T细胞培养标准操作规程

T细胞培养

T细胞分离激活扩增一、T细胞的分离1、抽20ml血到抗凝管内，或每1ml全血加入0.1ml（125-250）/ml 肝素液摇匀，汇总到50ml离心管，加入20mlPBS(与全血等量)稀释。

2、提前在15ml离心管内加入3ml淋巴分离液。

3、用刻度吸管沿倾斜管壁，把稀释液缓慢叠加与分层液面，注意保持界面清楚。

3ml全血+3mlPBS（已混匀）+3ml淋巴细胞分离液。

4、离心2000r，20min。

5、离心后取出离心管，可见管内液体有分层，抽取单个核细胞层至50ml离心管，加入5倍体积的PBS混匀。

6、2000r，10min离心。

用PBS重悬，计数T细胞。

1500r，10min，离心。

用含血清的1640培养基重悬细胞为1×107/ml。

二、CD3+T的筛选A、磁珠的洗涤。

a、将小管内的免疫磁珠摇匀悬浮（漩涡〉30s，或倾斜旋转5min）。

b、取出所需量的免疫磁珠到1.5ml试管内，单个核细胞总数为1×107/ml，每毫升中适宜磁珠数量为2.5×107个。

c、加入1ml含血清的1640并混悬好，漩涡〉30s，或保持滚动至少5min。

d、将试管放入磁体架内1min，吸管吸弃上清。

f、试管离开磁体，用与初始免疫磁珠体积等量体积的培养液重悬磁珠。

B、分离a、将混悬好的免疫磁珠试管放在磁性细胞分离架上，吸取上清，加入单个核细胞悬液，拿起试管，离开磁场，轻轻混悬几秒钟。

b、将免疫磁珠和样本放在4°C冰箱孵育20min，倾斜旋转。

c、将试管放在细胞分离架上分离2min，d、待磁珠结合细胞到达试管壁后用吸管轻轻吸取上清。

f、试管离开磁体，加入1ml含血清的1640，轻轻混合，洗涤，尽量使磁珠脱离细胞的丢失减少到最低。

g、将试管放在磁体上2min，用吸管吸弃上清。

h、重复f-g清洗2次。

i、洗完后，加含血清的1640到筛选的CD3阳性细胞中，混悬。

计数。

三、CD3阳性细胞的激活和扩增A、CD3/CD28beads的洗涤步骤同二AB、T细胞的激活a、6孔板5×105/ml，2ml培养液。

T细胞培养

主要有分离淋巴细胞、补液、装袋、分袋、收获等步骤。

细胞培养日程如下：第一天分离淋巴细胞第四天补液50ml第五天补液140ml第六天装袋第十天第一次分袋第十四天第一次收获第二次分袋第二十天第二次收获第三次分袋第二十六天第三次收获1 分离淋巴细胞以100ml外周血为例，如血量不同，可按此操作规程做相应调整。

①患者100ml外周血，室温1200rpm离心10分钟（刹车ON）。

将上层血浆转入离心管-40℃保存。

②用生理盐水1：1稀释血细胞沉淀(生理盐水：原全血体积=1：1)，用移液管吹打混匀后小心加到用50ml离心管分装的15ml Ficoll层上，使分层保持清晰，每管约35ml。

室温2000rpm离心20分钟（刹车OFF）。

③尽量吸尽两液面交接处的细胞层，均分到3个干净的50ml离心管中，用RPMI-1640液补充至50ml混匀，室温1600rpm离心10分钟（刹车ON）。

④倾去上清，将各离心管细胞沉淀振荡开后用10mlRPMI-1640悬浮合并为一管，混匀后取10μl与Turk工作液（1:10）混合，避光反应15min后再加10μl胎盘兰10倍稀释计数。

剩余液体再加RPMI-1640至50ml，室温1200rpm离心10分钟（刹车ON）。

⑤倾去上清，将细胞沉淀振荡后加RPMI-1640培养液50ml重悬，室温1000rpm离心10分钟（刹车ON）。

⑥弃上清，振开管底细胞沉淀后用细胞培养基50ml重悬细胞。

取一新的细胞培养瓶，用移液管吸干瓶中的缓冲液。

将细胞加到培养瓶中，同时加入800μgSM蛋白。

将内有细胞悬液的培养瓶放入CO2培养箱，拧松瓶盖，查看培养箱状态，确保正常。

温度：37±℃、湿度：大于90％、CO2浓度：7.5±0.5％⑦计算细胞密度及细胞数量细胞浓度(个/ml)=N/4×稀释总倍数×104细胞数量(个)=细胞浓度(个/ml)×细胞悬液总体积(ml)起始培养细胞数量应控制在2-3×107以上。

T细胞的分化培养、染色

T细胞的分化培养脾细胞的分离与计数：过滤PBS 10mL于离心管中，杀小鼠，取脾脏放入此PBS，冰浴。

配含10% FBS的1640培养液（5ml+45ml）。

平皿中研碎脾脏。

加PBS离心（1400 rpm,7 min)。

去上清，加2-3mL红细胞裂解液，吹打，静置5min。

加10 ml 1640（稀释掉裂解液），过滤（过筛），离心（1400 rpm，7 min）。

去上清，加之前配好的培养液3 mL打匀得悬液。

取少许入小管，于小管中取20uL，加20uL台盼蓝（染上死细胞）。

细胞计数，16大格板，计左上和右下对角线的各16小格。

算得结果。

此时细胞密度=一个角的16格细胞数×104/mL，由于台盼蓝稀释，再×2。

参照加样体积，取适量悬液用培养液稀释成1.5-2.5×106个/mL。

=台盼兰染色后150-250cells/左上16格+右下16格细胞因子的分装：原管分别含IL-2 :20 μg,IL-4 :10μg ,IL-12 :10μg ,TGF-β:1μg。

分别取1 ml所配培养液加入rmIL-2,rmIL-4,rmIL-12,rmTGF-β。

配1μg/ml的IL-2，100μL/管。

配1μg/ml的IL-4。

100μl/管。

配1μg/ml的IL-12。

50μl/管。

配1μg/ml 的TGF-β。

50μl/管。

分装1μg/ml的GM-CSF。

20uL/管。

细胞的激活培养：在总加样体积的细胞悬液中，加入下列细胞因子与抗体：稀释800倍的Anti-CD3（5ug/mL），稀释1000倍的Anti-CD28（1ug/mL），稀释500倍的IL-2（2 ng/mL）。

于48孔板上选取8孔，每2孔分别对应Th1,Th2,Treg及对照。

每孔500uL培养液，8孔共4 mL。

Th1：加入200倍稀释的IL-12，100倍稀释的Anti-IL-4（10ug/ml）。

Th2：加入50倍稀释的IL-4（20 ng/ml），100倍稀释的Anti-IFN-γ（10 ug/ml）。

CTL克隆的培养

CTL克隆的培养
1. 取浓缩的白细胞1ml，与PBS液1:1混匀后，小心加于2ml的细胞分离液液面上，2000转/分离心（半径15cm水平转子）15分钟，收集界面上的细胞，放入含有PBS 4-5毫升的试管中，充分混匀后，以1500-2000转/分离心10分钟。

吸去上清液，沉淀反复洗2次即得所需细胞。

2.将分离好的细胞计数，重悬在50ml的T-media中，浓度为4x106个/ml，用25 Greys的剂量辐照。

3.在融化后48小时或者前一次刺激2星期后，计数T细胞克隆，浓度为1x106个/ml，准备该浓度的细胞一共50ml ，悬浮在T-media中，与50ml辐照过的PBMC混合。

T细胞用40ng/ml的OKT-3单克隆抗体刺激。

4.在刺激后24小时，加入200 units/ml的IL-2。

然后，每3天，吸取一半的培养基，加入一半的新鲜培养基，加入200u/ml的IL-2。

培养物的浓度保持在1-2x106个/ml。

为了长期的保存，在刺激后12天，将细胞进行冻存。

T-media的准备：
50% ex vivo 15 media, 50% RPMI 1640 supplemented with 5% FCS, 5% filter sterilized human AB serum(sigma) and 55 um 2-mercaptoethanol.
刘荣枝。

T细胞体外培养

目前应用于临床的治疗的T细胞有如下几种：1、CD3AK细胞CD3AK细胞全称为抗CD3单克隆抗体激活的杀伤细胞，当淋巴细胞与抗CD3单克隆抗体共育2-3天，淋巴细胞可以明显增殖，此种激活为一次性完成，淋巴细胞一经激活即无需抗CD3单克隆抗体持续存在而发挥作用。

只会在加入低剂量的IL-2继续培养即可维持起活跃增殖，经2-3周培养后可获得大量的表现为CD3+、CD4以及CD8+的混合体，且随时间延长，CD3+和CD8+双阳性细胞的比例增加，而CD4+和CD8+双阳性的比例则下降。

因此，CD3AK细胞在表型上似乎接近于CTL。

具体培养方法:1、培养前1天以含CD3Ab 5 mg／L的磷酸盐缓冲液(PBS)20 ml平铺培养瓶，4℃过夜包被；2、培养第1天弃去PBS，以PBS冲洗2 次及1640培养液冲洗1次，加入1 000 U／ml的 IFN-γ，置于37℃体积分数为5％C02的饱和湿度培养箱中；3、24小时后加入1 000 U／ml的lL-2。

4、继续培养2、CIK细胞CIK细胞的全称为细胞因子活化的杀伤细胞，它是在多种细胞因子（IFN-γ，CD3单抗，CD28单抗，IL-2和IL-1）作用下，外周血单核细胞可以被定向诱导并大量增殖成为具有抗肿瘤活性的细胞群。

CIK细胞的表型主要为CD3+CD56+,是来源于PBMC中的T细胞（CD3+CD56-）。

具体培养方法：3、LAK细胞LAK细胞全称为淋巴因子激活的杀伤细胞，可在外周血单核细（PBMC）中加入IL-2体外培养4-6天，能诱导出一种非特异的杀伤细胞，称为LAK细胞。

LAK细胞的前体细胞是NK细胞和T细胞。

4、TIL细胞TIL细胞的全称为肿瘤浸润淋巴细胞。

它的制备方法与LAK细胞相似，所不同的是TIL的细胞来源是肿瘤组织中分离的浸润淋巴细胞，用少量的IL-2细胞刺激后，能大量扩增表型为CD4+及CD8+为主的T细胞。

外周血单核细胞（PBMC）分离实验血标本：EDTA（2%）盐抗凝血：采集后可4度保存不超过半天，尽量早处理。

原代t细胞培养方法

原代t细胞培养方法
原代T细胞一般在体外的培养时间不超过三周，用于功能实验的T细胞建议培养时间在14天以内。

以下是一个原代T细胞培养方法：1. 将含有1%青霉素-链霉素及5%血清的X-VIVO15培养基恢复至室温，重悬分离后的T细胞，加入anti-human CD3/CD28磁珠（与细胞数量1∶1），促进T细胞活化和增殖。

2. 加入300 U/mL IL-2使其分化和增殖为效应T细胞；或5 ng/mL IL-15促使T细胞分化和增殖为记忆T细胞。

不同免疫细胞涉及的细胞因子、激活信号大不相同，因此培养体系也不可同一而论，同一免疫细胞不同来源（如PBMC来源、脐带血来源、iPSCs或ESCs）的具体培养方案也存在差别。

bumpt细胞培养流程

bumpt细胞培养流程那咱就开始说说bumpt细胞培养的那些事儿吧。

一、细胞培养前的准备。

咱们得先把实验室打扫得干干净净的，这就像是给细胞宝宝们准备一个温馨舒适的家一样。

实验室要是乱糟糟的，细胞可不会开心地长大哦。

然后就是各种仪器设备啦，像培养箱得检查温度是不是合适，二氧化碳浓度对不对，这就好比是给细胞宝宝调节房间的温度和空气清新度呢。

还有超净工作台，一定要好好消毒，让细胞生活在一个无菌的环境里，这就像是给它们请了个超级保镖，把那些坏细菌都挡在外面。

说到培养基，这可是细胞的食物呀。

我们得根据bumpt细胞的口味来挑选合适的培养基。

就像我们人吃饭，不同的人喜欢不同的口味，细胞也是一样的。

把培养基按照说明书的要求配好，可不能马虎，就像做饭的时候调料不能乱放一样。

还有培养瓶或者培养皿，要选择质量好的。

要是这个“房子”质量不好，细胞住着也不安心呀。

把这些东西都准备好，放在超净工作台上，咱们就可以迎接细胞宝宝们的到来啦。

二、细胞的复苏。

从液氮罐里把冻存的bumpt细胞拿出来的时候，要快，就像抢宝贝一样。

因为细胞在液氮里虽然能保存很久，但是一旦拿出来，周围的温度变高了，细胞就像刚从冰窖里出来突然到了炎热的沙漠一样，会很不适应的。

把细胞快速放到提前准备好的温水里解冻，这时候心里还挺紧张的，就盼着细胞能快快恢复活力。

解冻之后呢，要把细胞慢慢地转移到离心管里，然后用离心机把细胞离心一下，把那些保护细胞的冷冻液去掉。

这个过程要轻轻的，可不能把细胞晃晕了。

就像对待小婴儿一样，要小心翼翼的。

离心完之后，再把细胞重新放到培养基里，就像把宝宝放到柔软的小床里，然后把它们放到培养箱里，让细胞开始适应新的环境，慢慢地生长起来。

三、细胞的传代。

当细胞在培养瓶里长得满满当当的时候，就像家里人太多太挤了一样，这时候就需要给它们换个大一点的“家”，这就是传代啦。

先把旧的培养基倒掉，这个时候感觉就像给细胞打扫卫生一样。

然后用一种叫胰蛋白酶的东西把细胞从培养瓶的壁上消化下来，不过这个时间要把握好，时间太长了，细胞会被消化过度，就像洗东西洗坏了一样，时间太短呢，细胞又下不来。

细胞培养标准操作程序（SOP）.docx

细胞培养标准操作程序（SOP）.docx细胞培养标准操作程序（SoP1.目的：为了保证培养细胞的正常生长，实验技术人员必须明确并正确执行细胞培养的基本操作步骤，特制订实验室细胞培养操作流程。

2 .适用范围：适用于来我院细胞室进行细胞培养工作的人员。

3 ?操作规程：3.1培养液、PBS、胰蛋白酶的配制3.1.1 100Oml培养液的配制1、准备用品：培养粉、1000ml烧杯、玻棒、量筒、电子分析天平、PH仪、2?3天内的新鲜三蒸水（或新鲜反渗水）、NaHCo3粉、1000ml无菌玻璃瓶（100ml× 10个玻璃瓶）、青霉素、链霉素、2?3个过滤器、注射器。

紫外线照台30min。

2、将培养粉用900ml新鲜三蒸水（或新鲜反渗水）溶解，并冲洗袋内残留粉末。

3、充分搅拌,按说明添加成分（如InVitrogen公司的RPMl-1640配制1000ml需加NaHCO3粉2.0g , InVitrogen公司的DMEM需加NaHCo3粉3.7g等），再充分搅拌。

无需加谷氨酰胺，因该培养基里已含有。

4、用1M （1mol∕L ）HCl调PH至7.0左右（细胞适宜在PH7.2?7.4生长，配制好后PH值会升高0.2?0.3 ,故配时调PH至7.0左右）。

5、用新鲜三蒸水（或新鲜反渗水）定容到1000ml。

6、配青霉素80万/瓶+ 4ml蒸馏水溶解配链霉素100万/瓶+ 4ml蒸馏水溶解取0.5ml青霉素和0.4ml链霉素加入到1000ml培养液中，使其终浓度均为100U/ml ,充分搅拌混匀。

7、在无菌操作台里用0.22Um的除菌滤膜过滤配制好的培养液，并分装到到100ml玻璃瓶中，玻璃瓶口用薄膜封口，盖上橡皮塞，放-20 C保存备用。

注意：（1 ）配制培养液及调节培养液PH值所使用的HCl和（或）NaOH均需新鲜三蒸水（或新鲜反渗水）配制。

一般于配制当天制备，以保证水的纯度和质量。

（2）准备的100ml× 10个玻璃瓶必须事先高压灭菌！烧杯、量筒、玻棒、盛新鲜三蒸水（或新鲜反渗水）的容器均不需高压灭菌，干净即可。

T细胞培养——精选推荐

T细胞分离激活扩增一、T细胞的分离1、抽20ml血到抗凝管内，或每1ml全血加入0.1ml（125-250）/ml 血到抗凝管内，或每肝素液摇匀，汇总到50ml离心管，加入20mlPBS(与全血等量)稀释。

2、提前在15ml离心管内加入3ml淋巴分离液。

淋巴分离液。

3、用刻度吸管沿倾斜管壁，把稀释液缓慢叠加与分层液面，注意保持界面清楚。

3ml全血+3mlPBS（已混匀）+3ml淋巴细胞分离液。

淋巴细胞分离液。

4、离心2000r，20min。

5、离心后取出离心管，可见管内液体有分层，抽取单个核细胞层混匀。

至50ml离心管，加入5倍体积的PBS混匀。

6、2000r，10min离心。

用PBS重悬，计数T细胞。

1500r，10min，离心。

用含血清的1640培养基重悬细胞为1×107/ml。

二、CD3+T的筛选A、磁珠的洗涤。

a、将小管内的免疫磁珠摇匀悬浮（漩涡〉30s，或倾斜旋转5min）。

b、取出所需量的免疫磁珠到1.5ml试管内，单个核细胞总数为1×107/ml，每毫升中适宜磁珠数量为2.5×107个。

个。

c、加入1ml含血清的1640并混悬好，漩涡〉30s，或保持滚动至少5min。

d、将试管放入磁体架内1min，吸管吸弃上清。

，吸管吸弃上清。

f、试管离开磁体，用与初始免疫磁珠体积等量体积的培养液重悬磁珠。

悬磁珠。

B、分离、分离a、将混悬好的免疫磁珠试管放在磁性细胞分离架上，将混悬好的免疫磁珠试管放在磁性细胞分离架上，吸取上清，吸取上清，加入单个核细胞悬液，拿起试管，离开磁场，轻轻混悬几秒钟。

b、将免疫磁珠和样本放在4°C冰箱孵育20min，倾斜旋转。

，倾斜旋转。

c、将试管放在细胞分离架上分离2min，d、待磁珠结合细胞到达试管壁后用吸管轻轻吸取上清。

f、试管离开磁体，加入1ml含血清的1640，轻轻混合，洗涤，尽量使磁珠脱离细胞的丢失减少到最低。

尽量使磁珠脱离细胞的丢失减少到最低。

t细胞培养方法

t细胞培养方法T细胞是一种重要的免疫细胞，对于机体的免疫防御起着至关重要的作用。

为了更好地研究T细胞的生物学功能以及其在免疫治疗中的应用，需要进行T细胞培养。

本文将介绍一种常用的T细胞培养方法。

一、实验前准备1.1 材料准备培养基：RPMI 1640培养基（含10% FBS、1% L-谷氨酰胺和1%青霉素/链霉素）抗生素：青霉素/链霉素（100 U/ml）FBS：fetal bovine serum，即胎牛血清L-谷氨酰胺：L-glutamine1.2 器材准备组织培养罐、离心管、移液器、显微镜等。

二、分离T淋巴细胞2.1 收集外周血单个核细胞将外周血采集入离心管中，并加入相应体积的PBS缓冲液，轻轻混匀后进行离心分层。

收集白色红色界面层中的外周血单个核细胞，转移入新的离心管中。

2.2 分离T淋巴细胞使用T淋巴细胞分离液对外周血单个核细胞进行分离。

将分离液加入外周血单个核细胞中，轻轻混匀后进行离心分层，收集上清液中的T 淋巴细胞，并用PBS缓冲液洗涤一次。

三、T细胞培养3.1 培养基制备将RPMI 1640培养基加热至37℃后，加入10% FBS、1% L-谷氨酰胺和1%青霉素/链霉素，混合均匀即可。

3.2 T细胞培养将收集到的T淋巴细胞转移至组织培养罐中，并加入适量的培养基。

将组织培养罐放置于37℃恒温箱内，进行T细胞培养。

3.3 T细胞扩增在T细胞培养过程中，定期观察并更换新的培养基。

当T细胞数量达到一定程度时，可以使用激活剂如PHA等进行扩增，以增加T细胞数量。

四、实验结果分析4.1 细胞形态观察在T细胞培养过程中，可以使用显微镜观察T细胞的形态变化，以判断其生长状态是否正常。

4.2 细胞数量统计使用细胞计数板对T细胞进行计数，以确定T细胞数量。

五、实验注意事项5.1 实验操作要求严谨，避免污染和交叉感染。

5.2 培养过程中要注意定期更换新的培养基，并避免过度扩增导致T细胞凋亡。

5.3 实验前要做好材料和器材的准备工作，并注意操作规范。

T细胞培养

293T细胞培养1.培养基:DMEM=丙酮酸钠++10%血清++青链霉素2.复苏：37度融化后;擦干冻存管酒精擦;细胞加入15ml离心管;加5ml培养基;500g离心5min;弃上清;加1ml培养基重悬后加入到培养瓶中;5~6ml左右;记得晃匀..3.传代:吸出旧培基;加5mlPBS洗一遍;用移液管加1ml胰酶;洗一遍吸出;37度放1min 左右计时;看到大片大片脱落了即加入新培基吹打;吹洗充分后;吸1ml加到事先加好10ml新培育基的新瓶里..293T细胞是用5型腺病毒75株系转化;含有Ad5E1区的人胚肾亚三倍体细胞系;是一种E1区缺陷互补细胞系..293T细胞是贴壁依赖型呈上皮样细胞;表现出典型的腺病毒转化细胞的表型;细胞允许Ad5和其他血清型腺病毒在其上增殖.. 哺乳细胞的大规模培养方式有三种：贴壁培养、微载体培养、无血清悬浮培养.. 这三种方式均可用于293T细胞的大规模培养..293T细胞在无Ca2+或含Ca2+培养基中可同样生长;也可生长在血清浓度降低的培养基中..单层培养细胞在5-10％FBS-DMEM中能生长很好..一般来讲;1:10传代后;一周可以长满..严禁过度生长;这点很重要..因为会导致细胞密度加大和堆积;影响病毒斑的形成和转染;传代时也不易打散..悬浮的293T细胞很容易大规模培养;但不容易长期保持稳定..293T细胞在传代120次以后;其表型可能改变;生长状况不再完全是单层的了;偶尔会形成局部的细胞成团聚集;应立即抛弃;重新引入新传代的细胞..293细胞培养特性：1、细胞明显适应酸性环境;pH值在6.9～7.1时;可顺利贴壁生长;换液293T时动作要轻..一般用高糖的DMEM培养基..2、传代：倒去废液;PBS洗一次轻;用0.02%EDTA与0.25%Trypsin消化;生长良好细胞;培养瓶中轻摇;使之流遍所有细胞表面;即将其吸除或弃去消化30s;然后吸去;再让剩下的EDTA/Trypsin作用30s;镜下观察细胞脱落;就可加DMEM 终止消化;反复吹打至细胞全成单个悬浮细胞即可..12小时-24小时90%以上细胞贴壁..293细胞传代时机为达80-90%汇合;传代比例为1：3..3、293细胞在低代时容易贴壁;生长良好;在传到几十代以后;易聚集成团;且贴壁不牢;用PBS冲洗时即可能脱落;即使消化后也不容易吹打成单细胞悬液;最好购入时先大量冻存..4、复苏293细胞的另一生长特性是贴壁所需时间长且贴壁不牢..细胞冷冻后复苏时;都有不同程度的肿胀;若以50ml培养瓶待细胞长满瓶底的70%～80%时消化冻存;复苏时将其全部接种至2个50ml瓶中时较为合适..刚复苏的293贴壁很慢;复苏接种后24小时内;应尽量减少观察细胞次数或不作观察;以免因晃动而影响细胞贴壁..复苏后48小时左右观察贴壁情况并进行首次更换培养基比较合适;如果用一次性塑料培养瓶可增加细胞贴壁牢度..换液前宜将培养基预热..5、转染：体外应用293细胞进行细胞转染时;如果是采用磷酸钙转染;一定要注意293细胞不要全部长满细胞培养盘;长满细胞时加入磷酸钙就会使293细胞大片的脱落;最好是当293生长到1/2或2/3时进行磷酸钙转染;可以避免细胞的大量脱落..其它的经验：1、用大瓶培养较小瓶要好;可能是更有利于293均匀的分布;利于营养的摄取2、培养液要新鲜;每次只配1000ml;分为2-4瓶;不用的培养液;冻存在-20度;3、要及时传代;最好是细胞基本铺满培养瓶底部;但是细胞之间还没有完全贴紧;总是多少有空隙的时候最好..4、如果细胞贴壁不好;可能是消化过久;或是培养瓶不够干净;当然要除外细胞污染..细胞的复苏：快速取出冻存的低代次293细胞;将其安放在底端1／2浸于37℃水浴中;轻轻晃动以加速融解..在超净工作台中;以70％乙醇对细胞培养皿表面消毒;将细胞转移至75cm的细胞培养瓶中;加入10mL低代次293细胞培养基置于细胞培养箱内培养..6～8h后待细胞贴壁更换培养基..1利用低代次293细胞贴壁的特性;在复苏和传代时不离心;而是加入10mL培养基中和细胞消化液;培养6～8h;细胞贴壁后更换新鲜培养基;从而避免了离心剪切力对细胞造成的机械损伤；2在消化细胞时;振荡培养瓶;避免直接反复剧烈吹打细胞..细胞形态观察、贴壁率和生长曲线表明;这种方法对细胞损伤小;能维持细胞较好的生长状态..NG等研究表明;低代次293细胞在培养过程中传代时融合度过高或过低;其整合的腺病毒El区基因易丢失；另外;不适当的传代比率也会导致细胞生物学特性发生改变..为此;笔者把细胞传代的融合度控制在90％左右;传代比率l：以腺病毒感染质粒pFG140感染传l0代以后的低代次293细胞;o可成功包装出腺病毒;表明这种传代方法可较好保持细胞的生物学特性..。

T细胞体外扩增培养

人T细胞分离与体外培养实验方案一．实验目的从人外周血中分离PBMCs，利用CD3和CD3/CD28免疫磁珠分离并扩增T 细胞，用于慢病毒载体的感染。

二．实验过程1．人外周血单个核细胞的分离（每mL外周血大约可获得1×106个单个核细胞）⑴采血，稀释（外周血：稀释液=1：1）；⑵在离心管中加入人淋巴细胞分离液，沿倾斜的管壁缓缓加入稀释的外周血（Ficoll：稀释血=1：2）；⑶20℃，440g，离心20-30min；⑷离心后轻轻吸取中间白膜层，移入另一试管中；⑸加入足量的稀释液充分洗涤，400g，离心5min，弃上清；⑹细胞沉淀加1640培养液重悬，即可用于T细胞的磁珠分选。

2．CD3+T细胞分选⑴适量的MACS缓冲液洗涤PBMCs（107/mL），300g，离心10min，去上清；⑵MACS缓冲液重悬PBMCs（80μL/107PBMCs），加入CD3免疫磁珠（20μL/107PBMCs），混匀，4℃孵育15min；⑶MACS缓冲液（1-2mL/107 cells）洗涤细胞1次，300g，离心10min，弃去上清；⑷500μL MACS缓冲液重悬细胞；⑸将MS分离柱放置于磁力架上，加入500μL MACS buffer预清洗分离柱；⑹将⑷步得到的细胞悬液加入预先洗涤过的MS分离柱，先流出的细胞为未标记的CD3-T细胞。

MACS缓冲液洗涤分离柱3次；⑺将分离柱从磁力架上取下，放入合适的管子内，加入1mL MACS缓冲液至分离柱内，洗脱液即为CD3+T细胞，细胞计数后，用含10%胎牛血清的RPMI1640培养基重悬。

3．CD3+T细胞的激活和扩增⑴CD3/CD28免疫磁珠预先洗涤①涡旋30s以上重悬CD3/CD28免疫磁珠；②取需要量的CD3/CD28免疫磁珠加至一个新的管中；③加入与磁珠体积相等的缓冲液（至少1mL），混匀（涡旋5min或者颠倒混匀5min）；④将管子置于磁力架上1min，弃去上清液；⑤将管子从磁力架上取下，加入与第②步取出的磁珠体积相等的培养液重悬CD3/CD28免疫磁珠。

Car-T细胞培养标准操作流程

Car-T 细胞培养标准操作流程1目的：保证Car-T 细胞制备和培养符合要求。

2范围：适用于符合实验的要求患者外周血制备和培养3责任人：实验员人、临床相关人员。

4内容4.1耗材：50ml离心管，10ml移液管，5ml移液管，75cm2t养瓶，150 cm2t养瓶，EP t, 1.8ml冻存管4.2试剂：X-VIVO 15TM PBS缓冲液，75淞用酒精，人淋巴细胞分离液，CD3/CD28 免疫磁珠，IL-2 ，注射用人血白蛋白。

4.3环境：4.3.1外周血分离，培养应在恒温恒湿的万级层流室内进行，开放操作必须在百级生物安全柜内进行。

4.3.2实验人员应提前对净化室和生物安全柜进行杀菌消毒，紫外线照射时间不少于30min,消毒消毒后，净化空调开启时间不少于30min,生物安全柜运行稳定后方可操作。

4.4操作：4.4.1采集接收外周血4.4.1.1患者符合治疗方案，各项检测符合要求，采集患者外周血60-80ml。

4.4.1.2接收外周血并填写《外周血采集交接记录》，核对外周血患者相关信息，及相应检测报告，报告由医院提供，至少包括：HBsAg，HCVA，bHIVAb，Anti-TP ，ALT。

4.4.2操作前准备4.4.2.1净化室，生物安全柜消毒完毕后，开启净化空调运行30mi n,生物安全柜运行稳定。

4.4.2.2从试剂间冰箱中取出细胞培养基，恢复室温。

4.4.2.3生物安全柜表面75%酒精消毒，外周血袋表面酒精消毒转入安全柜内。

4.4.3分离单个核细胞（PBMC）：4.4.3.1使用灭菌消毒的剪刀剪断血袋塑料管或者使用一次性注射器，把血袋内外周血转入50ml离心管中。

443.2用PBS缓冲液按1:1稀释外周血，混匀。

443.3将稀释好的血样缓慢加入室温的15ml人淋巴细胞分离液的离心管中。

方法如下：用10ml移液管吸取血样，伸至分离液液面上方0.5cm处，血样自然滑落铺至分离液面上，然后轻轻加入血样，注意不要冲破液面。

T细胞体外扩增培养

人T细胞分离与体外培养实验方案一．实验目的从人外周血中分离PBMCs，利用CD3和CD3/CD28免疫磁珠分离并扩增T 细胞，用于慢病毒载体的感染。

二．实验过程1．人外周血单个核细胞的分离（每mL外周血大约可获得1×106个单个核细胞）⑴采血，稀释（外周血：稀释液=1：1）；⑵在离心管中加入人淋巴细胞分离液，沿倾斜的管壁缓缓加入稀释的外周血（Ficoll：稀释血=1：2）；⑶20℃，440g，离心20-30min；⑷离心后轻轻吸取中间白膜层，移入另一试管中；⑸加入足量的稀释液充分洗涤，400g，离心5min，弃上清；⑹细胞沉淀加1640培养液重悬，即可用于T细胞的磁珠分选。

2．CD3+T细胞分选⑴适量的MACS缓冲液洗涤PBMCs（107/mL），300g，离心10min，去上清；⑵MACS缓冲液重悬PBMCs（80μL/107PBMCs），加入CD3免疫磁珠（20μL/107PBMCs），混匀，4℃孵育15min；⑶MACS缓冲液（1-2mL/107 cells）洗涤细胞1次，300g，离心10min，弃去上清；⑷500μL MACS缓冲液重悬细胞；⑸将MS分离柱放置于磁力架上，加入500μL MACS buffer预清洗分离柱；⑹将⑷步得到的细胞悬液加入预先洗涤过的MS分离柱，先流出的细胞为未标记的CD3-T细胞。

MACS缓冲液洗涤分离柱3次；⑺将分离柱从磁力架上取下，放入合适的管子内，加入1mL MACS缓冲液至分离柱内，洗脱液即为CD3+T细胞，细胞计数后，用含10%胎牛血清的RPMI1640培养基重悬。

3．CD3+T细胞的激活和扩增⑴CD3/CD28免疫磁珠预先洗涤①涡旋30s以上重悬CD3/CD28免疫磁珠；②取需要量的CD3/CD28免疫磁珠加至一个新的管中；③加入与磁珠体积相等的缓冲液（至少1mL），混匀（涡旋5min或者颠倒混匀5min）；④将管子置于磁力架上1min，弃去上清液；⑤将管子从磁力架上取下，加入与第②步取出的磁珠体积相等的培养液重悬CD3/CD28免疫磁珠。

T细胞培养标准操作规程

百利药业生物药研发部标准操作规程题目：293T细胞传代培养操作规程编号：SOP-M-e-003-制定者：（签名）日期：年月日批准者：（签名）日期：年月日生效日期：年月日题目：293T细胞培养操作规程1目的293T细胞是常用于包装和扩增病毒载体的工具细胞，因此做好293T细胞的培养，为保证相关实验的正常进行提供必要条件。

2适用范围本部门293T细胞培养3操作方法将移液器和移液枪、15ml离心管、离心管架、75cm2新的细胞培养瓶放于生物安全柜中，按照生物安全柜的标准操作规程，将生物安全柜的紫外开启半小时。

将含10%胎牛血清和100U/ml双抗的DMEM及PBS放于37℃水浴锅中预热。

3.2.1将已长到80%-90%的293T细胞培养瓶从37℃，5%的CO培养箱中取出，先用75%2的酒精喷洒于瓶表面，将细胞培养瓶旋转放于生物安全柜中，用无菌的移液管吸净其中的培养基，加5ml的预热的PBS洗涤一次，吸净PBS。

3.2.2将含%tyption用PBS稀释两陪到五倍，向该75cm2的细胞瓶中加入3ml稀释好的%tyption，让其充分平铺于细胞表面。

盖好瓶盖，将细胞瓶放在显微镜下观察，直到细胞变圆，加含10%胎牛血清的DMEM终止反应，用移液管轻轻将瓶上的细胞吹下，将细胞液移到15ml无菌的离心管中，1000rpm离心3分钟。

3.2.3将离心上清吸弃掉，用手指轻轻拍打离心管底将底部细胞分散开，再加3mlDMEM培养基将分散的细胞重悬稀释开，取一定量的细胞液进行n倍稀释后计数，按照细胞计数标准操作规程进行。

3.2.4计数好之后细胞传代密度按照2~5×104个细胞/cm2进行传代培养，每个75cm2的培养箱中培养。

培养瓶中加10mlDMEM培养基，放于37℃，5%的CO23.2.524小时后观察细胞状态，待细胞长到80%-90%时进行下一次传代培养。

T细胞体外扩增培养

人T细胞分离与体外培养实验方案一．实验目的从人外周血中分离PBMCs，利用CD3和CD3/CD28免疫磁珠分离并扩增T细胞，用于慢病毒载体的感染。

二．实验过程1．人外周血单个核细胞的分离（每mL外周血大约可获得1×106个单个核细胞）⑴采血，稀释（外周血：稀释液=1：1）；⑵在离心管中加入人淋巴细胞分离液，沿倾斜的管壁缓缓加入稀释的外周血（Ficoll：稀释血=1：2）；⑶20℃，440g，离心20-30min；⑷离心后轻轻吸取中间白膜层，移入另一试管中；⑸加入足量的稀释液充分洗涤，400g，离心5min，弃上清；⑹细胞沉淀加1640培养液重悬，即可用于T细胞的磁珠分选。

2．CD3+T细胞分选⑴适量的MACS缓冲液洗涤PBMCs（107/mL），300g，离心10min，去上清；⑵MACS缓冲液重悬PBMCs（80μL/107PBMCs），加入CD3免疫磁珠（20μL/107PBMCs），混匀，4℃孵育15min；⑶MACS缓冲液（1-2mL/107 cells）洗涤细胞1次，300g，离心10min，弃去上清；⑷500μL MACS缓冲液重悬细胞；⑸将MS分离柱放置于磁力架上，加入500μL MACS buffer预清洗分离柱；⑹将⑷步得到的细胞悬液加入预先洗涤过的MS分离柱，先流出的细胞为未标记的CD3-T细胞。

MACS缓冲液洗涤分离柱3次；⑺将分离柱从磁力架上取下，放入合适的管子内，加入1mL MACS缓冲液至分离柱内，洗脱液即为CD3+T细胞，细胞计数后，用含10%胎牛血清的RPMI1640培养基重悬。

3．CD3+T细胞的激活和扩增⑴CD3/CD28免疫磁珠预先洗涤①涡旋30s以上重悬CD3/CD28免疫磁珠；②取需要量的CD3/CD28免疫磁珠加至一个新的管中；③加入与磁珠体积相等的缓冲液（至少1mL），混匀（涡旋5min或者颠倒混匀5min）；④将管子置于磁力架上1min，弃去上清液；⑤将管子从磁力架上取下，加入与第②步取出的磁珠体积相等的培养液重悬CD3/CD28免疫磁珠。