CHO细胞大规模悬浮培养流程简介
CHO细胞大规培养
摘要CHO细胞是中国仓鼠卵巢细胞(Chinese Hamster Ovary，CHO)，1957年美国科罗拉多大学Dr. Theodore T. Puck从一成年雌性仓鼠卵巢分离获得，为上皮贴壁型细胞。
微载体细胞培养开始于19世纪60年代末期，最早使用离子交换凝胶（DEAE-Sephadex A50）作为载体，轻微搅动即可悬浮在培养基中。
由于这种微载体带有电荷，利于细胞贴附于载体上进行生长繁殖。
载体处于悬浮状态时，这样既可大大增加细胞附着面积，又使细胞能与培养基充分接触，进而有利于细胞的生长，因此能达到大量培养细胞的目的。
后来根据细胞附着生长的特点，对微载体进行改良，使其电荷或其介质更利于细胞附着和生长。
培养液中大量的微载体为细胞提供了极大的附着表面，1 g 微载体其比表面积可达6000 cm2，从而可实现细胞的高密度培养。
首先将CHO细胞在无血清培养基（SAF-CHO-G-004）中进行无血清驯化。
其次将CHO细胞（成功用无血清驯化后的细胞）用0.25%胰酶消化制成细胞悬液后，沿导流管加入含明胶微载体和SAF-CHO-G-004细胞培养基的WhcltonBioster瓶罐中连续培养生成一定量的种子细胞。
最后将种子细胞进行大规模培养。
运用半连续式培养来操作：在细胞增长和产物形成过程中，每间隔一段时间，从中取出部分培养物，再用新的培养液补足到原有体积，使反应器内的总体积不变。
最后在细胞培养过程中进行细胞常数的检查和培养基内污染物的检测一些抗凋亡策略来增加细胞培养的效率。
[关键字]CHO细胞;明胶微载体;无血清培养;半连续式培养目录摘要 (1)关键字：CHO细胞明胶微载体无血清培养半连续式培养 (1)绪论 (3)1.2CHO细胞培养的特性 (3)2.2.1培养基的物理性质 (5)2.2.2无血清培养 (7)3.1.2蛋白质作基质的微载体 (8)3.1.3微载体培养原理与操作 (9)3.2.2微载体培养种子细胞 (12)3.2.3微载体培养的细胞传代 (12)3.3半连续式培养（semi-continuous culture）操作 (12)4.2细胞常数检查 (14)4.3CHO细胞培养内污染物的检测 (14)4.3.2真菌污染对细胞的影响及污染物的检测 (15)4.3.3支原体污染对细胞影响及污染物的检测 (16)5抗凋亡策略在细胞大规模培养中的应用 (16)5.1 营养物质抗凋亡 (17)5.2 基因抗凋亡 (17)5.3 化学方法抗凋亡 (17)参考文献： (18)绪论1.1引言CHO细胞是中国仓鼠卵巢细胞(Chinese Hamster Ovary，CHO)，1957年美国科罗拉多大学Dr. Theodore T. Puck从一成年雌性仓鼠卵巢分离获得，为上皮贴壁型细胞，是目前生物工程上广泛使用的细胞系。
CHO细胞克隆株放大培养与筛选1
CHO细胞克隆株放大培养与筛选方案一CHO细胞无血清驯化1.从6孔板中开始进行复苏培养，时间周期大致为48h后，进行换液培养48h，再从6孔板中转移到T25中（黄子健：几传几），正常培养48h后，进行换液培养48h，再从T25转移到T75中（黄子健：几传几）。
在T25和T75中可分别进行细胞冻存保种处理。
2.从T25中放大到摇瓶中悬浮培养（多种方法需要摸索）1.将无血清细胞培养基和含血清培养基的按1：1（V/V）的比例进行混合，接种密度为2－4×105cells/ml的细胞，在37℃、5％CO2培养箱进行培养。
2.根据细胞生长和活率情况，在降血清的每一阶段可稳定传代1－3代，接种密度维持在2- 4×105cells/ml。
3.逐步提高无血清细胞培养基在混合液中的比例（V/V），即降低混合液中的血清含量，传代过程的细胞接种密度仍维持为2- 4×105cells/ml。
4.直至混合液中的血清浓度降低至0.1-0.2%，每一代的细胞活率大于90％后，此时可将细胞完全培养在CHO无血清无动物组分培养基中。
5.在CHO无血清无动物组分培养基中进行放大培养，建立起适应无血清无动物组分培养的CHO种子细胞库方案二连续驯化-条件培养基进行驯化1.由于从75% 无血清培养基（SFM）到100% 无血清培养基（SFM）的变化对细胞的压力过大，因此，可能需要将细胞在10% 补加血清培养基与90% 无血清培养基（SFM）的混合培养基中传代培养2-3 次。
2.在100％无血清培养基（SFM）中传代3次后，大多数细胞系即可认为完全适应。
在将培养基转换为100％无血清培养基（SFM）之前，偶尔也会出现细胞无法通过某一步骤的情况。
3.如果出现这种情况，使用先前补加血清培养基与无血清培养基的比例返回并继续传代培养 2 至 3 次。
悬浮细胞培养技术讲义
细胞培养技术相关知识简介一.培养细胞生长过程：潜伏期→指数增生期→停滞期1.1 潜伏期(latent phase)细胞接种后,先经过一个在培养液中呈悬浮状态的悬浮期.此时,细胞质回缩, 胞体呈圆球形.然后细胞贴附于载体表面,称贴壁,悬浮期结束. 细胞贴壁速度与细胞种类, 培养基成分,载体的理化性质等密切相关。
一般情况下，原代培养细胞贴壁速度慢,可达10-24 小时或更多, 而传代细胞系贴壁速度快, 通常10-30 分钟即可贴壁。
细胞贴壁后还需经过一个潜伏阶段，才进入生长和增殖期.原代培养细胞潜伏期长，约24-96 小时或更长, 连续细胞系和肿瘤细胞潜伏期短，仅需6-24 小时。
1.2 指数增生期(logarithmic growth phase)这是细胞增殖最旺盛的阶段，分裂相细胞增多。
指数增生期细胞分裂相数量可作为判定细胞生长是否旺盛的一个重要标志。
通常以细胞分裂相指数（Mitotic index, MI）表示，即细胞群中每1000 个细胞中的分裂相数。
一般细胞的分裂指数介于0.1%-0.5%，原代细胞分裂指数较低，而连续细胞和肿瘤细胞分裂相指数可高达3％－5％。
指数增生期的细胞活力最好时期，是进行各种实验最佳时期，也是冻存细胞的最好时机。
在接种细胞数量适宜情况下，指数增生期持续3－5 天后，随着细胞数量不断增多、生长空间减少，最后细胞相互接触汇合成片。
正常细胞相互接触后能抑制细胞运动，这种现象称接触抑制现象(contact inhibition)。
而恶性肿瘤细胞无接触抑制现象，能继续移动和增殖，导致细胞向三维空间扩展，使细胞发生堆积（piled up）。
细胞接触汇合成片后，虽然发生接触抑制，但只要营养充分，细胞仍能进行增殖分裂，因此细胞数仍然在增多。
但是，当细胞密度进一步增大，培养液中营养成分减少，代谢产物增多时，细胞因营养枯竭和代谢产物的影响，导致细胞分裂停止，这种现象称密度抑制现象（Density Inhibition）。
细胞悬浮培养技术操作方法
细胞悬浮培养技术操作方法细胞悬浮培养技术是一种将细胞悬浮在培养基中进行培养的方法，通常使用铺底培养法（adherent culture）相反。
这种培养方法适用于需要大量细胞且细胞生长速度快的细胞类型，比如淋巴细胞、白血病细胞、肝细胞等细胞线。
本文将介绍细胞悬浮培养技术的操作方法。
1. 培养基的准备细胞的悬浮培养需要用到特殊的培养基。
培养基通常包含以下组成部分：基础培养液、生长因子、血清、抗生素等。
基础培养液是细胞生长所必须的营养成分，生长因子可促进细胞增殖和分化，血清可以为细胞提供必要的营养成分，抗生素则可消除培养基中的细菌等外来微生物，以保证细胞的无菌培养。
准备培养基时要根据细胞类型的不同选择不同的基础培养液和生长因子，培养中要注意保持无菌环境。
2. 细胞的预处理在采集细胞之前，要先对细胞进行预处理。
一般步骤如下：（1）将细胞与培养基混合，然后放入离心管中离心，去掉上层液体，取出细胞沉淀。
（2）用PBS洗涤两次，去除多余的培养基和血清成分。
（3）计算细胞的浓度和活性。
（4）按需要调节细胞浓度，如需稀释时，可添加相应的培养基和血清，不要直接加水。
3. 细胞的培养（1）将经过预处理的细胞放入含有培养基的离心管中，并混匀。
（2）将细胞悬液转移至无菌的试管中，每支试管放入适量的细胞数，通常为1x106/mL。
（3）将试管放入恒温摇床或培养箱中，控制温度和CO2颓量，使其保持适宜的生长环境。
保持培养液离开平均氧化还原电位和pH，避免造成对细胞的损害。
（4）细胞的分裂时间根据不同的细胞类型而不同。
在培养过程中，要不断观察细胞的生长状况，检查并确保细胞数量不会超过最大容纳量。
培养时间的长度也根据细胞类型的不同而不同，一般为数天到数周不等。
4. 细胞提取经过一段时间的培养，细胞数量逐渐增多。
在细胞提取之前，需要先收集细胞。
收集过程如下：（1）取出培养的试管，用离心管小心地沉淀细胞。
（2）将上清部分取出，留下沉淀的细胞。
悬浮细胞培养技术讲义
细胞培养技术相关知识简介一.培养细胞生长过程：潜伏期→指数增生期→停滞期1.1 潜伏期(latent phase)细胞接种后,先经过一个在培养液中呈悬浮状态的悬浮期.此时,细胞质回缩, 胞体呈圆球形.然后细胞贴附于载体表面,称贴壁,悬浮期结束. 细胞贴壁速度与细胞种类, 培养基成分,载体的理化性质等密切相关。
一般情况下，原代培养细胞贴壁速度慢,可达10-24 小时或更多, 而传代细胞系贴壁速度快, 通常10-30 分钟即可贴壁。
细胞贴壁后还需经过一个潜伏阶段，才进入生长和增殖期.原代培养细胞潜伏期长，约24-96 小时或更长, 连续细胞系和肿瘤细胞潜伏期短，仅需6-24 小时。
1.2指数增生期(logarithmic growth phase)这是细胞增殖最旺盛的阶段，分裂相细胞增多。
指数增生期细胞分裂相数量可作为判定细胞生长是否旺盛的一个重要标志。
通常以细胞分裂相指数（Mitotic index, MI）表示，即细胞群中每1000 个细胞中的分裂相数。
一般细胞的分裂指数介于0.1%-0.5%，原代细胞分裂指数较低，而连续细胞和肿瘤细胞分裂相指数可高达3％－5％。
指数增生期的细胞活力最好时期，是进行各种实验最佳时期，也是冻存细胞的最好时机。
在接种细胞数量适宜情况下，指数增生期持续3－5 天后，随着细胞数量不断增多、生长空间减少，最后细胞相互接触汇合成片。
正常细胞相互接触后能抑制细胞运动，这种现象称接触抑制现象(contact inhibition)。
而恶性肿瘤细胞无接触抑制现象，能继续移动和增殖，导致细胞向三维空间扩展，使细胞发生堆积（piled up）。
细胞接触汇合成片后，虽然发生接触抑制，但只要营养充分，细胞仍能进行增殖分裂，因此细胞数仍然在增多。
但是，当细胞密度进一步增大，培养液中营养成分减少，代谢产物增多时，细胞因营养枯竭和代谢产物的影响，导致细胞分裂停止，这种现象称密度抑制现象（Density Inhibition）。
悬浮细胞培养
悬浮细胞培养（颜秋生、张雪琴）悬浮细胞培养是指已建立的愈伤组织或离体的植物细胞，转移到液体培养基中进行无菌振荡培养。
用这种培养方法所得的细胞，较为均匀一致，它不仅为研究细胞的生长和分化提供了一个独特的实验系统，而且细胞增殖速度快，适于进行大规模培养，在植物产品工业化生产上有巨大的应用潜力。
1仪器设备超净工作台、高压灭菌器、旋转摇床、台式离心机、荧光显微镜、刻度离心管(15ml)、三角瓶(300ml)、吸移管等。
2操作方法2.1悬浮细胞的培养2.1.1愈伤组织的诱导：经过表面清毒的植物外植体，置于含有适当激素的固体培养基上，即可建立起组织培养物。
通常使用的激素包括生长素和细胞分裂素。
在这种培养基上，外植体愈伤组织化，这个过程一般是由切口开始，逐渐扩展到接种组织的整个表面。
把愈伤组织由外植体上剥离，转移到成分相同的新鲜培养基上，这个过程称做继代。
通过反复地在琼脂培养基上继代，不但可使愈伤组织不断增殖，扩大数量，而且还能提高愈伤组织的松散性，这对于在液体培养基中建立充分分散的细胞悬浮培养物是非常必要的。
2.1.2分批悬浮培养一般技术：把已建立的外观松散、生长快、浅黄色的愈伤组织转移到含有液体培养基的三角瓶中，然后置于旋转摇床上不断振荡，由此得到的培养物叫做“悬浮细胞培养物”。
在培养过程中，除了气体和挥发性代谢产物可以同外界空气交换外，一切都是密闭的。
培养所用的容器一般是100-250ml三角瓶，每瓶中装有20-50ml培养基。
摇床的转速是可控的，对于大多数植物组织来说，以转速30-150转/分为宜，冲程范围应在2-3cm左右。
转速过高或冲程过大会造成细胞的破裂。
当培养基中的主要营养物质耗尽时，细胞的分裂和生长即行停止。
为了使培养的细胞能不断增殖，必须进行继代，方法是取出培养瓶中一小部分悬浮液，转移到成分相同的新鲜培养基中（大约稀释5倍)。
培养用的液体培养基，对某一特定种而言，凡适合愈伤组织生长的培养基，只要除去其中的琼脂，均可作为悬浮细胞培养基。
细胞悬浮培养
3.细胞密实体积
为了测定细胞密实体积（packed cell volume, PCV )，将一已知体积的均匀分散的悬浮液 （10~20 mL）放入一个刻度离心管（15~50 mL） 中，在2 000~4 000 r/min下离心5 min。细胞密实 体积以每毫升培养液中细胞总体积的毫升数表示。
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(4)镁、钾、钙
到目前为止，几个报道已经表明，这些大量元 素是绝对必要的。有关这些元素如K＋的最适浓度 （胡萝卜为l mmol/L,矮牵牛和烟草为20 mmol/L)的 研究认为，不同培养物在吸收能力方面存在差异。 例如，在大豆等植物的培养中，在培养期间几乎所 有的K＋都被培养细胞所吸收；相反，在烟草的细 胞培养中，发现到了培养末期仍有最初浓度（20 mmol/L）的一半的K＋留在培养基中未被利用 （Kato等，,1977)。
5
为了使分批培养的细胞能不断增殖，必须进行继代，方 法是取出培养瓶中一小部分悬浮液，转移到成分相同的新鲜 培养基中（大约稀释5倍）。
6
滞后期的长短主要取决于在继代时原种培养细 胞所处的生长期和转入细胞数量的多少。
当转入的细胞数量较少时，不但滞后期较长， 而且在一个培养周期中细胞增殖的数量也少。
如果转入的细胞密度很低，则在加入培养单细胞 或小群体细胞所必需的营养物质之前，细胞将不能 生长。
32
（二）抑制法
使用DNA合成抑制剂如5-氨基尿嘧啶、羟基脲和 胸腺嘧啶脱氧核苷等，也可使培养细胞同步化。当 细胞受到这些化学药物的处理之后，细胞周期只能 进行到G1期为止，细胞都滞留在G1期和S期的边界 上。当把这些抑制剂去掉之后，细胞即进入同步分 裂。应用这种方法取得的细胞同步性只限于一个细 胞周期。
30
化学方法的原理是使细胞遭受某种营养饥饿，或 是通过加人某种生化抑制剂阻止细胞完成其分裂 周期。化学方法中常用的有饥饿法和抑制法两种。
cho细胞株构建流程
cho细胞株构建流程
CHO细胞株构建是一种用于大规模生产重组蛋白的技术，其
构建流程大致包括以下步骤：
1. 购买或制备宿主细胞：选择具有良好生长性能和高重组蛋白表达能力的CHO（Chinese hamster ovary）细胞的宿主细胞。
2. 选择筛选标记物：根据需要选择适当的筛选标记物，在细胞中引入相应的抗生素或抗代谢毒物抗性基因。
3. DNA构建：通过基因工程技术将目标基因插入适当的表达
载体中，包括启动子、信号序列和选择标记物等。
4. 转染：将重组蛋白表达载体导入CHO细胞中，使用电穿孔、化学转染或病毒介导等方法将表达载体导入细胞。
5. 选择表达细胞：通过培养基中添加适当的抗生素或抗代谢毒物，在一定浓度下筛选表达载体成功转入的细胞。
6. 单克隆分离：从表达载体成功转入的细胞中挑选出单个表达细胞。
7. 表达与筛选：培养单克隆细胞群，并通过适当的培养基组合、刺激剂添加等方法促进目标基因表达，最终选择表达水平较高的细胞株。
8. 扩增培养：将经过表达和筛选的细胞逐步扩增，以获得大量
的细胞用于后续的蛋白表达和生产。
整个CHO细胞株构建流程涉及到细胞培养、细胞转染、筛选、表达与筛选、单克隆分离等多个步骤，需要精确操作和耐心等待，最终获得高效的CHO细胞株用于大规模重组蛋白的生产。
细胞悬浮培养
另外， 如果缩短两次继代的时间间隔， 例如， 另外 ， 如果缩短两次继代的时间间隔 ， 例如 ， 每 2 ～ 3d 即继代一次 ， 则可使悬浮培养的细胞一 即继代一次， 直保持对数生长。 直保持对数生长。
据报道，加入条件培养基（ 据报道 ， 加入条件培养基 （ 即在其中曾培养过一 段时间植物组织的培养基） 段时间植物组织的培养基 ） 可以显著缩短滞后期 的长度。 的长度。
（二）抑制法 使用DNA 合成抑制剂如 氨基尿嘧啶、 使用 DNA合成抑制剂如 5- 氨基尿嘧啶 、 羟基脲和 合成抑制剂如5 胸腺嘧啶脱氧核苷等， 也可使培养细胞同步化。 胸腺嘧啶脱氧核苷等 ， 也可使培养细胞同步化 。 当 细胞受到这些化学药物的处理之后， 细胞受到这些化学药物的处理之后 ， 细胞周期只能 进行到G 期为止， 细胞都滞留在G 期和S 进行到 G1 期为止 ， 细胞都滞留在 G1 期和 S 期的边界 上 。 当把这些抑制剂去掉之后 ， 细胞即进 入 同步分 当把这些抑制剂去掉之后， 细胞即进入 裂 。 应用这种方法取得的细胞同步性只限于一个细 胞周期。 胞周期。
开放型连续培养的特点
注入的新鲜培养液的体积与流出的原有培养液 及其中细胞的容积相等。 及其中细胞的容积相等。 培养物的生长速度永远保持在一个接近最高值的 恒定水平上（通过调节流入和流出的速度） 恒定水平上（通过调节流入和流出的速度） 。
开放型培养又可分为两种主要方式： 开放型培养又可分为两种主要方式： （控制生长速度的方法） 控制生长速度的方法） 一是化学恒定式； 一是化学恒定式；
如果把愈伤组织在半固体培养基上保存2-3个继代周期， 如果把愈伤组织在半固体培养基上保存 个继代周期， 个继代周期 其松散性常会增加。 其松散性常会增加。
2. 加入特殊物质（较少细胞之间的联系、减慢细胞分裂 较少细胞之间的联系、
细胞悬浮培养
射器，但其进液口的孔径必须小到只能通过单细
胞和小细胞团（ (2-4 个细胞），而不能通过大的
细胞聚集体。继代前应先使三角瓶静置数秒，以
便让大的细胞团沉降下去，然后再由上层吸取悬
浮液。
但是必须记住，即使在分散程度最好的悬浮液 中也存在着细胞团，每个细胞团由几个或几十 个细胞组成，只含有游离细胞的悬浮液是没有
在悬浮培养中，为了使培养基能不停地运动，可以
使用各种类型的设计。
(1)旋转培养 (2)往返震荡培养 (3)旋转震荡培养 (4)搅动培养
旋转培养器
液晶屏双层震荡培养器
磁力搅拌培养器
5.3 悬浮培养细胞的同步化
同步培养是指在培养中大多数细胞都能同时通过
细胞周期的各个阶段(G1，S，G2和M)。同步性程度
加入培养基
排出培养基及其培养物
连续培养的类型 封闭型
开放型
封闭型连续培养的特点
排出的旧培养基由加入的新培养基进行补充，
进出数量保持平衡。 悬浮在排出液中的细胞经机械方法收集起来 之后，又被放回到培养系统中。 随着培养时间的延长，细胞数目不断增加。
开放型连续培养的特点
注入的新鲜培养液的体积与流出的原有培养液 及其中细胞的容积相等。 培养物的生长速度永远保持在一个接近最高值的
细胞分裂所必需的营养成分或激素，使细胞停滞
在 G1 期或 G2 期，经过一段时间的饥饿之后，当重
新在培养基中加入这种抑制法 使用 DNA 合成抑制剂如 5- 氨基尿嘧啶、羟基脲和 胸腺嘧啶脱氧核苷等，也可使培养细胞同步化。当 细胞受到这些化学药物的处理之后，细胞周期只能 进行到 G1 期为止，细胞都滞留在 G1 期和 S 期的边界 上。当把这些抑制剂去掉之后，细胞即进入同步分 裂。应用这种方法取得的细胞同步性只限于一个细 胞周期。
CHO细胞大规模悬浮培养流程简介
❖ 根据细胞密度计算扩培体积 ❖ 当达到反应器扩培接种细胞数量要求后，停止摇瓶培养，接
种至反应器进行扩培
.
3 反应器扩培
❖ 在超净台内将摇瓶细胞合并至接种瓶内 ❖ 用无菌焊接机将接种瓶管路与反应器管路无菌焊接，将细胞
留细胞，收获细胞液 ❖ 将细胞液转入收集罐内或者与纯化进行交接
.
谢谢
.
细胞株
摇瓶
WAVE或者种子罐
收货细胞液
反应器培养
.
1 细胞复苏
❖ 将水浴锅温度调至37℃ ❖ 从液氮罐中取出冻存管，用镊子夹住迅速放入水浴锅中晃动，
直至完全溶解后将冻存管表面消毒转移至超净工作台内进行 操作 ❖ 将细胞悬液转移至15ml离心管内，加入约10ml培养液，轻 轻吹打混匀 ❖ 将细胞悬液经800-1000rpm离心5分钟，弃去上清液 ❖ 向细胞沉淀加入10ml培养液，吹打均匀后将细胞悬液转移至 摇瓶内，加入适量培养液，开始培养
液打入反应器进行扩培 ❖ 当反应器内细胞密度达到要求后，接种至下一级反应器开始
生产阶段培养
.
4 反应器生产阶段培养
❖ 取样 ❖ 补碱 ❖ 补料 ❖ 补糖 ❖ 收获
.
取样
❖ 取样瓶灭菌 ❖ 将取样瓶连接至反应器取样口，开始管路灭菌 ❖ 灭菌完成后等待管路冷却 ❖ 开始取样 ❖ 取样完成后用纯蒸汽冲洗取样管路 ❖ 将所取细胞液测定细胞密度、活力、pH值等参数
.
补碱、补糖、补料
❖ 当反应器内pH值低于6.8左右时，需要进行补碱 ❖ 当反应器内糖含量低于2g/L时，需要进行补糖 ❖ 当反应器内营养物逐渐耗尽，需要根据工艺进行补料
.
CHO细胞克隆株放大培养与筛选2
CHO细胞克隆株放大培养与筛选2方案三细胞的悬浮驯化CHO-K1细胞的悬浮驯化及无血清培养1.取对数生长期的CHO-K1贴壁细胞，采用逐步降血清法将含10% FBS的F12培养基逐步替换为8%、5%、3%、2%、1%、0.5%FBS的F12培养基进行适应培养，每个血清浓度传代培养15~20次，使细胞在各血清浓度培养基里适应生长。
2.取适应0.5% FBS的F12低血清培养基培养条件的CHO-K1贴壁细胞，以5×105 cells/mL的密度接种到125 mL的三角细胞摇瓶中，逐步加入含有50%、70%、80%、90%、100% Sigma Ex-CELL CD CHO细胞培养基，37℃，5% CO2，100 rpm条件下进行培养液的逐步替代培养方案四三阶段悬浮驯化CHO-K1悬浮驯化培养基及驯化方法_肖志华1.将CHO-K1细胞在含有10％FBS的F-12K培养基中培养，当细胞汇合度到70～80％时，加胰酶消化，缓慢吹打混匀，以0 .4×105cells/ml的密度接种至10ml含10％FBS的F-12K培养基中传代，并观察细胞状态。
此阶段培养条件为37℃，体积分数为8％CO2培养箱，静止培养。
当细胞汇合度到70～80％，加胰酶消化并以同样的密度接种至10ml含5％FBS的F-12K培养基中。
培养两代后，用同样的方法将血清逐步降低至2.5％，培养3代，随着血清含量降低，起初细胞生长变慢，待细胞轮廓清晰、伸展状态良好之后，开始下一步降血清处理，通常细胞适应2-3代后，在血清降至2.5％之前，细胞都可以很快地扩增。
（阶段Ⅰ）2.条件培养基(Condition Medium，CM)制备：细胞在含有2 .5％FBS的F-12K培养基2-3天后，收集培养上清200g离心5分钟后，用0 .22μm的无菌滤膜过滤后待用。
3.细胞在含有2 .5％FBS的F-12K培养基中培养3代，细胞汇合度到70～80％时，用PBS洗两遍，加入胰酶消化，消化30秒后弃去胰酶，待细胞消化变圆以后，加入完全培养基（含血清）终止消化。
悬浮细胞传代流程
悬浮细胞传代流程
悬浮细胞的传代
悬浮细胞传代比贴壁细胞传代稍微简单一些。
由于细胞已经在生长培养基中悬浮，因此无需通过酶的作用使其从培养容器表面脱离，整个过程较为迅速，对细胞的损伤也较小。
悬浮生长细胞的传代培养要比贴壁细胞简单得多，通常有两种方法。
1．直接给带传代的培养瓶中补充一定量的新鲜培养基，然后将进行分装。
2．先通过离心弃掉营养匮乏的旧培养基，然后再用适量的新鲜培养基重悬细胞沉淀，最后将其分装至培养瓶中即可。
悬浮细胞传代后的延滞期一般比贴壁细胞短。
所需材料
· 装有悬浮细胞的培养容器
· 完全生长培养基，预热至37℃
· 37℃培养箱，充有二氧化碳浓度为5%的湿化空气
悬浮细胞传代流程
所有与细胞接触的溶液和设备均应为无菌状态。
必须采用正确的无菌技术，并且在超净台内进行。
传代应在细胞处于对数期、未达到汇合状态时进行。
达到汇合状态时，悬浮培养的细胞会聚集成团块，转动培养瓶时培养基会变得浑浊。
传代前所建议的最大细胞密度随细胞系不同而有所差异；详细信息请参阅针对具体细胞的产品说明书或操作手册。
CHO细胞克隆株放大培养与筛选3
CHO细胞克隆株放大培养与筛选3方案五悬浮细胞株的驯化方法悬浮细胞株及其驯化方法1.将对数生长期的细胞消化处理后，接种含有无血清培养基和含10%血清的完全培养基的第一混合液的T25方瓶中，第一混合液中的血清含量为 4.5%-5.5%，于温度37±0.5℃、湿度100%及5%CO2的条件下，传代培养1-3次。
在该步骤中，优选地，接种密度为1-5×10个/m1，接种体积为5±0.5m1,每两天传代1次，使细胞密度达1.2×106个/ml以上。
2.该步骤可以使待驯化的贴壁型细胞适应血清含量较低的无血清培养环境，以利于后续的摇瓶驯化培养过程。
3.将步骤(1)获得的细胞转移至含有无血清培养基和含10%血清的完全培养基的第二混合液的摇瓶中悬浮驯化培养，第二混合液中的血清含量为 3.0%-3.6%，于温度37±0.5℃、湿度100%及5%C02的条件下，采用半量换液的方法传代1-3次。
4.将步骤(3)获得的细胞转移至含有无血清培养基和含10%血清的完全培养基的第三混合液的摇瓶中悬浮驯化培养，第三混合液中的血清含量为 1.8%-2.2%，于温度37±0.5℃、湿度100%及5%CO2的条件下，采用半量换液的方法传代1-3次。
5.将步骤(4)获得的细胞转移至含有无血清培养基和含10%血清的完全培养基的第四混合液的摇瓶中悬浮驯化培养，第四混合液中的血清含量为0.8-1.2%，于温度37±0.5℃、湿度100%及5%CO2的条件下，采用半量换液的方法传代1-3次。
6.将步骤(5)获得的细胞转移至无血清培养基的摇瓶中悬浮驯化培养，于温度37±0.5℃、湿度100%及5%CO2的条件下，采用半量换液的方法传代1-3次，即得悬浮细胞株。
7.在本实施方式中，优选地，在步骤(3)至(6)中，传代培养的细胞的接种密度为3-10×105个/ml,培养体积为20±1.0ml,转速为110-140rpm,每两天传代1次。
CHO-K1悬浮细胞的驯化
CHO-K1悬浮细胞的驯化1 5%FBS的培养基（14326）培养正常的CHO-K1。
2 当细胞汇合度达到80%-90%时，PBS洗涤，胰酶消化，2%FBS的培养基（14326）终止。
计数并离心。
3 2%FBS的培养基（14326）重悬细胞，以1×105个细胞/毫升的密度接种细胞。
4 当细胞的汇合度达到80%-90%，保留培养基中悬浮的细胞，观察悬浮细胞的活力，如果悬浮细胞无活力，丢弃。
如果有活力，保留并与胰酶消化的贴壁细胞混合。
5 消化按照步骤2进行，1%FBS的培养基（14326）终止。
计数并离心。
6 1%FBS的培养基（14326）重悬细胞，以2×105个细胞/毫升的密度接种细胞。
7 每天观察细胞，并用手掌轻拍细胞瓶让细胞悬浮，重放回培养箱直到细胞的汇合度达到80%-90%（约4-5天）8 一旦细胞汇合，保留悬浮的细胞并用手掌轻拍细胞瓶，避免气泡产生。
用吸管吹落瓶壁上的细胞，同时将细胞吹散。
细胞计数并离心。
9 无FBS的培养基（14326）重悬细胞，以8×105个细胞/毫升的密度接种细胞培养。
直到细胞的密度达到1.5-2×106个细胞/毫升（约3-4天）。
10 吹散细胞，计数并离心。
11无FBS的培养基（14326）重悬细胞，以8×105个细胞/毫升的密度接种细胞。
直到细胞的密度达到1.5-2×106个细胞/毫升。
注意细胞聚团的大小（每团细胞的个数）。
12 反复重复步骤9-1113 以6×105个细胞/毫升的密度接种细胞，60rpm转速培养。
14 培养方法建立之后，可以进行转瓶的扩大培养。
15 按照规程和密度，可以对悬浮细胞进行规模化的培养。
备注：如果细胞聚团严重，可让大团的细胞沉到细胞瓶底部。
吸取单个细胞进行培养。
确定总细胞数量和单个悬浮细胞的数量，以安排合理的接种密度。
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一 悬浮培养特点 （suspension culture)
非贴壁依赖型细胞的一种培养方式 细胞悬浮于培养基中生长或者维持 某些贴壁依赖型细胞经过适应和选择后也可 用此方法培养 使用振荡或者转动装置使细胞始终处于悬浮 状态
二 CHO细胞大规模悬浮培养工艺流 程
细胞株 摇瓶 WAVE或者种子罐
4 反应器生产阶段培养
取样 补碱 补料 补糖 收获
取样
取样瓶灭菌 将取样瓶连接至反应器取样口，开始管路灭菌 灭菌完成后等待管路冷却 开始取样 取样完成后用纯蒸汽冲洗取样管路 将所取细胞液测定细胞密度、活力、pH值等参数
补碱、补糖、补料
当反应器内pH值低于6.8左右时，需要进行补碱 当反应器内糖含量低于2g/L时，需要进行补糖 当反应器内营养物逐渐耗尽，需要根据工艺进行补料
细胞复苏注意事项
注意全程无菌操作 溶解冻存细胞时速度一定要快，避免缓慢升温细胞内形成冰 晶，对细胞造成损伤 计算合适的接种密度，一般CHO细胞培养的接种密度范围在 3.0-6.0*10E5个/ml 注意安全：取出冻存管时防止冻伤，同时注意有无液氮渗透 进入冻存管，防止液氮迅速气化导致冻存管爆炸造成人员危 险
收货细胞液
反应器培养
1 从液氮罐中取出冻存管，用镊子夹住迅速放入水浴锅中晃动， 直至完全溶解后将冻存管表面消毒转移至超净工作台内进行 操作 将细胞悬液转移至15ml离心管内，加入约10ml培养液，轻 轻吹打混匀 将细胞悬液经800-1000rpm离心5分钟，弃去上清液 向细胞沉淀加入10ml培养液，吹打均匀后将细胞悬液转移至 摇瓶内，加入适量培养液，开始培养
收获细胞液
在培养末期，细胞密度及活力都开始下降，此时应该进行细 胞液的收获，收获时保证细胞活力高于60% 预先准备好深层过滤膜包及管路的安装和保压 将反应器降温至18℃左右，连接深层过滤夹具进口，开始截 留细胞，收获细胞液 将细胞液转入收集罐内或者与纯化进行交接
谢谢
2 摇瓶细胞传代
摇瓶细胞培养2-3天后，细胞密度增高，营养物逐渐耗尽， 需要对细胞进行扩培 根据细胞密度计算扩培体积 当达到反应器扩培接种细胞数量要求后，停止摇瓶培养，接 种至反应器进行扩培
3 反应器扩培
在超净台内将摇瓶细胞合并至接种瓶内 用无菌焊接机将接种瓶管路与反应器管路无菌焊接，将细胞 液打入反应器进行扩培 当反应器内细胞密度达到要求后，接种至下一级反应器开始 生产阶段培养