稻瘟病抗性基因的分子定位及克隆
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［１１］
)Ｋａｎａｚｉｎ 等
将在大豆中获得的 ＲＧＡ 定位于多个抗病基因所在的 区域 ［１６］) 王石平 等用类似的方法定位了 １０ 个 ＲＧＡ 克 隆 !它们与 ８ 个已知抗病基因 & 其中 ５ 个是抗稻瘟病基 因’ 在染色体上的位置相对应［１７］# 在实际操作过程中 ! 仅用某一种或某几种标记往 往难以达到精确定位基因的目的 ! 常常是多管齐下 ! 多 种标记同时使用 ! 迄今 ! 已经利用各种 ＤＮＡ 分子标记 定位了 ５０ 多个稻瘟病主效抗性基因 & 表 １’ #
-./0(12)34, *)$+,(" 引起的稻瘟病是水稻上最具毁灭
性的病害之一 # 由于稻瘟菌有很强的环境适应能力 $ 使 稻瘟病在全球各个水稻种植区内广泛发生 # 据估计 $ 在
１９７５ %１９９０ 年的 １６ 年间由稻瘟菌引起的全球粮食损
失高达 １．５７ 亿 ｔ$ 年平均超过 １０００ 万 ｔ［１］# 稻瘟病也是 中国水稻三大病害之一 $ 每年南北各稻区均有不同程 度的发生 $ 在流行年份 $重病地区一般减产 １０％￣２０％ $ 重的达 ４０％￣５０％ $ 局部田块甚至颗粒无收 # ２０ 世纪
ＣＡＰＳ & Ｃｌｅａｖｅｄ ａｍｐｌｉｆｉｅｄ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｃ ｓｅｑｕｅｎｃｅ’
标记是在 ＳＴＳ 标记的基础上发展而来 ! 其基本原理是 先利用已知位点的 ＤＮＡ 序列资源去设计一套特异性 的 ＰＣＲ 引物 !然后应用这些引物去扩增该位点上的某 一 ＤＮＡ 片段 ! 接着用一种专一性的限制性内切酶切 割所得的扩增带并进行电泳分析 # ＣＡＰＳ 标记揭示的 是特异 ＰＣＲ 片段的限制性长度变异的信息 ! 特异引物 序列来自基因数据库 % 基因组克隆或 ｃＤＮＡ 克隆以及 克隆的 ＲＡＰＤ 条带 # 由于很多限制性内切酶均可将扩 增的 ＤＮＡ 切开 ! 所以 ! 检测到 多 态 性 的 机 会 比 较 大 ! 是 一 种 较 理 想 的 分 子 标 记 技 术 # Ｃａｍｐｂｅｌｌ 等 利 用
ＲＦＬＰ 标记技术复杂 % 检测时间长 ! 大规模应用时受到
限制 $ 近 年 来 又 开 发 出 了 以 ＰＣＲ & ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ
ｒｅａｃｔｉｏｎ’ 技术为基础的其他的分子标记 ! 如 ＲＡＰＤ% ＳＳＲ %ＳＴＳ%ＣＡＰＳ%ＲＧＡ 等 ! 这些分子标记具有操作简
单 % 花费少 % 稳定性高等优点 ! 符合大规模检测的要 求［８］! 因此被广泛用于基因的定位 $
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为重复次数’ 等 ! 由于其重复次数的不同 ! 因此扩增产 物也表现出多态性 # 微卫星多为共显性标记 !其多态性 显著高于 ＲＦＬＰ! 而且在水稻基因组中分布比较均一 ! 是一种理想的分子标记 # 目前 !ＳＳＲ 标记已被广泛用于 目标性状基因的标记 % 种质资源鉴定 %分子遗传连锁图 的构建等方面 # ＭｃＣｏｕｃｈ 等开发了 ２２４０ 个水稻 ＳＳＲ 标记位点 ! 与以前的 ５００ 个标记一起 ! 水稻中共有可
多个数量性状位点控制 ! 发病叶面积 "病斑大小和病斑 数分别与 ７ 个 "２ 个和 １０ 个位点有关 #
［７］
ＤＮＡ 片段两端的序列设计一对特异引物扩增基因组 ＤＮＡ! 产生的一段长度为几百 ｂｐ 的特异序列在基因
组中往往只出现一次 ! 从而能够界定基因组的特异位 点 # 如 Ｌｉｕ 等利用 ＲＡＰＤ%ＳＴＳ 以及 ＳＳＲ 标记定位了稻 瘟病抗性基因 Ｐｉ３６（ｔ） ［１３］#
收稿日期 !２００５－０８－２９ $ 修回日期 ’２００５－０９－０２ #
Ｃｈｉｎｅｓｅ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｂｕｌｌｅｔｉｎ Ｖｏｌ．２２ Ｎｏ．１ ２００６ !"#$"%&
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农业生物技术科学
ｌｉｎｅ!ＲＩＬ） 和 多 循 环 接 种 （ｐｏｌｙｃｙｃｌｉｃ ｉｎｏｃｕｌａｔｉｏｎ） 试 验 ! Ｗａｎｇ 等发现持久抗性品种 Ｍｏｒｏｂｅｒｅｋａｎ 的抗瘟性有
中国农学通报 第 !! 卷 第 " 期 !##$ 年 " 月
农业生物技术科学
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Βιβλιοθήκη Baidu
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稻瘟病抗性基因的分子定位及克隆
李落叶 ! 井金学
! 西 北 农 林 科 技 大 学 植 物 保 护 学 院 $ 陕 西 杨 凌 ７１２１００"
摘 要 ! 简述了稻瘟病抗性的两种类型 ! 着重阐述了稻瘟病主效抗性基因的分子定位和克隆的研究进 展 ! 概述了主要分子标记的种类及其特点 ! 分析了图位克隆法在克隆植物抗病基因中的应用 ! 对其存在 的技术瓶颈进行了探讨 ! 并指明了克服这些技术难点的途径 " 关键词 ! 稻瘟病 # 抗性基因 #分子标记 # 基因克隆
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" 稻瘟病抗性基因的克隆 抗病基因是植物 － 病原物互作中的关键因子 ! 克
隆抗病基因既是揭示植物抗病分子机制的基础 ! 也是 利用基因工程技术进行抗病育种的基础 # 图位克隆技 术是近年来随着各种植物的分子标记图谱的相继建立 而发展起来的 ! 是根据功能基因在基因组中都有相对 较稳定的基因座 ! 在利用分子标记技术对目的基因进
! 稻瘟病抗性的类型
水稻对稻瘟病的抗性可划分为两种重要类型 ’ 即
第一作者简介 ! 李落叶 $ 女 $１９７４ 年出生 $ 湖南人 $ 西北农林科技大学植物病理学在读博士研究生 $ 现在主要从事稻瘟病抗性基因的定位和克隆 # Ｔｅｌ ’
０２９－８７０９２４３４， Ｅ－ｍａｉｌ： ｌｉｌｕｏｙｅ８２２＠１６３．ｃｏｍ #
! 稻瘟病主效抗性基因的分子定位
目前对稻瘟病主效抗性基因的研究较多 ! 基因的 定位和克隆也集中在主效基因方面 $ 目前开发出了 ２０ 种以上的分子标记 ! 其中 ＲＦＬＰ 标记是最初应用于遗 传作图的标记 ! 也是最基本的分子标记 ! 已经定位的抗 稻瘟病基因中大部分都是用 ＲＦＬＰ 标记 $ 然而 ! 由于
［２］
９０ 年代以来 $ 中国稻瘟病发生面积每年都在 ３８０ 万 ｈｍ２ 以上 $年损失稻谷达数亿 ｋｇ［３］#
实践证明 $ 防治稻瘟病最经济有效的方法是选育 和利用抗病品种 $传统的育种方法存在周期长 &易受环 境影响等缺点 # 近年来 $随着分子生物学技术的广泛应 用和发展 $ 稻瘟病抗性基因的分子定位和克隆取得了 突破性进展 $ 这为缩短育种进程 & 实现多个抗病基因的 聚合并获得持久抗病性品种奠定了坚实的基础 #
一套引物可用于不同生物基因组分析’ # 因此受到广大 研 究 者 的 欢 迎 (Ｚｈｕａｎｇ 等 通 过 利 用 ＲＡＰＤ 技 术 分 析
ＲＦＬＰ 和 ＣＡＰＳ 标记将 Ｐｉ７ 定位在第 １１ 染色体上［１４］# 5.? 7@8 标记
在对已经克隆的植物抗病基因的产物结构进行比 较后 !人们发现它们存在一些共同的结构域 !如核苷酸 结合位点 & ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｂｉｎｄｉｎｇ ｓｉｔｅ， ＮＢＳ’ ! 富亮氨酸重复 & ｌｅｕｃｉｎｅ ｒｉｃｈ ｒｅｐｅａｔ !ＬＲＲ’ 以 及 蛋 白 激 酶 & ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉ－
稻 瘟 病 菌 ! !"#$%&’()$( *)$+,( Ｓａｃｃ． 有 性 世 代 为 完全抗性和部分抗性 # 完全抗性由主效基因控制 $ 具有 小种专化性 $ 对品种释放时的抗性水平起重要作用 $ 一 般由 １ 对到 ３ 对显性基因控制 $ 少数情况下为隐性基 因和不完全显性基因控制 # Ｙｕ 等以 ３ 个菲律宾菌株接 种 ５ 个 改 良 品 种 ＩＲ３６ &ＩＲ４６ &ＩＲ５４ &ＩＲ５６ 和 ＩＲ６０ 及 ４ 个传统品种 Ｃａｒｒｅｏｎ& 白秆稻 &Ｐａｎｋｈａｒｉ ２０３ 和 Ｔｅｔｅｐ $ 在 ２０ 个 品 种 ／ 菌 株 组 合 中 $１４ 个 组 合 的 抗 性 表 现 为 两对显性基因控制 $４ 个组合为显性单基因控制 $１ 个 组合为隐性单基因控制［４］# 段永嘉等分析了 ８９ 个水稻 品种的抗稻瘟病遗传规律 $ 发现少数陆稻品种对所测 试菌株的抗性受 ３ 对基因控制外 $ 其余品种对所测试 菌株的抗性分别受 １ 对或 ２ 对显性基因控制 $ 基因间 还存在互补 & 重叠 & 抑制和上位作用［５］# 部分抗性则由多个微效基因控制 $ 对抗性的稳定 性起重要作用 # 目前 $不同的实验室也鉴定到了许多抗 稻瘟病的 ＱＴＬ（Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ｔｒａｉｔ ｌｏｃｕｓ） # 部分抗性常与 病 斑 大 小 和 病 斑 数 量 相 联 系 $Ｗａｎｇ 等 根 据 具 体 表 型 的子代个体比例 $认为 ＩＲ３６ 中至少有 ５ 个抗病基因控 制 部 分 抗 性 ［６］# 利 用 重 组 自 交 系 （Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｉｎｂｒｅｄ
［１５］
ＲＩＬｓ! 在品种 １５６ 中和谷梅 ２ 中分别鉴定了单一抗性
基因 Ｐｉ２４（ｔ） 和 Ｐｉ２５（ｔ） )Ｐａｎ 等通过 ＲＡＰＤ 分析完成了
［９］
稻瘟病抗性基因 Ｐｉ１５ 的精细定位 #
［１０］
5.5 ;;7 标记 ＳＳＲ & Ｓｉｍｐｌｅ－ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｒｅｐｅａｔ’ 分 子 标 记 技 术 是 利 用 特 异 引 物 扩 增 在 植 物 基 因 组 存 在 的 由 １￣４ 个 碱 基 组成的简单重复序列 & ＳＳＲ’ ! 如 （ＧＡ）ｎ % （ＡＣ）ｎ & 其中 ｎ
ｎａｓｅ!ＰＫ’ 等 # 这些结构可能参与蛋白质之间的相互作
用以及细胞信号的识别与传导过程 # 根据抗病基因的 这些保守结构域设计简并引物 ! 应用 ＰＣＲ 技术获得相 似序列 ＤＮＡ 片段 ! 为快速鉴定候选抗病基因提供新 途径 # 这方面已有成功的例子 (Ｌｅｉｓｔｅｒ 等根据 ＲＰＳ２ 基 因和 Ｎ 基因的 ＬＲＲ 结构设计引物 ! 在马铃薯中获得 了与两个抗病基因共分离的 ＲＧＡ 片段
)Ｋａｎａｚｉｎ 等
将在大豆中获得的 ＲＧＡ 定位于多个抗病基因所在的 区域 ［１６］) 王石平 等用类似的方法定位了 １０ 个 ＲＧＡ 克 隆 !它们与 ８ 个已知抗病基因 & 其中 ５ 个是抗稻瘟病基 因’ 在染色体上的位置相对应［１７］# 在实际操作过程中 ! 仅用某一种或某几种标记往 往难以达到精确定位基因的目的 ! 常常是多管齐下 ! 多 种标记同时使用 ! 迄今 ! 已经利用各种 ＤＮＡ 分子标记 定位了 ５０ 多个稻瘟病主效抗性基因 & 表 １’ #
-./0(12)34, *)$+,(" 引起的稻瘟病是水稻上最具毁灭
性的病害之一 # 由于稻瘟菌有很强的环境适应能力 $ 使 稻瘟病在全球各个水稻种植区内广泛发生 # 据估计 $ 在
１９７５ %１９９０ 年的 １６ 年间由稻瘟菌引起的全球粮食损
失高达 １．５７ 亿 ｔ$ 年平均超过 １０００ 万 ｔ［１］# 稻瘟病也是 中国水稻三大病害之一 $ 每年南北各稻区均有不同程 度的发生 $ 在流行年份 $重病地区一般减产 １０％￣２０％ $ 重的达 ４０％￣５０％ $ 局部田块甚至颗粒无收 # ２０ 世纪
ＣＡＰＳ & Ｃｌｅａｖｅｄ ａｍｐｌｉｆｉｅｄ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｃ ｓｅｑｕｅｎｃｅ’
标记是在 ＳＴＳ 标记的基础上发展而来 ! 其基本原理是 先利用已知位点的 ＤＮＡ 序列资源去设计一套特异性 的 ＰＣＲ 引物 !然后应用这些引物去扩增该位点上的某 一 ＤＮＡ 片段 ! 接着用一种专一性的限制性内切酶切 割所得的扩增带并进行电泳分析 # ＣＡＰＳ 标记揭示的 是特异 ＰＣＲ 片段的限制性长度变异的信息 ! 特异引物 序列来自基因数据库 % 基因组克隆或 ｃＤＮＡ 克隆以及 克隆的 ＲＡＰＤ 条带 # 由于很多限制性内切酶均可将扩 增的 ＤＮＡ 切开 ! 所以 ! 检测到 多 态 性 的 机 会 比 较 大 ! 是 一 种 较 理 想 的 分 子 标 记 技 术 # Ｃａｍｐｂｅｌｌ 等 利 用
ＲＦＬＰ 标记技术复杂 % 检测时间长 ! 大规模应用时受到
限制 $ 近 年 来 又 开 发 出 了 以 ＰＣＲ & ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ
ｒｅａｃｔｉｏｎ’ 技术为基础的其他的分子标记 ! 如 ＲＡＰＤ% ＳＳＲ %ＳＴＳ%ＣＡＰＳ%ＲＧＡ 等 ! 这些分子标记具有操作简
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为重复次数’ 等 ! 由于其重复次数的不同 ! 因此扩增产 物也表现出多态性 # 微卫星多为共显性标记 !其多态性 显著高于 ＲＦＬＰ! 而且在水稻基因组中分布比较均一 ! 是一种理想的分子标记 # 目前 !ＳＳＲ 标记已被广泛用于 目标性状基因的标记 % 种质资源鉴定 %分子遗传连锁图 的构建等方面 # ＭｃＣｏｕｃｈ 等开发了 ２２４０ 个水稻 ＳＳＲ 标记位点 ! 与以前的 ５００ 个标记一起 ! 水稻中共有可
多个数量性状位点控制 ! 发病叶面积 "病斑大小和病斑 数分别与 ７ 个 "２ 个和 １０ 个位点有关 #
［７］
ＤＮＡ 片段两端的序列设计一对特异引物扩增基因组 ＤＮＡ! 产生的一段长度为几百 ｂｐ 的特异序列在基因
组中往往只出现一次 ! 从而能够界定基因组的特异位 点 # 如 Ｌｉｕ 等利用 ＲＡＰＤ%ＳＴＳ 以及 ＳＳＲ 标记定位了稻 瘟病抗性基因 Ｐｉ３６（ｔ） ［１３］#
收稿日期 !２００５－０８－２９ $ 修回日期 ’２００５－０９－０２ #
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农业生物技术科学
ｌｉｎｅ!ＲＩＬ） 和 多 循 环 接 种 （ｐｏｌｙｃｙｃｌｉｃ ｉｎｏｃｕｌａｔｉｏｎ） 试 验 ! Ｗａｎｇ 等发现持久抗性品种 Ｍｏｒｏｂｅｒｅｋａｎ 的抗瘟性有
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稻瘟病抗性基因的分子定位及克隆
李落叶 ! 井金学
! 西 北 农 林 科 技 大 学 植 物 保 护 学 院 $ 陕 西 杨 凌 ７１２１００"
摘 要 ! 简述了稻瘟病抗性的两种类型 ! 着重阐述了稻瘟病主效抗性基因的分子定位和克隆的研究进 展 ! 概述了主要分子标记的种类及其特点 ! 分析了图位克隆法在克隆植物抗病基因中的应用 ! 对其存在 的技术瓶颈进行了探讨 ! 并指明了克服这些技术难点的途径 " 关键词 ! 稻瘟病 # 抗性基因 #分子标记 # 基因克隆
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隆抗病基因既是揭示植物抗病分子机制的基础 ! 也是 利用基因工程技术进行抗病育种的基础 # 图位克隆技 术是近年来随着各种植物的分子标记图谱的相继建立 而发展起来的 ! 是根据功能基因在基因组中都有相对 较稳定的基因座 ! 在利用分子标记技术对目的基因进
! 稻瘟病抗性的类型
水稻对稻瘟病的抗性可划分为两种重要类型 ’ 即
第一作者简介 ! 李落叶 $ 女 $１９７４ 年出生 $ 湖南人 $ 西北农林科技大学植物病理学在读博士研究生 $ 现在主要从事稻瘟病抗性基因的定位和克隆 # Ｔｅｌ ’
０２９－８７０９２４３４， Ｅ－ｍａｉｌ： ｌｉｌｕｏｙｅ８２２＠１６３．ｃｏｍ #
! 稻瘟病主效抗性基因的分子定位
目前对稻瘟病主效抗性基因的研究较多 ! 基因的 定位和克隆也集中在主效基因方面 $ 目前开发出了 ２０ 种以上的分子标记 ! 其中 ＲＦＬＰ 标记是最初应用于遗 传作图的标记 ! 也是最基本的分子标记 ! 已经定位的抗 稻瘟病基因中大部分都是用 ＲＦＬＰ 标记 $ 然而 ! 由于
［２］
９０ 年代以来 $ 中国稻瘟病发生面积每年都在 ３８０ 万 ｈｍ２ 以上 $年损失稻谷达数亿 ｋｇ［３］#
实践证明 $ 防治稻瘟病最经济有效的方法是选育 和利用抗病品种 $传统的育种方法存在周期长 &易受环 境影响等缺点 # 近年来 $随着分子生物学技术的广泛应 用和发展 $ 稻瘟病抗性基因的分子定位和克隆取得了 突破性进展 $ 这为缩短育种进程 & 实现多个抗病基因的 聚合并获得持久抗病性品种奠定了坚实的基础 #
一套引物可用于不同生物基因组分析’ # 因此受到广大 研 究 者 的 欢 迎 (Ｚｈｕａｎｇ 等 通 过 利 用 ＲＡＰＤ 技 术 分 析
ＲＦＬＰ 和 ＣＡＰＳ 标记将 Ｐｉ７ 定位在第 １１ 染色体上［１４］# 5.? 7@8 标记
在对已经克隆的植物抗病基因的产物结构进行比 较后 !人们发现它们存在一些共同的结构域 !如核苷酸 结合位点 & ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｂｉｎｄｉｎｇ ｓｉｔｅ， ＮＢＳ’ ! 富亮氨酸重复 & ｌｅｕｃｉｎｅ ｒｉｃｈ ｒｅｐｅａｔ !ＬＲＲ’ 以 及 蛋 白 激 酶 & ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉ－
稻 瘟 病 菌 ! !"#$%&’()$( *)$+,( Ｓａｃｃ． 有 性 世 代 为 完全抗性和部分抗性 # 完全抗性由主效基因控制 $ 具有 小种专化性 $ 对品种释放时的抗性水平起重要作用 $ 一 般由 １ 对到 ３ 对显性基因控制 $ 少数情况下为隐性基 因和不完全显性基因控制 # Ｙｕ 等以 ３ 个菲律宾菌株接 种 ５ 个 改 良 品 种 ＩＲ３６ &ＩＲ４６ &ＩＲ５４ &ＩＲ５６ 和 ＩＲ６０ 及 ４ 个传统品种 Ｃａｒｒｅｏｎ& 白秆稻 &Ｐａｎｋｈａｒｉ ２０３ 和 Ｔｅｔｅｐ $ 在 ２０ 个 品 种 ／ 菌 株 组 合 中 $１４ 个 组 合 的 抗 性 表 现 为 两对显性基因控制 $４ 个组合为显性单基因控制 $１ 个 组合为隐性单基因控制［４］# 段永嘉等分析了 ８９ 个水稻 品种的抗稻瘟病遗传规律 $ 发现少数陆稻品种对所测 试菌株的抗性受 ３ 对基因控制外 $ 其余品种对所测试 菌株的抗性分别受 １ 对或 ２ 对显性基因控制 $ 基因间 还存在互补 & 重叠 & 抑制和上位作用［５］# 部分抗性则由多个微效基因控制 $ 对抗性的稳定 性起重要作用 # 目前 $不同的实验室也鉴定到了许多抗 稻瘟病的 ＱＴＬ（Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ｔｒａｉｔ ｌｏｃｕｓ） # 部分抗性常与 病 斑 大 小 和 病 斑 数 量 相 联 系 $Ｗａｎｇ 等 根 据 具 体 表 型 的子代个体比例 $认为 ＩＲ３６ 中至少有 ５ 个抗病基因控 制 部 分 抗 性 ［６］# 利 用 重 组 自 交 系 （Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｉｎｂｒｅｄ
［１５］
ＲＩＬｓ! 在品种 １５６ 中和谷梅 ２ 中分别鉴定了单一抗性
基因 Ｐｉ２４（ｔ） 和 Ｐｉ２５（ｔ） )Ｐａｎ 等通过 ＲＡＰＤ 分析完成了
［９］
稻瘟病抗性基因 Ｐｉ１５ 的精细定位 #
［１０］
5.5 ;;7 标记 ＳＳＲ & Ｓｉｍｐｌｅ－ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｒｅｐｅａｔ’ 分 子 标 记 技 术 是 利 用 特 异 引 物 扩 增 在 植 物 基 因 组 存 在 的 由 １￣４ 个 碱 基 组成的简单重复序列 & ＳＳＲ’ ! 如 （ＧＡ）ｎ % （ＡＣ）ｎ & 其中 ｎ
ｎａｓｅ!ＰＫ’ 等 # 这些结构可能参与蛋白质之间的相互作
用以及细胞信号的识别与传导过程 # 根据抗病基因的 这些保守结构域设计简并引物 ! 应用 ＰＣＲ 技术获得相 似序列 ＤＮＡ 片段 ! 为快速鉴定候选抗病基因提供新 途径 # 这方面已有成功的例子 (Ｌｅｉｓｔｅｒ 等根据 ＲＰＳ２ 基 因和 Ｎ 基因的 ＬＲＲ 结构设计引物 ! 在马铃薯中获得 了与两个抗病基因共分离的 ＲＧＡ 片段