曾将“5406”的分生孢子在低温(－10～30℃)下处 理5～7d，使其死亡率达到80％，结果发现在抗低温的存 活个体中留下了未退化的健壮个体。
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菌种的准备可采用下列几种方法： • 刮取培养物斜面上的孢子或菌体，与保护剂混匀 后加入冻存管内； • 接种液体培养基，振荡培养后取菌悬液与保护剂 混合分装于冻存管内； • 将培养物在平皿培养，形成菌落后，用无菌打孔 器从平板上切取一些大小均匀的小块（直径约510毫米），真菌最好取菌落边缘的菌块，与保护 剂混匀后加入冻存管内； • 在小安瓿管中装1.2-2毫升的琼脂培养基，接种菌 种，培养2-10天后，加入保护剂，待保藏。
•真空冷冻保藏法 •液氮保藏法 •悬滴保藏法 •低温保藏法 •麸皮保藏法
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