细胞线粒体毒性的检测(Molecular Devices)
线粒体膜电位(MMP)检测的具体步骤及方法
线粒体膜电位(MMP)检测的具体步骤及方
法
线粒体膜电位（MMP）是细胞凋亡过程中最早发生的事
件之一，因此MMP的检测对于研究细胞凋亡具有重要意义。
JC-1是一种碳氰化合物类阳离子荧光染料，可以作为检测线
粒体跨膜电位的指示剂。
当MMP水平较高时，JC-1形成聚合物，发出红色的荧光；而当MMP水平低时，JC-1主要以单体形式存在，呈绿色荧光。
因此，根据JC-1的荧光特征可以检
测线粒体膜电位的变化。
实验流程包括以下步骤：
1.细胞培养。
2.用适当的方法诱导细胞凋亡，并设立阴性和阳性对照组，收集细胞。
3.用PBS洗涤细胞三次，收集不多于1×10的细胞。
4.取100μL 10×___加900μL灭菌去离子水稀释成1×n Buffer，混匀并预热至37℃。
5.吸取500μL 1×n Buffer，加入1μL JC-1，涡旋混匀配成JC-1工作液。
6.取500μL JC-1工作液将细胞均匀悬浮，37℃，5% CO2的培养箱中孵育15~20min。
7.室温离心（2000rpm。
5min）收集细胞，用1×___洗两次。
8.吸取500μL 10×___重新悬浮细胞。
9.使用流式细胞仪检测并分析。
通过以上步骤，可以得到线粒体膜电位的变化情况，从而研究细胞凋亡的机制。
检测细胞活性或毒性(Molecular Devices)
在SpectraMax MiniMax 300细胞成像系统上应用 EarlyTox细胞完整性试剂盒检测细胞活性或毒性图1. EarlyTox细胞完整性试剂盒检测原理Live Red DyeDead Green DyeLive Cell Dead CellEarlyTox ™细胞完整性试剂盒由一系列易于识别活细胞和死细胞的优化试剂组成。
可用于检测不同处理对细胞活性的影响，也可评估不同机制产生的细胞毒性，包括凋亡和坏死。
该试剂盒设计工作于多种细胞类型，贴壁和悬浮均可。
简单的操作流程和优异的试剂表现使其能应用到高通量扫描上。
试剂盒中使用了两种结合DNA的荧光染料，一种为细胞膜可穿透的活细胞红色染料，一种为细胞膜不可穿透的死细胞绿色染料。
红色染料可进入所有细胞的细胞核，细胞膜是否完整对其无影响，并可被激发产生亮红色荧光信号。
绿色染料只能进入死细胞并产生亮绿色荧光，此类细胞的细胞膜已不完整(图1)。
因此，活细胞和死细胞能通过成像系统拍摄到的荧光信号被轻易区分和识别到。
SpectraMax ™ MiniMax ™ 300细胞成像系统和SoftMax ® Pro软件为EarlyTox细胞完整性试剂盒的应用提供了成像和数据分析的整套硬件软件工具。
使用仪器的双通道荧光成像功能以及软件的单细胞分析功能，可在5分钟内分析一块96孔板细胞活性。
方法HeLa细胞以5000个/孔的密度接种到黑壁底透384孔板，培养24小时使其贴壁并生长，然后孔中加入具细胞毒性的药物。
药物处理24小时候，按照试剂盒说明书加入染料标记后检测细胞活性。
操作方法应尽量均一，以减少移除培养基、冲洗步骤造成的细胞损失和结果不准确性。
可选的遮蔽试剂能用于减少培养基或待测药物产生的背景值。
特点• • • 信号强，缩短曝光时间，成像速度更快适用于各种细胞类型，应用广泛拍照和分析一体完成，流程简化通过试剂盒中两种不同特性的染料区分出活细胞和死细胞。
简析线粒体病的检测与诊断方法
简析线粒体病的检测与诊断方法随着现代医学技术的不断发展，人类能够更加准确地检测和诊断各种疾病。
其中，线粒体病作为一种常见的遗传性疾病，其检测和诊断方法也得到了越来越多的重视。
本文将对线粒体病的检测和诊断方法进行简析，希望能够对广大读者有所帮助。
一、背景知识要了解线粒体病的检测和诊断方法，就需要先了解一些背景知识。
线粒体是细胞内的一种特殊结构，其主要功能是生成能量。
线粒体病是一种由于线粒体DNA发生突变而引起的疾病，在临床表现上常常表现为代谢障碍、神经系统疾病和肌肉无力等症状。
目前已知的线粒体病种类很多，可以按临床表现、病因、病理和遗传方式等分类。
其中，常见的线粒体遗传性疾病包括MELAS 综合征、MERRF综合征、Leber眼肌萎缩症等。
二、检测方法1.线粒体DNA测序线粒体DNA测序是一种比较常见的检测方法，其主要目的是检测线粒体DNA序列中是否存在突变。
这种方法可以通过PCR 扩增线粒体DNA或通过高通量测序等技术直接对线粒体DNA进行测序，从而确定是否存在突变。
但是，由于线粒体DNA自身有多份拷贝，有些突变只存在于一部分线粒体DNA中，因此检测的准确性受到一定限制。
2.嵌合PCR嵌合PCR是一种特别针对线粒体DNA检测设计的技术，主要用于检测那些只存在于某个细胞或某个组织中的线粒体DNA序列突变。
通过将突变的线粒体DNA片段与正常线粒体DNA片段嵌合，形成新的DNA序列，再通过PCR扩增来检测荧光浓度的变化，就可以较精确地检测出线粒体DNA的突变情况。
3.蛋白质表达检测蛋白质表达检测主要是针对线粒体病的临床表现进行研究的一种方法。
通过检测诸如线粒体膜分子、酶类和结构蛋白等多种蛋白质的表达情况，可以探究线粒体病的产生和进展机制，为疾病的诊断和治疗提供依据。
三、诊断方法1.临床表现综合分析线粒体病的临床表现十分复杂，且症状各异，因此仅通过一种检测方法很难做出准确的诊断。
为此，需要结合临床表现综合分析，如体征、影像学、生化检查等，从多个方面进行评估，以确定疾病的具体类型和进展情况。
Molecular Devices 高通量共聚焦成像技术检测3D肿瘤球,助力癌症药物筛选
上海 电话: 86-21-3372 1088 传真: 86-21-3372 1066
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• 定位每个微孔中的球体使其在单视野 中成像
• 优化染色处理过程在保证染料渗透性 的同时，避免干扰球体的定位
• 获得整个3D结构的清晰图像，尽量减 少成像平面外背景信号和散焦的影响
• 可以迅速的分析图像得到有意义的结 果并同时绘制出图表
肿瘤球的形成及处理
我们用以下方法构建HCT116， DU145，HepG2肿瘤细胞系的微球体。 首先，在37度和5%CO2条件下在培养瓶 中培养肿瘤细胞，以每孔1000-1500细 胞的浓度将培养的细胞种于U型孔底的96 或384孔的黑色细胞板中(corning 4520 和 3830)，培养基为加入FBS的完全培养 基。每孔中的单球体在24小时之内就会 成形。在37度和5% CO2培养条件下，细 胞球会继续生长，2-4天后即可用于实 验。如果细胞球培养时间过长，其过大的 体积会影响染料的穿透性以及球体中心的 成像效果。说明书中注释了如何用细胞球 检验依托泊苷，紫杉醇和丝裂霉素C的抗 肿瘤效果。首先，将待测化合物以10x浓 度加入到含有球体的孔板中孵育1-4天， 孵育时间的长短取决于实验者的想要研究 的机制。短期培养适合于凋亡机制研究， 而长期培养适合于多因素细胞毒性研究。 如果药物处理时间超过两天，需要每两天 以1x浓度更新药物。
细胞毒性检测方法总结
细胞毒性检测方法总结！细胞毒性(cytotoxic）是由细胞或者化学物质引起的单纯的细胞杀伤事件，不依赖于凋亡或坏死的细胞死亡机理。
有时需要进行特定物质细胞毒性的检测，比如药物筛选。
细胞毒性检测主要是根据细胞膜通透性发生改变来进行的检测，常用以下几种方法：MTT、XTT法：利用线粒体内部酶的活性，可以将特定的四唑盐类进行转化,然后通过酶标仪进行检测一。
LDH的方法：通过检测细胞培养上清中LDH的酶活性，来检测细胞毒性其它酶方法：如检测上清中碱性磷酸酶、酸性磷酸酶的活性等细胞增殖能力分析试剂原理:正常细胞代谢旺盛，其线粒体内的琥珀酸脱氢酶，可将四唑盐类物质（如 MTT、XTT、WST-1等）还原为紫色的结晶状的物质，沉积在细胞周围，然后通过酶标仪读取OD值，从而检测到细胞增值状态优点：1）快速:96孔培养板形式，可进行高通量检测。
2）灵活：可直接通过显微镜观察，也可通过酶标仪进行定量检测。
二.荧光素发光法细胞生存能力检测原理：腺苷酸激酶（AK）存在于所有真核和原核细胞的胞浆中,AK具有激活ADP生成ATP。
当细胞受损后,细胞膜发生破损，AK会释放到培养上清中。
该试剂盒利用荧光素酶和荧光素在ATP作用下可以发光，通过化学发光仪可以定量进行检测。
特点： 1）简单、快速。
2）板式检测，可进行高通量。
三。
LDH法细胞毒性检测原理：LDH(乳酸脱氢酶)是一种稳定的蛋白质，存在于正常细胞的胞质中，一旦细胞膜受损，LDH 即被释放到细胞外； LDH催化乳酸形成丙酮酸盐，和INT（四唑盐类）反应形成紫色的结晶物质，可通过500nm酶标仪进行检测。
通过检测细胞培养上清中LDH的活性,可判断细胞受损的程度特点：1)方法简单，安全，不使用放射性物质2）可进行高通量检测。
细胞活力和细胞毒性的评价(Molecular Devices)
优势：利用SpectraMax i3x多功能微孔板读板机所具有的超灵敏化学发光检测功能进行细胞活力和细胞毒性的评价简介方法 准备试剂• 仪器具有超高灵敏度化学发光检测功能，最低至10个细胞/每孔；• 微孔板读板高度自动优化设置，可提高检测信号强度• 软件预置模板可以更快分析出检测结果SpectraMax i3x是Molecular Devices公司最新推出的一款多功能微孔板读板机，可利用仪器所具有的化学发光检测功能，进行细胞活力和细胞毒性相应检测。
仪器可灵敏、快速检测出培养基中活细胞的数目和经相应处理后细胞毒性情况。
Promega公司推出的CellTiter-Glo试剂是利用了萤火虫荧光素酶反应体系中需要ATP参与才能使其发光的特点，化学发光信号强弱取决于培养基中ATP含量的高低，也就是依赖于其中活细胞数目的多少。
来自于BioVision公司基于生物化学发光原理的细胞毒性检测试剂盒，目的是检测腺苷酸激酶(AK)的含量，AK为一种存在于所有细胞中的常见蛋白，当破坏了细胞膜完整性后其会释放至培养基中，AK可转化ADP至ATP，所以可以利用类似方式进行化学发光检测。
材料• CellTiter-Glo Luminescent Cell ViabilityAssay (Promega P/N G7570)• Bioluminescence Cytotoxicity AssayKit (BioVision P/N K312-500)• HeLa 细胞(ATCC P/N CCL-2)• 黑色底透 96孔细胞培养板 (Corning P/N3904)• 白色96孔细胞培养板(Corning P/N 3917)• SpectraMax i3x多功能微孔板读板机使用前预先将CellTiter-Glo缓冲液和底物解冻并且平衡其至室温，将CellTiter-Glo 缓冲液加至含有CellTiter-Glo底物的棕色小瓶中，按照试剂盒说明书提示，将试剂轻轻反复颠倒进行混匀。
化学发光法检测细胞活性(Molecular Devices)
介绍在SpectraMax ® L和SpectraMax ®M5酶标仪上应用Promega CellTiter-Glo化学发光法检测细胞活性MD公司的SpectraMax ® L及SpectraMax ® M 5型号酶标仪结合P r o m e g a 公司的CellTiter-Glo化学发光细胞活性检测试剂盒能进行快速灵敏的活细胞数量测定。
CellTiter-Glo检测法使用了萤光素酶，需要ATP使其反应发光。
发光信号强度由ATP量决定，而ATP的多少取决于活细胞数目。
SpectraMax ® L及M5酶标仪均能提供96孔和384孔化学发光检测功能。
方法准备CellTiter-Glo试剂使用前将CellTiter-Glo缓冲液和底物在室温中平置解冻。
然后将缓冲液倒入装有底物的棕色瓶中，并按照CellTiter-Glo操作手册中指示，温和颠倒瓶子以混匀。
细胞计数及产生发光信号用含10%胎牛血清和L-谷氨酰胺的Ham ’s F12培养基培养CHO-K1细胞。
胰酶消化后使细胞悬浮在培养基中，并进行细胞计数。
用96孔板检测时，每孔中加入100ul细作者 Cathy Olsen, Ph.D., MDS Analytical Technologies,1311 Orleans Drive, Sunnyvale, CA 94089.材料：1.CellTiter-Glo化学发光细胞活性检测试剂盒(Promega公司，货号G7570)，包括CellTiter-Glo缓冲液和CellTiter-Glo底物(冻干粉)CHO-K1细胞(ATCC，货号CCL-61)白色96和384孔板(Greiner Lumitrac 200，货号655075和781075)SpectraMax ® L化学发光微孔板检测仪或SpectraMax ® M5多功能微孔板读板机胞悬液，细胞浓度从50000个/孔稀释到24个/孔。
细胞迁移能力相关实验检测方法介绍(Molecular Devices)
细胞迁移能力相关实验检测方法介绍info.China@1细胞的迁移运动不仅是细胞进行很多重要生理活动的基础，同时也是炎症反应和肿瘤发生等病理过程中的重要步骤和关键环节。
细胞迁移 (cell migration) 也称为细胞爬行、细胞移动或细胞运动，是指细胞在接收到迁移信号或感受到某些物质的梯度后而产生的移动。
细胞迁移为细胞头部伪足的延伸、新的黏附建立、细胞体尾部收缩在时空上的交替过程。
细胞迁移是正常细胞的基本功能之一，是机体正常生长发育的生理过程，也是活细胞普遍存在的一种运动形式。
胚胎发育、血管生成、伤口愈合、免疫反应、炎症反应、动脉粥样硬化、癌症转移等过程中都涉及细胞迁移。
目前人们对恶性肿瘤的研究是多方面的，从癌症的产生到转移，血管供给以及分裂增殖都一直是医学和生物学研究的热点。
恶性肿瘤与良性肿瘤的最大区别就在于是否可以对周遭组织进行浸润，结果是形成边界不分明的癌组织，或是进入血管转移到远端（见远端转移）。
根据观察可将癌症浸润分为四步。
首先癌细胞表面的粘附分子会减少，与周围的细胞彼此分离，被“解除束缚”。
同时癌细胞与基底膜的粘附却会增加，这是癌细胞通过增加自身基底面层粘连蛋白（laminin）受体实现的。
然后癌细胞会释放蛋白酶，用以降解细胞外基质成分，如Ⅳ型胶原酶，使基底膜受损，产生缝隙。
最后是癌细胞阿米巴运动样的迁移，钻过基底膜的缝隙，到达底下的间质组织。
癌细胞此后会继续用蛋白酶为自己在间质组织开路，直到血管，然后它会以同样方式进入血管，经血到转移后，又以同样方式出管。
因此，癌症的形成与肿瘤细胞的迁移能力密不可分，这也成为了一个诊断和治疗癌症的一个靶点。
研究细胞迁移的方法有很多，比如划痕法、实时细胞追踪、Transwell和细胞芯片等，本文将一一介绍现今比较主流的与细胞迁移相关的实验方法。
简介：细胞划痕（修复）法是简捷测定细胞迁移与修复能力的方法，类似体外伤口愈合模型，在体外培养的单层细胞上，用微量枪头或其它硬物在细胞生长的中央区域划线，去除中央部分的细胞，然后继续培养细胞至实验设定的时间，取出细胞培养板，观察周边细胞是否生长（修复）至中央划痕区，以此判断细胞的生长迁移能力，实验通常需设定正常对照组和实验组，实验组是加了某种处理因素或药物、外源性基因等的组别，通过不同分组之间的细胞对于划痕区的修复能力，可以判断各族细胞的迁移与修复能力。
化学发光法检测细胞活性(Molecular Devices)
介绍在SpectraMax ® L和SpectraMax ®M5酶标仪上应用Promega CellTiter-Glo化学发光法检测细胞活性MD公司的SpectraMax ® L及SpectraMax ® M 5型号酶标仪结合P r o m e g a 公司的CellTiter-Glo化学发光细胞活性检测试剂盒能进行快速灵敏的活细胞数量测定。
CellTiter-Glo检测法使用了萤光素酶，需要ATP使其反应发光。
发光信号强度由ATP量决定，而ATP的多少取决于活细胞数目。
SpectraMax ® L及M5酶标仪均能提供96孔和384孔化学发光检测功能。
方法准备CellTiter-Glo试剂使用前将CellTiter-Glo缓冲液和底物在室温中平置解冻。
然后将缓冲液倒入装有底物的棕色瓶中，并按照CellTiter-Glo操作手册中指示，温和颠倒瓶子以混匀。
细胞计数及产生发光信号用含10%胎牛血清和L-谷氨酰胺的Ham ’s F12培养基培养CHO-K1细胞。
胰酶消化后使细胞悬浮在培养基中，并进行细胞计数。
用96孔板检测时，每孔中加入100ul细作者 Cathy Olsen, Ph.D., MDS Analytical Technologies,1311 Orleans Drive, Sunnyvale, CA 94089.材料：1.CellTiter-Glo化学发光细胞活性检测试剂盒(Promega公司，货号G7570)，包括CellTiter-Glo缓冲液和CellTiter-Glo底物(冻干粉)CHO-K1细胞(ATCC，货号CCL-61)白色96和384孔板(Greiner Lumitrac 200，货号655075和781075)SpectraMax ® L化学发光微孔板检测仪或SpectraMax ® M5多功能微孔板读板机胞悬液，细胞浓度从50000个/孔稀释到24个/孔。
eutda细胞毒法
eutda细胞毒法
EUTDA细胞毒法是一种用于评估化合物对细胞的毒性的试验方法。
EUTDA（Ethidium Uptake and Trypan Blue Dye Exclusion Assay）细胞毒法主要通过观察染色剂乙啶和尝试蓝的摄取情况来评估化合物对细胞的毒性程度。
在EUTDA细胞毒法中，乙啶和尝试蓝被用作细胞死亡指标。
乙啶可以穿过受损细胞膜进入细胞核，而尝试蓝则不能进入健康的细胞。
通过将这两种染色剂与待测化合物一起处理细胞，可以根据细胞内是否出现染色剂摄取来判断化合物对细胞的毒性程度。
具体操作步骤如下：
1. 培养并收集待测细胞。
2. 将待测细胞分配到不同的孔板孔中。
3. 添加含有待测化合物的培养基到孔中，使细胞与化合物接触。
4. 在一定的时间后，用含有乙啶和尝试蓝的缓冲液处理细胞。
5. 观察细胞的染色情况，通过显微镜检查细胞是否发生了染色剂的摄取。
6. 根据染色情况可以初步评估待测化合物对细胞的毒性。
EUTDA细胞毒法是一种简单快速的细胞毒性评估方法，可用于初步筛选化合物的毒性。
然而，它只能提供关于细胞存活情况的初步信息，对于更详细的毒性评估仍需要其他更精确和全面的方法来支持。
在进行细胞毒性评估时，建议结合其他细胞毒性试验方法，以获得更准确的结果。
Molecular Devices EMax Plus和VMax微孔板读板机的比较说明书
随着光吸收法可以满足越来越多的应用检测领域，终点法读板机在实验室中的占有率也越来越高。
例如ELISAs方法进行细胞因子定量和Bradford法进行蛋白定量。
本篇应用就是要着重比较使用Bradford法进行蛋白定量检测时，Molecular Devices公司的产品EMax ® Plus微孔板读板机和VMax微孔板读板机的性能。
此外，我们比较了Emax Plus 微孔板读板机和Emax终点法微孔板读板机，利用双抗夹心ELISA方法来定量小鼠/大鼠IL-22细胞因子时表现上的差异。
Bradford蛋白定量检测法是一种基于酸性染料与蛋白结合的光吸收实验1。
当考马斯亮蓝染料与蛋白质结合后，其光吸收最大检测波峰是从460nm转移至595nm 2。
图 1. 使用伯乐公司的Bradford蛋白定量检测试剂盒中的牛血清白蛋白标准品制备一条标准曲线。
两台仪器获得的结果比较几乎相同。
实验结果线性区间可达5个稀释度，且R 2结果均为0.98。
可以通过拟合标准曲线得出未知样本的浓度。
使用伯乐公司的Bradford蛋白定量检测试剂盒。
以牛血清白蛋白标品来制作一条标准曲线，加入96孔板中且每个浓度下有三个复孔。
将考马斯亮蓝G-250染料按1:4稀释后加入到蛋白样本中。
孵育30分钟后，分别在EMax Plus和VMax两台读板机上检测585nm 波长下的吸光度。
最后，应用SoftMax ® Pro 软件扣除背景后并生成一条标准曲线(图1)。
通过比较发现两台读板机上得出的R 2结果都是0.98。
曲线的线性部分也和试剂盒中对标准曲线的描述相同。
EMax Plus 微孔板读板机应用手册介绍Bradford 实验优势：••••Bradford 蛋白检测实验:：不同读板机下吸光度的比较EMax Plus R 2 = 0.98V-Max R 2 = 0.98Bovine Serum Albumin mg/mLO .D . 585Application Highlight标配有8块滤片，应用范围更广泛SoftMax Pro软件中含有预设模板简单易操作体积小巧APPLICATION NOTE读板机的吸光值比较: ELISA 实验EMax Plus R 2= 0.984E-Max R 2= 0.99Log [Mouse/Rat IL-22] pg/MLO .D . 450About the MultiWash+ 洗板机白介素22是一种和炎症相关的细胞因子。
线粒体疾病的分子诊断方法
线粒体疾病的分子诊断方法简介：
线粒体是细胞中的一个细胞器，其功能包括能量合成、呼吸链等。
由于其特殊的遗传来源和功能，线粒体疾病呈现出一系列多样化的临床表现。
为了准确地诊断和管理这些疾病，分子诊断方法成为关键工具之一。
本文将介绍线粒体疾病的常见分子诊断方法。
I. 线粒体DNA（mtDNA）测序
A. Sanger测序技术
1. 原理与流程
2. 应用范围和局限性
B. 高通量测序技术（NGS）
1. 原理与流程
2. 应用优势和挑战
II. 多重PCR扩增与SNP分析
A. 多重PCR扩增技术
1. 原理与流程
2. 应用场景和优势
B. SNP分析技术
1. 原理与流程
2. 应用范围和挑战
III. 组蛋白修饰检测方法
A. 定位组蛋白修饰技术
1. 原理与流程
2. 应用场景和优势
B. 全基因组染色质免疫沉淀测序（ChIP-seq）
1. 原理与流程
2. 应用范围和局限性
IV. 蛋白质表达和功能分析
A. 凝胶电泳技术
1. 原理与流程
2. 应用场景和注意事项
B. 创新的蛋白质分析方法
1. 相关研究进展概述
2. 潜在应用前景展望
结语：
线粒体疾病是遗传介导的一类临床复杂的疾病，其诊断需要多种方法的综合应用。
通过线粒体DNA测序、多重PCR扩增与SNP分析、组蛋白修饰检测方法以及蛋白质表达和功能分析等分子诊断方法，可以提高线粒体疾病的准确诊断率，并为个体化治疗提供参考。
随着科学技术的不断发展，我们相信将有更多创新的方法出现，在线粒体疾病的预防和治疗中发挥重要作用。
整理)MTS 细胞增殖及毒性试验之欧阳生创编
MTS 或CCK8细胞增殖及毒性试验一、所需试剂1、CellTiter 96® AQueous One Solution Cell Proliferation Assay试剂盒（-20℃避光保存，4℃保存6周，黄色）（1）MTS：新一代四氮唑蓝盐化合物，即被活细胞线粒体中的多种脱氢酶还原成有色的甲瓒产物，其颜色深浅与某些敏感细胞株的活细胞数在一定范围内呈高度相关。
（2）PES：吩嗪硫酸乙酯，一种电子偶联剂，具有增强的化学稳定性，这使它可与MTS混合形成稳定的溶液2、Cell Counting Kit-8（简称CCK-8）（保存条件同上，紫色）（1）WST-8：2-(2-甲氧基-4-硝基苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2,4-二磺酸苯)-2H-四唑单钠盐（2）1-Methoxy PMS：1-甲氧基-5-甲基吩嗪鎓硫酸二甲酯3、药物或毒素（药物IC50等用到）4、96孔板二、实验步骤1、种板（96孔板）（个/孔），先配总管再加样（多算5孔的量来配总管，以免不够用）每种处理设置3个副孔（空白组可1个），加入100μl培养基：（1）细胞增殖实验：设置NC组，处理组，空白组，6天时间，平均每孔1000-2000个细胞（2）毒性或药物或放疗IC50：设置梯度给药组（包括不给药组），空白组，平均每孔5000-8000个细胞2、在37°C，5% CO2的环境下培养（1）增殖：8h或24h（细胞贴壁时间）,也可种板后直接测第一次，作为基准线，之后每隔24小时检测下一天的细胞量（MTS 每孔加20μl，CCK8加10μl）（2）毒性和药物：培养24h后加入药物培养48小时及以上3、增殖实验每天测量一次，以100全培养基：20MTS比例配制总管（CCK8以100:10）4、吸掉96孔板内待测孔内培养基，每孔加入120μl稀释后的MTS试剂（CCK8加入110μl）4、在37°C，5% CO2的环境下孵育1-4个小时（一般选2h）5、选取波长，MTS选492nm，CCK8选450nm，读取吸光度值，记录结果，以时间为横坐标，每日吸光值/基准值为纵坐标绘制细胞生长曲线。
线粒体异常的表现及其检测
线粒体异常的表现及其检测线粒体具有自我复制、转录和编码功能。
被称为“能量工厂”的线粒体, 人体至少有90%的能量由其产生[ 1] 。
在人体各个细胞都存有线粒体, 单个细胞包含200 ～2000个线粒体, 但是不同组织的细胞内线粒体的数量是不同的, 而在相同组织的细胞内线粒体数量是接近的[ 2] 。
1.线粒体基因损伤在人类, 线粒体DNA(mtDNA)是长16 569 bp的闭合双链环状分子, 每个mtDNA分子编码13个氧化磷酸化蛋白亚单位, 2 个与这些基因翻译有关的rRNA(12SrRNA和16SrRNA)和22个转录RNA, 其中这13个亚单位与核DNA编码的其他亚单位共同组成呼吸链。
此外, 还含有一段与mtDNA复制、转录有关的非编码区(D环区)。
由于缺少组蛋白的保护与有效的校读系统, mtDNA 极易受到氧化磷酸化过程中产生的活性氧(reactiveoxygenspecies, ROS)的损害而突变, 其突变率较DNA高10 ～100 倍[ 3] 。
2.线粒体功能损伤及检测2.1RCR检测测定RCR既可以反映线粒体的完整程度, 又可以反映线粒体氧化呼吸链的功能。
线粒体氧化呼吸链系由一系列的递氢体和递电子体按一定的顺序排列组成的连续反应体系, 代表着线粒体的最基本功能, 可以通过RCR来测定其线粒体外膜及功能完整性和氧化磷酸化效率, RCR为加入ADP时(Stage3)的呼吸速率与ADP耗竭后(Stage4)的呼吸速率之比。
线粒体的呼吸耗氧耦联着ADP与Pi合成三磷酸腺苷的磷酸化反应, ADP/O值是指线粒体每消耗1 mol氧原子的同时, 生成ATP的摩尔数。
RCR通常与ADP/O比值一起, 成为衡量线粒体结构完整与否及氧化磷酸化耦联程度的灵敏指标, 在线粒体氧化呼吸链功能受损的情况下, S3值、RCR、ADP/O 比值下降, S4值则显著升高。
一般使用氧电极法检测, 该方法要求待测定的线粒体是新鲜的, 否则所得数据会发生很大误差[ 11] 。
活体细胞线粒体损伤氧化荧光测定试剂盒产品说明书中文版
12052胰蛋白酶乙二胺四乙酸混合液（12024活体细胞线粒体损伤/氧化荧光测定试剂盒产品说明书（中文版）主要用途活体细胞线粒体损伤/氧化荧光测定试剂是一种旨在通过特异性染色剂分析线粒体膜心磷脂的变化来定性或定量测定线粒体内含质量以及自由基、氧化物等对细胞线粒体的毒性与损伤作用的权威而经典的技术方法。
该技术由大师级科学家精心研制、成功实验证明的。
可以被用于细胞凋亡、信号传递、衰老、代谢和营养学等的研究。
产品严格无菌，即到即用，操作简易，活体检测，性能稳定。
技术背景心磷脂（Cardiolipin ）是线粒体膜上的主要成分之一。
它对细胞氧化特别敏感。
线粒体脂类分解，致使心磷脂显著减少，最终造成线粒体的严重损害。
Nonyl-Acrydine Orange （NAO ）是一种可自由通过细胞膜的染色剂，特异性地染色线粒体上的心磷脂，并发出荧光。
一旦线粒体膜质量减少或受到损害以及被氧化，其荧光显著减弱。
产品内容清理液（Reagent A ） 毫升 染色液（Reagent B ） 微升 稀释液（Reagent C ） 毫升保存液（Reagent D ） 毫升 产品说明书1份保存方式保存染色液（Reagent B ）在－20℃冰箱里，避免光照，其余的保存在4℃冰箱里，有效保证6月用户自备）：用于细胞脱离 完全细胞培养液（）：用于细胞操作所需的培养基 15毫升锥形离心管：用于细胞操作的容器 1.5毫升离心管：用于细胞染色的容器 血细胞计数仪：用于细胞计数 台式离心机：用于沉淀细胞 细胞流式仪：用于细胞荧光分析 比色皿：用于细胞荧光分析的容器 荧光显微镜：用于观察荧光细胞荧光分光光度仪或荧光酶标仪：用于细胞荧光定量分析ＨＬＨＬ实验步骤一、 脱离或悬浮细胞分析实验开始前，将－20℃冰箱里的试剂盒中的染色液（Reagent B）置入冰槽里融化，稀释液（Reagent C）放进37℃恒温水槽里预热。
然后移出xx微升染色液（Reagent B）到新的1.5毫升离心管，加入xx微升稀释液（Reagent C），混匀后，将染色工作液置入暗室里。
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如何借助于具有SpectraMax MinMax300 细胞成像系统的SpectraMax i3多功能微孔板检测平台进行细胞线粒体毒性的检测
简介
评价待选新药对细胞线粒体产生的毒性作用一直被认为是药物筛选过程中的关键步骤，目前可轻松通过不同颜色的荧光染料来标记细胞线粒体后来检测其活性的变化，整个检测过程中通常也需要结合细胞核复染色法，例如使用DAPI染料，这样就可以在图像中轻松识别出所有细胞。
可以利用成像系统的一个荧光通道识别被染核的细胞，而细胞线粒体活性检测可以通过特定的线粒体染料标记后，来分析第二个荧光通道中每个标记后细胞的荧光信号强度值。
然而，细胞核复染色过程会增加一系列额外的操作步骤，使得实验过程变得繁琐、拖延检测时间。
来自于Molecule Devices公司的StainFree™技术(无标记分析技术)可以解放研究人员，使其无需借助于繁琐的细胞核复染色法来识别细胞，可以直接利用SpectraMax® MiniMax™ 300 细胞成像系统的透射光通道来直接识别出单个细胞。
此篇应用文献重点介绍如何利用SpectraMax® i3多功能微孔板检测平台的细胞成像功能来检测细胞线粒体毒性，缬氨霉素，一种离子型抗生素，可对PC12细胞线粒体功能造成损伤，使用MitoTracker Deep Red FM来标记线粒体后对整个过程进行检测，然后分别使用StainFree方法和细胞核荧光染料标记法对细胞计数，SoftMax Pro软件分析比较两组结果。
SpectraMax MiniMax 300细胞成像系统和SoftMax Pro软件组合后，可以帮助研究人员获取图像信息和进行数据分析，准确、快速的给出潜在化合物对细胞线粒体毒性的浓度效应学曲线。
基于细胞检测试验方法的设置
使用含有2.5%胎牛血清、15%的马血清和
1%青霉素/链霉素的F-12K培养基来培养
PC12(大鼠肾上腺嗜铬瘤细胞)细胞，在黑色
底通的96孔板中每孔加入100ul配好的培养
基，细胞的密度为10,000/孔，培养过夜。
隔天，细胞孔内加入缬氨霉素，其浓度范围是
1µM至1nM并按12浓度梯度关系进行稀释，
然后将处理后的微孔板放入37度二氧化碳培
养箱中培养24小时。
完成孵育处理后，将混
有化合物的培养基去除，随后加入含有
100nM 的MitoTracker Deep Red FM(MTDR)
染料的新鲜培养基。
此试剂可以标记活细胞中
的线粒体，可以利用MinMax 细胞成像系统的
远红外荧光通道检测其在远红外波段下的荧光
强度值。
细胞孵育30分钟后，去除混有染料的培养
基，使用4%多聚甲醛固定细胞，固定后的细
胞核使用EarlyTox Dead Green 染料来标记
(Molecular Devices cat. #R8216)。
虽然固
定后是无需使用StainFree方法来分析细胞数
目、形态的，但是此目的是比较这次实验中所
有细胞在不同通道下获得数据的一致性。
利用
MinMax 细胞成像系统的透射光通道对细胞进
行成像，获取细胞数目和分析其形态变化，利
用其红色荧光通道检测其线粒体活性。
同样利
用系统的绿色荧光通道对染核细胞进行计数分
析后与使用透射光通道下StainFree方法计数
的细胞进行比较。
使用SoftMax Pro软件，设置两种不同的成像
分析方法，第一种分析，单个细胞的识别是通
过StainFree方法，可在透射光通道下识别单
个细胞而无需利用细胞核荧光染料分子进行标
记。
为识别每个细胞，在软件中将测量的线粒
体的红色荧光信号以一定形式参数输出。
StainFree技术无需利
用细胞核复染方法就
可以对细胞进行成像
分析
利用SoftMax Pro软件
所具有的细胞成像分
析功能，可以检测出
基于每一个细胞线粒
体荧光信号强度值
可更快的获得细胞线
粒体毒性检测结果
图1：StainFree技术检测PC12细胞
图2：荧光标记方法检测PC12细胞
结果
当使用缬氨霉素处理被标记过线粒体的PC12细胞，发现其会呈现出浓度依赖性关系，信号值会随着浓度升高而降低。
无论我们是使用核染料标记或者StainFree方法都可以识别出单个细胞，这样我们可以定量出基于每个细胞线粒体的荧光信号值，评估出处理化合物与线粒体浓度效应关系，如图1，无标记分析技术用于识别所有细胞，紫色伪彩覆盖区域用于代表单个细胞。
图2显示为使用绿色荧光染料标记细胞核后识别单个细胞的结果，这里，紫色伪彩覆盖区域为细胞核。
伪彩覆盖外延的四个像素点区域可以捕获更多信号，这样可用于分析每个细胞线粒体的荧光信号强度。
伪彩周围颜色较浅边界为延伸区域，区域大小可由用户自定义。
第二种使用核染料标记分析法，为了验证StainFree方法获得结果的准确性。
这里，绿色核染料标记细胞可利用成像系统的绿色荧光通道进行检测。
因为，细胞核染色覆盖区域并不与线粒体荧光染料染色所覆盖的细胞质区域重叠，核复染色覆盖的区域可占4个像素点，约为7.5µm。
这样我们可以通过软件分析出细胞质中线粒体经过红色荧光染料标记后的结果。
对于每种例子进行分析，其线粒体经过化合物处理后我们就可绘出每个细胞线粒体平均荧光信号强度值与化合物浓度值的对应关系图，软件可以自动计算出IC 50的值。
上边一行，透射光与红色荧光染料(线粒体)标记成像重叠结果，下边一行，无标记分析技术检测单个细胞(紫色区域)，左侧，未处理细胞；右侧，使用1µM缬氨霉素处理后的细胞。
左侧，绿色荧光(细胞核)成像和红色荧光(线粒体)成像重叠结果示意图，右侧，使用荧光信号标记出单个细胞的细胞核，深紫色伪彩覆盖区域(绿色箭头)，浅紫色边界为捕获目标细胞延伸区域来进行的分析结果(黄色箭头)。
图3：PC12细胞经缬氨霉素处理后的IC 50曲线
Valinomycin (nM)
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结论
当使用一种细胞荧光标记物时，例如线粒体染料，需要基于每一个细胞进行定量，所以首先要识别出每一个细胞，然后就可以量化每一个细胞的荧光标记物的信号强度。
目前有很多种方法可以识别出单个细胞，一种较为流行的方法是先固定细胞后，使用细胞核染料进行标记。
此外一种更加快速、节省成本、对细胞没有毒性作用的无标记分析技术(StainFree)的最大优势是无需固定细胞和标记染料分子。
这篇应用中我们介绍了StainFree技术和SpectraMax MinMax300细胞成像系统结合后，第一步可利用StainFree 技术快速识别出单个细胞，然后利用荧光通道进一步检测出化合物处理后的被标记线粒体荧光信号强度变化，而且获得结果做出的浓度效应曲线与细胞核染料标记法获得的效应曲线几乎是相一致的，StainFree技术无需对细胞预先固
定，无需像DAPI一样的细胞核染料，
更快的检测速度和更加灵敏的检测结果
使得整个检测流程更加便捷，此外因为此方法不会影响细胞活性，这些细胞还
可以用于其它进一步的检测实验。
使用两种分析方法获得IC 50值结果(图3)来看，无标记分析方法完全可以替代费时、费力以及高成本的核染料标记细胞计数法。
针对细胞的浓度效应学曲线的分析分别使用了StainFree技术(蓝色)和细胞核荧光染料标记法(绿色)，针对每个细胞线粒体平均荧光信号强度值和缬氨霉素浓度值做曲线作图，两种方法获得几乎一致的曲线结果，而且其IC 50值均为57nM。