有关克隆在医学领域的最新进展

克隆技术在医学领域的最新进展

摘要：随着克隆技术的发展及人类基因组计划的完成，人们对于生物技术的研究进入崭新的阶段，越来越需求克隆技术给我们人类带来好处，为我们所用。尤其是在医学领域，为我们解决医学难题和为人类健康做贡献。单克隆抗体制备、电子克隆、基因克隆等技术在医学领域有突出的研究进展。

关键词：电子克隆技术；单克隆抗体；嵌合抗体；噬菌体抗体库技术。1电子克隆技术

1.1电子克隆技术基本原理：利用电子克隆方法获得新基因是生物信息学的研究内容之一。生物信息学资源是由数据库、计算机网络和应用软件3大部分组成；而电子克隆的应用即是基于这3部分生物信息学资源而展开的。它是利用计算机技术，依托现有的网络资源『表达序列标签(EST)数据库、核苷酸数据库、蛋白质数据库和基因组数据库等】，采用生物信息学方法(包括同源性检索、聚类及序列拼装等)，通过EsT或基因组的序列组装和拼接，利用RT．PCR快速地获得部分乃至全长cDNA序列的方法。

1.2电子克隆技术在医学领域的应用

1.2.1电子克隆与肝癌原发性肝癌（PLC）是我国高发的恶性肿瘤之一。据统计，每年约有13万人死于肝癌，占全世界肝癌年死亡人数的43．7％。因此，深入认识肝癌的发病分子机制，开展对肝癌的基因水平的研究，已经成为我国医学界基础与临床研究所关注的焦点。F．LANa是一个进化上保守且在肝癌中表达上调的肿瘤相关基因，利用电子克隆技术发现该基因编码了一种大小为239 aa的蛋白质，从不同物种对其同源性进行分析，表明该基因是从酵母菌到人类不断进

化的。科学家以大鼠为研究对象，采用电子克隆技术与聚合酶链式反应(PcR)技术相结合的方法，成功克隆出4个与大鼠肝癌有关的EST 片段的cDNA序列，经进一步BLAST对比分析，得出G15、G20、G36、G40 4个基因为新基因。健脾益气法对肝癌的治疗有一定效果，为进一步揭示健脾益气法防治PLC的分子机制，研究人员采用了电子克隆与RT．PCR相结合的方法，筛选出了与大鼠肝癌相关的17个ESTs片段的全长cDNA序列，并且克隆出14个ESTs片段的含完整编码区全长或近全长的cDNA序列，经BLAST对比，有7个为新基因，命名为zHl、zH3、zH8、zHl2、zHl4、zHl6、zHl7基因，这为今后进一步深入观察这些基因的功能及其在PLC发生、发展过程中的作用机制打下良好的研究基础。

1.2.2电子克隆与白血病白血病是造血系统最常见的恶性肿瘤之一，其生物学行为复杂多变，发生发展的分子生物学机制尚未阐明。近年来，分子遗传学研究表明白血病是基因相关性肿瘤。因此，克隆白血病相关新基因不仅有助于阐述白血病的发病机制，而且有助于找到一些治疗的靶位点。科学家在家族性急性髓系白血病的研究中，综合运用电子克隆技术和RACE(rapid—amplification of cDNA ends)技术克隆出了与该疾病相关新基因的全长cDNA和432 bp的开放阅读框架(0RF)，白血病等恶性肿瘤细胞对多种化学药物产生交叉耐药性称为多药耐药是造成化学药物治疗失败的主要原因。因此，MDR机制的探讨和逆转一直是白血病研究中的重点、难点问题。科学家在探讨白血病细胞MDR分子的发生机理过程中，利用电子克隆技术克隆了新的MDR相关基因HVl26，它的cDNA序列长1991bp，编码3654个氨基酸，其编码蛋白序列局部与新近发现的在细胞凋亡与炎症反应中起重要作用的蛋白基序“PYRIN”存在约43％的相似性。RT．PCR提示，该基因与白血病细胞受化疗药物的作用和耐药存在联系。

2 单克隆抗体研究最新进展

2.1单克隆抗体技术的基本原理：小鼠受到外界抗原刺激后可诱发免疫反应，产生相应的抗体，这一职能是由B淋巴细胞来承担的；肿瘤细胞在体外培养的条件下可以无限传代，是“永久”的细胞。把小鼠的骨髓瘤细胞与经免疫过的小鼠的脾细胞在聚乙二醇等介导下发生融合，融合后的杂交瘤细胞具有两种亲本细胞的特性，一方面可以分泌特定的抗体，另一方面也具备了肿瘤细胞无限繁殖的能力，可在体外培养的条件下或移植到体内无限增殖，从而分泌大量单克隆抗体。

但单克隆抗体技术研制成功后在临床应用方面进展缓慢，主要原因是单克隆抗体大多数鼠源性的，而鼠源单抗用于人体治疗时存在诸多问题：鼠源单抗在人体中常不能有效激活补体和Fe受体相关的效应系统；被人类免疫系统所识别，产生人抗鼠抗体反应；且在人体循环系统中很快被消除。因此，在保留对特异性抗原表位的高亲和力的基础上实现人源化和全人化的改造，减少异源抗体的免疫源性成为单抗研究的重点。近年来，随着分子生物学的发展，出现了嵌合单克隆抗体和由转基因小鼠、噬菌体展示技术、核糖体展示技术所制备的单克隆抗体。这些技术可解决传统杂交瘤技术所存在的问题，使单克隆抗体更好的为人类所用。

2.2嵌合抗体嵌合抗体是将非人源抗体可变区移植到人抗体恒定区，应用DNA重组技术将小鼠抗体基因上的可变区与人抗体基因的恒定区重组，再将重组后的基因导入骨髓瘤细胞中表达。根据所用的载体质粒标记基因产物，选用适当的抗生素或试剂进行筛选，再用传统杂交瘤技术相似的方法克隆出分泌人鼠嵌合抗体的细胞株。但这种抗体仍保留原来鼠源抗体约30%左右的鼠源性，可诱发人抗小鼠反应。

为进一步提高嵌合抗体的人源化，在嵌合抗体的制备过程中又引进了重构抗体技术和表面重塑技术以提高抗体的人源化。重构抗体技术是与异源抗体和抗原的结合相关的；而表面重塑抗体技术是对小鼠

抗体表面氨基酸残基进行人源化改造，在维持抗体活性并兼顾减少异源性基础上选用与人抗体表面残基相似的氨基酸进行替换。

2.3噬菌体抗体库技术噬菌体展示技术建立在噬菌体外壳具有表达抗体蛋白片段能力的基础上。这项技术的基本原理是用基因工程技术克隆人抗体可变区的全套基因，然后将克隆的基因插入噬菌体编码衣壳蛋白的基因中，建立噬菌体抗体文库，从而使该异源分子呈现于噬菌体表面。

制备方法是将抗原包被在固相介质上，加入待筛选的噬菌体颗粒与固定的抗原结合，获取结合的抗体，将未结合的抗体洗脱，从噬菌体库中筛选出针对特定抗原的特异性抗体可变区。用表达有相应抗体分子的噬菌体颗粒得到扩增，将抗体可变区与恒定区组合得到具有完整功能的全人单克隆抗体。

展望：电子克隆技术的产生从此改变了基因研究的策略。随着基因组序列信息的日益丰富以及计算方法和数据库的不断完善，电子克隆技术将在基因全长cDNA克隆和分析中发挥更加重要的作用；同时，随着重组DNA技术的进一步发展，可以根据不同需要实现人-人、人-动物、人-植物和动物-动物等多种抗体重新组合，借助于杂交瘤细胞产生嵌合抗体、重组型抗体、全套抗体，将单克隆抗体的产生效率、质量以及应用提升到一个更高的水平，使这两项技术在医学领域更好的为人类健康服务。

【参考文献】

【1】管冬元，方肇勤，朱希，等．大鼠肝癌高表达基因cDNA序列的克隆【J】．实用肿瘤杂志，2008，23(5)：409414．

【2】张辉，方肇勤，管冬元．健脾益气法下调大鼠肝癌有关新基因的克隆【J】．上海中医药杂志，2007，41(3)：55—59．

【3】王程毅，王少元，林旭，等．家族性急性髓系白血病相关新基因ELF2CcDNA全长的克