广谱稻瘟病抗性基因Pigm和Pi2的抗谱差异及与Pi1的互作效应
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作物学报
ACTA AGRONOMICA SINICA 2013, 39(11): 19271934 ISSN 0496-3490; CODEN TSHPA9
http://zwxb.chinacrops.org/ E-mail: xbzw@chinajournal.net.cn
DOI: 10.3724/SP.J.1006.2013.01927
表 1 筛选的分子标记信息 Table 1 Marker information for MAS 基因 Gene Pi2 Pigm Pi1 标记 Marker AP22 ZJ58.7 RM224 预期片段长度 Length (bp) 143 236 237 正反向引物序列 Primer sequence (53 ) F: GTGCATGAGTCCAGCTCAAA; R: GTGTACTCCCATGGCTGCTC F: ACTTGCTGGGAGAAGGATT; R: AGTTCGTACTTTTCAGGCT F: ATCGATCGATCTTCACGAGG; R: TGCTATAAAAGGCATTCGGG
发掘新的广谱稻瘟病抗性基因是培育抗性品种 及控制病害的有效途径。 迄今已有 63 个抗稻瘟病位 点的 77 个主效基因被分子定位 , 并有 22 个基因被 克隆。这些基因分布于除第 3 染色体外的其他 11 条
水稻染色体上 , 并具有成簇分布的特性 (http://www. ricedate.cn/gene/, 国家水稻数据中心基因数据库 ) 。 其中 , 第 6 染色体短臂近着丝粒的附近分布有 Pi2、 Pi9 、 Pi22 、 Pi25 、 Pi26 、 Pi40 、 Pi42 、 Pi50 、 Piz 、
本研究由江苏省自然科学基金项目 (BK2011427)和江苏省农业科技自主创新资金产业体系类项目 (CX(12)1003-4)资助。
*
通讯作者 (Corresponding author): 李爱宏 , E-mail: yzlah@126.com, Tel: 0514-87302340
第一作者联系方式 : E-mail: ymmie2009@126.com; Tel: 15380376552 Received(收稿日期 ): 2013-03-21; Accepted(接受日期 ): 2013-06-24; Published online(网络出版日期 ): 2013-08-12. URL: http://www.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20130812.1751.021.html
广谱稻瘟病抗性基因 Pigm 和 Pi2 的抗谱差异及与 Pi1 的互作效应
于苗苗 1,2,3 戴正元 1 潘存红 1 陈夕军 2 余 玲1 张晓祥 1 肖 宁1 龚红兵 3 盛生兰 3 潘学彪 2 张洪熙 1 李爱宏 1,*
1
李育红 1
江里下河地区农业科学研究所 / 国家水稻改良中心南京分中心扬州试验站 , 江苏扬州 225007; 2 扬州大学植物功能基因组学教育部
1
Lixiahe Agricultural Research Institute of Jiangsu Province / Yangzhou Station of Nanjing Sub-center of National Rice Improvement Center, Zhenjiang Institute of Agricultural Science in Jiangsu Hilly Region, Jurong 212400, China
Yangzhou 225007, China; 2 Key Laboratory of Plant Functional Genomics, Ministry of Education, Yangzhou University, Yangzhou 225009, China;
3
Abstract: Pigm, an R gene to rice blast disease, is either allelic or tightly linked to Pi2. In this study, a series of near-isogenic lines (NILs) containing Pigm and Pi2 under four genetic backgrounds of rice cultivars were established, respectively. The results from inoculating with 204 representative races at seedling stage showed that the resistance frequency of NILs carrying Pigm and Pi2 all reached more than 70%, but the overlapping degree of resistance spectrum between them was only 54.4% to 65.7%, and the resistance frequency of hybrids pyramiding Pi1/Pigm and Pi1/Pi2 was more than 90%. Disease development from artificial inoculation at heading stage and natural induction in disease nursery showed consistent trend with that from inoculation at seedling stage. Agronomic traits of most NILs were similar to those of recurrent parent, indicating that the target region contains few linkage drags. In conclusion, Pigm is a broad-spectrum blast resistance gene possessing significant resistance spectrum difference from Pi2, and holds important value for rice blast breeding. Keywords: Blast resistance gene; Marker-assisted selection; Near-isogenic lines; Resistance spectrum; Interaction effect
标记检测 参 照 卢 扬 江 等 [14] 的 方 法 提 取 水 稻 全 基 因 组 DNA。 20 μL PCR 反应体系, 包括 MgCl2 (25 mmol L1) 2.0 μ L, buffer (×10) 2.0 μ L, 引 物 ( 上 下 游 引 物 , 3.084 mmol L) 1.5 μL, dNTP (10 mmol L1) 0.4 μL, Taq DNA 聚合酶(5 U μL1) 0.2 μL, 模板 DNA 2.0 μL; ddH 2 O 11.9 μ L 。 PCR 条件为 94 ℃ 预变性 5 minHale Waihona Puke Baidu 94 ℃ 变性 50 s, 55 ℃ 复性 50 s, 72 ℃ 延伸 1 min, 36 个循环 ; 72 ℃ 充分延伸 10 min。将 PCR 产物上样于 含 溴 化 乙 锭 的 3% 琼 脂 糖 凝 胶 , 电 泳 分 离 后 于 BIORAD 凝胶成像仪下拍摄并观察读数。供体亲本 带型、受体亲本带型和双带分别赋值 1、 3 和 2, 缺 带赋值 0。 1.4 遗传背景回复率检测 结合 http://www.gramene.org/ 网站上公布的水稻 SSR 分子标记的信息和本实验室开发的标记 , 采用 目标基因区间以外相对均匀分布的 132 个分子标记 , 针对供、受体双亲进行多态性筛选 , 在 2个亲本之间 具有多态性的标记确定为用于背景回复率检测的中 选标记 , 要求每条染色体至少获得 3 个以上的多态 性标记且分布相对均匀。 参照 Hospital等 [15]的方法计 1.3
重点实验室 , 江苏扬州 225009; 3 江苏丘陵地区镇江农业科学研究所 , 江苏句容 212400
摘
要 : Pigm 是 Pi2 基因簇的等位或紧密连锁基因。 本研究构建了 4 个不同遗传背景下 Pigm 和 Pi2 的系列近等基因
系 , 204 个菌株苗期接种结果显示其抗性频率均超过 70%, 但 Pigm 和 Pi2 的抗谱重叠度仅为 54.4%~65.7%, 聚合 Pi1/Pigm 和 Pi1/Pi2 杂种的抗性频率均超过 90%。穗瘟人工接种及病圃自然诱发鉴定表现与苗期接种一致的发病趋 势。农艺性状调查结果显示获得的近等基因系与其轮回亲本基本相似 , 存在较少的累赘连锁。表明 Pigm 是一个与 Pi2 抗谱差异明显的广谱抗性基因 , 对稻瘟病抗性育种具有重要应用价值。 关键词 : 稻瘟病抗性基因 ; 标记辅助选择 ; 近等基因系 ; 抗谱 ; 互作效应
1
1.1
材料与方法
供试材料的选择
Pi1 和 Pi2 基因的供体亲本为 W1, 是以金 23B
Pigm 为轮回亲本导入 Pi1 和 Pi2 基因的中间材料 [9]。 的供体亲本为谷梅 4 号。受体轮回亲本包括 2 个光 温敏核不育系广占 63S、 97S, 及 2 个中籼稻恢复系 R084 和 R609, 均由本项目组保存或培育而成。
多态性分子标记的发展 结合 http://www.gramene.org/ 网站上分子标记的信 息和3个抗性基因的定位或克隆信息, 采用Primer Premier 5.0软件发展分子标记设计引物, 引物由TaKaRa公 司负责合成, 用1%~3%的琼脂糖电泳筛选多态性的分 子标记。最后针对不同供体, 筛选获得与4个轮回亲本 均有良好多态性的标记AP22、ZJ58.7及RM224, 用于后 续的标记辅助选择。具体信息列于表1。 1.2
1928
作 物 学 报
第 39 卷
Piz-t 等至少 10 个抗性基因 , 这些基因在抗病基因簇 内呈等位或紧密连锁关系 , 并有研究结果显示其抗 谱存在明显差异 [1-7]。但这种差异大多是在不同遗传 背景下获得的初步鉴定结果 , 缺乏在同一遗传背景 下 (如近等基因系水平上 )的验证。 Pigm 是从持久抗 稻瘟病品种谷梅 4 号中鉴定的一个新的广谱稻瘟病 抗性基因 , 定位及等位性测验结果显示其可能与第 6 染色体的 Pi2 和 Pi9 等位或连锁 [8]。 Pi1 是源自利 比亚粳型品种 “LAC23” 的广谱稻瘟病抗性基因 , 定 位在第 11 染色体上 MGR4766 标记 1.3 cM 处 , 现已 经被成功克隆 [9-10], 并有研究显示其与 Pi2 有良好的 互补效应 [11-13]。本研究构建了 4 个轮回亲本背景下 Pigm、 Pi2 的系列近等基因系 , 进而比较其抗谱差异 , 并分析其与 Pi1 的互作效应 , 从而为稻瘟病抗性育 种提供参考。
Resistance Spectrum Difference between Two Broad-Spectrum Blast Resistance Genes, Pigm and Pi2, and Their Interaction Effect on Pi1
YU Miao-Miao1,2,3, DAI Zheng-Yuan1, PAN Cun-Hong1, CHEN Xi-Jun2, YU Ling1, ZHANG Xiao-Xiang1, LI Yu-Hong1, XIAO Ning1, GONG Hong-Bing3, SHENG Sheng-Lan3, PAN Xue-Biao2, ZHANG Hong-Xi1, and LI Ai-Hong1,*
ACTA AGRONOMICA SINICA 2013, 39(11): 19271934 ISSN 0496-3490; CODEN TSHPA9
http://zwxb.chinacrops.org/ E-mail: xbzw@chinajournal.net.cn
DOI: 10.3724/SP.J.1006.2013.01927
表 1 筛选的分子标记信息 Table 1 Marker information for MAS 基因 Gene Pi2 Pigm Pi1 标记 Marker AP22 ZJ58.7 RM224 预期片段长度 Length (bp) 143 236 237 正反向引物序列 Primer sequence (53 ) F: GTGCATGAGTCCAGCTCAAA; R: GTGTACTCCCATGGCTGCTC F: ACTTGCTGGGAGAAGGATT; R: AGTTCGTACTTTTCAGGCT F: ATCGATCGATCTTCACGAGG; R: TGCTATAAAAGGCATTCGGG
发掘新的广谱稻瘟病抗性基因是培育抗性品种 及控制病害的有效途径。 迄今已有 63 个抗稻瘟病位 点的 77 个主效基因被分子定位 , 并有 22 个基因被 克隆。这些基因分布于除第 3 染色体外的其他 11 条
水稻染色体上 , 并具有成簇分布的特性 (http://www. ricedate.cn/gene/, 国家水稻数据中心基因数据库 ) 。 其中 , 第 6 染色体短臂近着丝粒的附近分布有 Pi2、 Pi9 、 Pi22 、 Pi25 、 Pi26 、 Pi40 、 Pi42 、 Pi50 、 Piz 、
本研究由江苏省自然科学基金项目 (BK2011427)和江苏省农业科技自主创新资金产业体系类项目 (CX(12)1003-4)资助。
*
通讯作者 (Corresponding author): 李爱宏 , E-mail: yzlah@126.com, Tel: 0514-87302340
第一作者联系方式 : E-mail: ymmie2009@126.com; Tel: 15380376552 Received(收稿日期 ): 2013-03-21; Accepted(接受日期 ): 2013-06-24; Published online(网络出版日期 ): 2013-08-12. URL: http://www.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20130812.1751.021.html
广谱稻瘟病抗性基因 Pigm 和 Pi2 的抗谱差异及与 Pi1 的互作效应
于苗苗 1,2,3 戴正元 1 潘存红 1 陈夕军 2 余 玲1 张晓祥 1 肖 宁1 龚红兵 3 盛生兰 3 潘学彪 2 张洪熙 1 李爱宏 1,*
1
李育红 1
江里下河地区农业科学研究所 / 国家水稻改良中心南京分中心扬州试验站 , 江苏扬州 225007; 2 扬州大学植物功能基因组学教育部
1
Lixiahe Agricultural Research Institute of Jiangsu Province / Yangzhou Station of Nanjing Sub-center of National Rice Improvement Center, Zhenjiang Institute of Agricultural Science in Jiangsu Hilly Region, Jurong 212400, China
Yangzhou 225007, China; 2 Key Laboratory of Plant Functional Genomics, Ministry of Education, Yangzhou University, Yangzhou 225009, China;
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Abstract: Pigm, an R gene to rice blast disease, is either allelic or tightly linked to Pi2. In this study, a series of near-isogenic lines (NILs) containing Pigm and Pi2 under four genetic backgrounds of rice cultivars were established, respectively. The results from inoculating with 204 representative races at seedling stage showed that the resistance frequency of NILs carrying Pigm and Pi2 all reached more than 70%, but the overlapping degree of resistance spectrum between them was only 54.4% to 65.7%, and the resistance frequency of hybrids pyramiding Pi1/Pigm and Pi1/Pi2 was more than 90%. Disease development from artificial inoculation at heading stage and natural induction in disease nursery showed consistent trend with that from inoculation at seedling stage. Agronomic traits of most NILs were similar to those of recurrent parent, indicating that the target region contains few linkage drags. In conclusion, Pigm is a broad-spectrum blast resistance gene possessing significant resistance spectrum difference from Pi2, and holds important value for rice blast breeding. Keywords: Blast resistance gene; Marker-assisted selection; Near-isogenic lines; Resistance spectrum; Interaction effect
标记检测 参 照 卢 扬 江 等 [14] 的 方 法 提 取 水 稻 全 基 因 组 DNA。 20 μL PCR 反应体系, 包括 MgCl2 (25 mmol L1) 2.0 μ L, buffer (×10) 2.0 μ L, 引 物 ( 上 下 游 引 物 , 3.084 mmol L) 1.5 μL, dNTP (10 mmol L1) 0.4 μL, Taq DNA 聚合酶(5 U μL1) 0.2 μL, 模板 DNA 2.0 μL; ddH 2 O 11.9 μ L 。 PCR 条件为 94 ℃ 预变性 5 minHale Waihona Puke Baidu 94 ℃ 变性 50 s, 55 ℃ 复性 50 s, 72 ℃ 延伸 1 min, 36 个循环 ; 72 ℃ 充分延伸 10 min。将 PCR 产物上样于 含 溴 化 乙 锭 的 3% 琼 脂 糖 凝 胶 , 电 泳 分 离 后 于 BIORAD 凝胶成像仪下拍摄并观察读数。供体亲本 带型、受体亲本带型和双带分别赋值 1、 3 和 2, 缺 带赋值 0。 1.4 遗传背景回复率检测 结合 http://www.gramene.org/ 网站上公布的水稻 SSR 分子标记的信息和本实验室开发的标记 , 采用 目标基因区间以外相对均匀分布的 132 个分子标记 , 针对供、受体双亲进行多态性筛选 , 在 2个亲本之间 具有多态性的标记确定为用于背景回复率检测的中 选标记 , 要求每条染色体至少获得 3 个以上的多态 性标记且分布相对均匀。 参照 Hospital等 [15]的方法计 1.3
重点实验室 , 江苏扬州 225009; 3 江苏丘陵地区镇江农业科学研究所 , 江苏句容 212400
摘
要 : Pigm 是 Pi2 基因簇的等位或紧密连锁基因。 本研究构建了 4 个不同遗传背景下 Pigm 和 Pi2 的系列近等基因
系 , 204 个菌株苗期接种结果显示其抗性频率均超过 70%, 但 Pigm 和 Pi2 的抗谱重叠度仅为 54.4%~65.7%, 聚合 Pi1/Pigm 和 Pi1/Pi2 杂种的抗性频率均超过 90%。穗瘟人工接种及病圃自然诱发鉴定表现与苗期接种一致的发病趋 势。农艺性状调查结果显示获得的近等基因系与其轮回亲本基本相似 , 存在较少的累赘连锁。表明 Pigm 是一个与 Pi2 抗谱差异明显的广谱抗性基因 , 对稻瘟病抗性育种具有重要应用价值。 关键词 : 稻瘟病抗性基因 ; 标记辅助选择 ; 近等基因系 ; 抗谱 ; 互作效应
1
1.1
材料与方法
供试材料的选择
Pi1 和 Pi2 基因的供体亲本为 W1, 是以金 23B
Pigm 为轮回亲本导入 Pi1 和 Pi2 基因的中间材料 [9]。 的供体亲本为谷梅 4 号。受体轮回亲本包括 2 个光 温敏核不育系广占 63S、 97S, 及 2 个中籼稻恢复系 R084 和 R609, 均由本项目组保存或培育而成。
多态性分子标记的发展 结合 http://www.gramene.org/ 网站上分子标记的信 息和3个抗性基因的定位或克隆信息, 采用Primer Premier 5.0软件发展分子标记设计引物, 引物由TaKaRa公 司负责合成, 用1%~3%的琼脂糖电泳筛选多态性的分 子标记。最后针对不同供体, 筛选获得与4个轮回亲本 均有良好多态性的标记AP22、ZJ58.7及RM224, 用于后 续的标记辅助选择。具体信息列于表1。 1.2
1928
作 物 学 报
第 39 卷
Piz-t 等至少 10 个抗性基因 , 这些基因在抗病基因簇 内呈等位或紧密连锁关系 , 并有研究结果显示其抗 谱存在明显差异 [1-7]。但这种差异大多是在不同遗传 背景下获得的初步鉴定结果 , 缺乏在同一遗传背景 下 (如近等基因系水平上 )的验证。 Pigm 是从持久抗 稻瘟病品种谷梅 4 号中鉴定的一个新的广谱稻瘟病 抗性基因 , 定位及等位性测验结果显示其可能与第 6 染色体的 Pi2 和 Pi9 等位或连锁 [8]。 Pi1 是源自利 比亚粳型品种 “LAC23” 的广谱稻瘟病抗性基因 , 定 位在第 11 染色体上 MGR4766 标记 1.3 cM 处 , 现已 经被成功克隆 [9-10], 并有研究显示其与 Pi2 有良好的 互补效应 [11-13]。本研究构建了 4 个轮回亲本背景下 Pigm、 Pi2 的系列近等基因系 , 进而比较其抗谱差异 , 并分析其与 Pi1 的互作效应 , 从而为稻瘟病抗性育 种提供参考。
Resistance Spectrum Difference between Two Broad-Spectrum Blast Resistance Genes, Pigm and Pi2, and Their Interaction Effect on Pi1
YU Miao-Miao1,2,3, DAI Zheng-Yuan1, PAN Cun-Hong1, CHEN Xi-Jun2, YU Ling1, ZHANG Xiao-Xiang1, LI Yu-Hong1, XIAO Ning1, GONG Hong-Bing3, SHENG Sheng-Lan3, PAN Xue-Biao2, ZHANG Hong-Xi1, and LI Ai-Hong1,*