Southern_blot实验方法与步骤

Southern blot实验方法和操作步骤

Southern Blot原理及实验方法Southern Blot原理及实验方法原理：将待检测的DNA分子用/不用限制性内切酶消化后，通过琼脂糖凝胶电泳进行分离，继而将其变性并按其在凝胶中的位置转移到硝酸纤维素薄膜或尼龙膜上，固定后再与同位素或其它标记物标记的DNA或RNA探针进行反应。

如果待检物中含有与探针互补的序列，则二者通过碱基互补的原理进行结合，游离探针洗涤后用自显影或其它合适的技术进行检测，从而显示出待检的片段及其相对大小。

用途：检测样品中的DNA及其含量，了解基因的状态, 如是否有点突变、扩增重排等。

试剂和器材一、试剂变性液：1.5mol/L NaCl，0.5mol/L NaOH。

中和液：0.5mol/L Tris-HCl (pH=7.5)，1.5mol/L NaCl。

20×SSC：3mol/L NaCl，0.3mol/L 柠檬酸钠。

以上溶液均在100Kpa灭菌20分钟。

2×SSC：用无菌移液管吸取20×SSC溶液5mL，加无菌水45mL。

6×SSC：用无菌移液管吸取20×SSC溶液15mL，加无菌水75mL。

二、器材22cm×15cm瓷盘操作方法1. 在琼脂糖凝胶上电泳分离DNA。

取出凝胶，切去边缘多于部分，EB染色，在紫外灯下照相（放一标尺，可从像片中读出DNA迁移的距离）。

2. 将凝胶置于200mL变性液中，浸泡45分钟，并温和地不断振荡，使凝胶上的ds-DNA转变为ss-DNA，然后用重蒸水冲洗凝胶几次。

3. 用中和液浸泡凝胶并不断地振荡45分钟，将凝胶中和至中性。

防止凝胶的碱性破坏硝酸纤维膜。

4. 取一个瓷盘，在底部放一块玻璃板（或一块海绵）使盛器内的20倍SSC转移滤液低于玻板表面，在玻板表面盖一张3mm的二号滤纸，滤纸两边浸没于20倍SSC溶液中，在玻璃和滤纸之间，赶掉所有的气泡。

5. 把凝胶底面朝上放在滤纸上，赶走两层之间出现的气泡。

SOUTHERNBLOTTING实验操作流程

SOUTHERN BLOTTING实验操作流程A.小麦基因组DNA的提取1)采集5g鲜嫩的小麦幼苗，将其剪成2cm左右的片段，用液氮冷冻后在研钵中将其研成粉末（研磨15min左右）。

2)将研磨好的样品转移到预冷的50ml离心管中，加入20ml预热的S buffer，颠倒混匀。

S Buffer成分100mM Tris.Cl pH8.5100mM NaCl50mM EDTA pH8.02％SDS3)于65℃水浴锅中温育1-2h，并不时轻柔混匀。

4)加入20ml（等体积的）酚/氯仿，轻柔地颠倒混匀，直至呈乳状（注意：保证混匀。

为有效除去蛋白，此步可以重复）。

5)用水平转子离心机以2000rpm的转速离心20-30min。

6)加入等体积的氯仿，轻柔地颠倒混匀，2000rpm离心20min。

7)转移上清到1个灭菌的50ml离心管中，加入0.6倍体积的异丙醇，颠倒混匀，室温放置一段时间，用玻璃勾将DNA钩出。

8)用70％的乙醇清洗DNA 2-3次后，将其挑在玻璃钩上晾干，然后溶解在5ml 1×TE中。

9)待DNA完全溶解后接入10μl RNase，于37℃恒温箱中温育1h。

10)加入等体积的酚/氯仿，轻柔颠倒混匀，以2000rpm的转速离心15min。

11)转移上清至1个灭菌的离心管中，加入等体积的氯仿，混匀，以2000rpm的转速离心15min。

12)转移上清至1个灭菌的离心管中，加入1/10 体积3M pH 5.0的乙酸钠（终浓度为0.3M），混匀后再加入2倍体积95％的乙醇，混匀。

13)用玻璃勾将DNA钩出，然后用70％的乙醇清洗2-3次，晾干后加入1.8-2ml 1×TE溶解。

14)待DNA完全溶解后，取1μL DNA电泳，检测DNA的浓度和完整性。

15)DNA样品可以放在4℃保存备用。

B.小麦基因组DNA的酶切1）通常情况下采用下列酶进行谷类作物DNA分析。

识别6碱基序列的酶识别4碱基序列的酶Apa I Hind III Bam HI Alu I Mbo I Hha ISal I Bgl I Sst I Dde I Msp I Taq IDra I Pvu II Eco RV Hae III Rsa I Hinf IEco RI Xba I2）如果一次酶切DNA的量在10μg左右，一般采用30μL反应体系。

Southern Blot操作流程

Southern Blot 操作流程1、哺乳动物基因组DNA 的提取（或用OMEGA 试剂盒E.Z.N.A.TM Tissue DNA Kit ） 1、取约30mg 样品，加入600 ul SNET ，再加入12 ul （20.2mg/ml ）的蛋白酶K ，使蛋白酶K 的终浓度为400ug/ml ； 2、 55℃振荡过夜；3、加入0.6 ul RNaseA ，室温下孵育10 min ，后置于65℃ 10 min ；4、加入300 ul Tris 饱和酚，288 ul 氯仿和12 ul 异戊醇，室温下振荡30 min ；5、 17,000 g 离心5min ，转移上层水相（600 ul ）至一新的离心管；6、加入等体积（600 ul ）的异丙醇沉淀DNA ，于4℃下13,250 g 离心15 min ；7、小心除去异丙醇，加入1 ml 70%的乙醇。

离心5 min 后除去乙醇，室温下干燥15~20 min ；8、加入100 ul TE ，使核酸沉淀溶解。

一、酶切1、拷贝数的计算哺乳动物基因组全长3.0×109个碱基对，按插入基因单拷贝计算如下：()gplasmidof mass bpbp DNA of Insertionμ10100.39=⨯2、酶切体系基因组DNA 10 ug 10*Buffer 10 ul 酶(10U/ul) 10 ul Total100 ul3、混合后置于适宜酶切温度进行酶切反应；4、对酶切产物进行纯化，用30 ul TE 洗脱；5、制备1%浓度的琼脂糖凝胶（不加EB ）；6、将纯化后的酶切产物敞开盖子于70℃放置15 min ，以除尽残留乙醇和消除酶切后产生的粘性末端；7、电泳：1v/cm。

二、转膜1、碱变性：把胶条转移到含碱变性液的器皿中，摇床处理15 min；重复一次；2、中和：倒出器皿中的碱变性液，加入中和液，摇床处理15 min；重复一次；3、倒出中和液，加入20×SSC，摇床处理15 min；4、转膜：1）在一干净的容器中放入一包吸水纸，倒入20×SSC，浸湿；2）放上一张与胶条大小相当的sigma 3M滤纸，倒上一层20×SSC，防止产生气泡；3）将预先剪裁好的尼龙膜放入ddH2O中充分浸润2分钟；4）小心把胶条铺在滤纸上面，用玻璃棒擀平，赶走气泡；5）往胶上倒上一层20×SSC，将尼龙膜铺在胶条上，再向上倒上一层20×SSC；6）再放上一张与胶条大小相当的sigma 3M滤纸；7）用保鲜膜把胶条四周封上，在上面压上一包吸水纸，再用一个约250mg的物体压在吸水纸上面；8）转膜过夜；5、固定将膜放在用10×SSC浸湿的滤纸上面，使含DNA面朝上，放入紫外交联仪中，以1.5J，254n，2.5min的程序将DNA固定在尼龙膜上。

Southern Blot原理及实验方法

Southern Blot原理及实验方法原理：将待检测的DNA分子用/不用限制性内切酶消化后，通过琼脂糖凝胶电泳进行分离，继而将其变性并按其在凝胶中的位置转移到硝酸纤维素薄膜或尼龙膜上，固定后再与同位素或其它标记物标记的DNA或RNA探针进行反应。

如果待检物中含有与探针互补的序列，则二者通过碱基互补的原理进行结合，游离探针洗涤后用自显影或其它合适的技术进行检测，从而显示出待检的片段及其相对大小。

用途：检测样品中的DNA及其含量，了解基因的状态, 如是否有点突变、扩增重排等。

试剂和器材一、试剂变性液：1.5mol/L NaCl，0.5mol/L NaOH。

中和液：0.5mol/L Tris-HCl (pH=7.0)，1.5mol/L NaCl。

20×SSC：3mol/L NaCl，0.3mol/L 柠檬酸钠。

以上溶液均在100Kpa灭菌20分钟。

2×SSC：用无菌移液管吸取20×SSC溶液5mL，加无菌水45mL。

6×SSC：用无菌移液管吸取20×SSC溶液15mL，加无菌水75mL。

二、器材22cm×15cm瓷盘操作方法1. 在琼脂糖凝胶上电泳分离DNA。

取出凝胶，切去边缘多于部分，EB染色，在紫外灯下照相（放一标尺，可从像片中读出DNA迁移的距离）。

2. 将凝胶置于200mL变性液中，浸泡45分钟，并温和地不断振荡，使凝胶上的ds-DNA转变为ss-DNA，然后用重蒸水冲洗凝胶几次。

3. 用中和液浸泡凝胶并不断地振荡45分钟，将凝胶中和至中性。

防止凝胶的碱性破坏硝酸纤维膜。

4. 取一个瓷盘，在底部放一块玻璃板（或一块海绵）使盛器内的20倍SSC转移滤液低于玻板表面，在玻板表面盖一张3mm的二号滤纸，滤纸两边浸没于20倍SSC溶液中，在玻璃和滤纸之间，赶掉所有的气泡。

5. 把凝胶底面朝上放在滤纸上，赶走两层之间出现的气泡。

6. 裁剪一张硝酸纤维膜，其长与宽大于凝胶1—2mm，并在角上作记号，以确定滤膜方位。

Southernblot(自总结2)

Southern blot （J 版）1. 提取植物总DNA (CTAB法)试剂：1) 2×CTAB提取缓冲液（低于15℃会析出，加入材料前先65℃预热）0.1 mol/L Tris-Cl (pH 8.0)1.4 mol/L NaCl20 mmol/L EDTA (pH 8.0)20 g/L CTAB （2%）20g/L PVP-40（2%）使用前加入2% (体积比) 的巯基乙醇。

步骤：1)提取前将植物材料在暗处放置24小时，以降低材料的淀粉含量。

2)剪取大约1g 叶片，置于研钵中，倒入液氮研成粉末（一定研磨细致，非常重要），分装入2ml离心管中（样品约占0.5ml的体积），每管加入900ul CTAB提取缓冲液，温和彻底的混匀，静置，使裂解彻底。

3)65℃水浴保温1-1.5小时。

4)冷至室温后加900ul 酚：氯仿：异戊醇（25：24：1），充分温和混匀直到叶片粉末由绿转白（水相，酚相混匀成乳状液）。

5)室温下13,000 rpm离心10 min，吸取上层水相。

6)取上清（约900ul）再用等体积的氯仿：异戊醇 (24：1)再抽提一次。

13,000 rpm离心10min。

7)取上层水相（约700ul），加入2倍体积无水乙醇沉淀DNA。

小心倒出每管中液体，将絮状DNA沉淀收集到一个新的 1.5ml EP管中（同一个样品）。

8)用70%乙醇洗涤沉淀3-5次，每次将沉淀适当浸泡以充分洗涤，最后一次稍加离心，将洗涤液尽量去除干净，通风橱中晾干约10min左右（不要过分干燥）。

9)加200ul灭菌的去离子水（或者TE），并加入2ul Rnase A（10mg/ml），37℃保温30-60min溶解沉淀，充分混匀，并消化RNA。

（可直接到第11步）10)（可省步骤）如需做此步骤，则上步中需用700ul ddH2O溶解沉淀，37℃保温消化RNA后再用等体积氯仿：异戊醇 (24：1)抽提，并离心，取上清。

Southern Blot原理及实验方法

Southern Blot原理及实验方法原理：将待检测的DNA分子用/不用限制性内切酶消化后，通过琼脂糖凝胶电泳进行分离，继而将其变性并按其在凝胶中的位置转移到硝酸纤维素薄膜或尼龙膜上，固定后再与同位素或其它标记物标记的DNA或RNA探针进行反应。

如果待检物中含有与探针互补的序列，则二者通过碱基互补的原理进行结合，游离探针洗涤后用自显影或其它合适的技术进行检测，从而显示出待检的片段及其相对大小。

用途：检测样品中的DNA及其含量，了解基因的状态, 如是否有点突变、扩增重排等。

试剂和器材一、试剂变性液：1.5mol/L NaCl，0.5mol/L NaOH。

中和液：0.5mol/L Tris-HCl (pH=7.0)，1.5mol/L NaCl。

20×SSC：3mol/L NaCl，0.3mol/L 柠檬酸钠。

以上溶液均在100Kpa灭菌20分钟。

2×SSC：用无菌移液管吸取20×SSC溶液5mL，加无菌水45mL。

6×SSC：用无菌移液管吸取20×SSC溶液15mL，加无菌水75mL。

二、器材22cm×15cm瓷盘操作方法1. 在琼脂糖凝胶上电泳分离DNA。

取出凝胶，切去边缘多于部分，EB染色，在紫外灯下照相（放一标尺，可从像片中读出DNA迁移的距离）。

2. 将凝胶置于200mL变性液中，浸泡45分钟，并温和地不断振荡，使凝胶上的ds-DNA转变为ss-DNA，然后用重蒸水冲洗凝胶几次。

3. 用中和液浸泡凝胶并不断地振荡45分钟，将凝胶中和至中性。

防止凝胶的碱性破坏硝酸纤维膜。

4. 取一个瓷盘，在底部放一块玻璃板（或一块海绵）使盛器内的20倍SSC转移滤液低于玻板表面，在玻板表面盖一张3mm的二号滤纸，滤纸两边浸没于20倍SSC溶液中，在玻璃和滤纸之间，赶掉所有的气泡。

5. 把凝胶底面朝上放在滤纸上，赶走两层之间出现的气泡。

6. 裁剪一张硝酸纤维膜，其长与宽大于凝胶1—2mm，并在角上作记号，以确定滤膜方位。

southern bolt 步骤

southern blot是一种分子生物学技术，用于检测特定DNA序列在样本中的存在和数量。

以下是southern blot的步骤概括：
DNA提取：从样本中提取DNA，通常使用酚/氯仿/异戊醇法或柱层析法等方法。

DNA纯化：将提取的DNA进行纯化，去除杂质和其他分子。

DNA片段化：将纯化的DNA片段化成一定大小的片段，通常使用限制性内切酶（如EcoRI、BamHI等）进行切割。

凝胶电泳：将DNA片段进行凝胶电泳分离，使DNA片段按大小分开。

转膜：将凝胶上的DNA片段转移到NC膜上，可以使用毛细作用或真空转移的方法。

杂交：将标记的探针与NC膜上的DNA片段进行杂交，使特异的DNA序列被标记。

洗膜：去除未结合的探针，只留下特异的DNA序列与探针结合的部分。

检测：通过检测标记的探针来检测特异的DNA序列是否存在以及其数量。

以上步骤完成后，就可以得到southern blot的结果，并可以对结果进行分析和解读。

southern 印迹法

实验七Southern印迹法[目的]１．熟悉Southern 印迹法的基本操作方法和主要步骤的工作原理。

２．了解Southern印迹的意义。

[原理]Southern印迹法(Southern Blot)是将基因组 DNA经限制性内切酶酶解、琼脂糖凝胶电泳分离，使DNA片段按分子量大小排列在琼脂糖凝胶上；经碱处理凝胶使DNA变性(使双链DNA变成单链)，通过具有一定盐离子浓度溶液的虹吸作用，将凝胶中变性的单链DNA片段原位地吸印到硝酸纤维素滤膜或尼龙膜上；•经过干燥或紫外线照射处理，单链DNA片段的极性基团与支持膜上的基团结合而使DNA分子牢固地固定到转移膜上；转移后的单链DNA 分子与32P或35S标记的DNA探针按互补原理进行杂交；经放射自显影对特定位置上显现的特异DNA片段进行分析。

这种方法最初是由Southern于1975年建立的。

方法中DNA转移的方式和复印的过程一样，比较准确地保持了特异DNA顺序在电泳图谱中的位置（也可将变性的凝胶负压干燥后与特定的DNA探针进行原位杂交）。

它把电泳分离和杂交结合起来，不但能检测出特异的DNA序列片段，而且能进行定位和测定分子量。

即先以电泳后照相记录的已知分子量的DNA片段(常用Hind Ⅲ或EcoRⅠ降解的λDNA)为标准，精确测量各标准片段与电泳原点之间的距离。

以DNA的Log10kb为纵坐标，移动距离(cm)为横坐标，连接各已知条带相应的点，得到一条标准曲线。

然后测量未知条带(放射自显影后获得的特异片段)的移动动距离，在标准曲线上找出相应的Log10kb值，以此计算出其分子量大小。

[器材与试剂]一、器材1．电热真空干燥箱2．硝酸纤维素滤膜或尼龙膜3．大方瓷盘、带盖方盘、玻璃板4．滤纸、吸水纸、保鲜膜、蜡膜（Parafilm）、一次性手套等5．刀片、刻度吸管、镊子、剪刀、lkg重物二、材料电泳分离DNA的琼脂糖凝胶三、试剂1．酸变性液:0.25mol/L HCl，用分析纯的盐酸（12Mol/L）稀释2．碱变性液：0.5mol/L NaOH， 1.5mol/l NaCl（pH13.1）3．中和液：0.5mol/L Tris·HCl(pH7.5),1.5mol/L NaCl4．20×SSC: 0.3mol/Ｌ柠檬酸，3mol/L NaCl,pH7.0(配方见附录)5．10×SSC和2×SSC：用双蒸馏水稀释20×SSC储存液[实验步骤]注意：操作戴手套！1．凝胶处理:1)凝胶照像后，切去包括标记带在内的多余部分，将凝胶的一角(•点第一个样品的一侧)切去作为标记，以便于定位。

southern blot的中文操作步骤

一. 地高锌-DNA 标记1. 用51-4全长质粒做模板,用BspQ I 和Sca I双酶切,NEBBuffer：10 μLBspQ I： 3 μLSca I ： 2 μL质粒：60ul水：25μL100μL体系先放于37℃的培养箱10小时,然后于50℃水浴, BspQ I作用的温度为50℃, Sca I作用温度为37℃.2.胶回收全长片段(3.2kb)1．100μL酶切产物加loading buffer全上样，电泳后回收3000bp左右的片段。

2．称重加入3倍体积的QG（1g/3mL），50℃水浴10min融胶,其间颠倒2-3次。

3．将液体转移至柱子，13000rpm/min 1min，弃滤液。

4．加入500μLQG，13000rpm/min 1min，弃滤液。

(去除痕量的融胶)5．加入750μL PE，静置5min，13000rpm/min 1-2min.6．13000rpm/min空离2min7．置一新EP管上，加入40μL ddH2O，静置10min，13000rpm/min 1min，收集滤液备用。

用2ul测OD值.(51-4含量:0.28ug /ul)3. 探针反应用H2O 或Tris buffer溶解模板(胶回收的51-4),不能用TE,因为EDTA会抑制探针反应.步骤:1.取4ul 51-4胶回收产物,加双蒸水至16 ul.2. 100℃沸水中放置10min变性,冰上骤冷.3. 混匀DIG-High prime,取4ul DIG-High prime加到上述变性DNA溶液中,混匀,短暂离心,37℃孵化20小时4. 65℃水浴10min二.标记效率的检测1.倍比稀释探针探针反应后的探针量为23000ng .1000ng 模板→20h →probe 2300ng/20ul≈100ng/ul①第一次稀释：10ul probe①加入90ul DNA dilution buffer(10ng/ul)②第二次稀释：5ul ②加入45ul dilution buffer (1ng/ul)③第三次稀释：(2) Control DNA (5ng/ul)的倍比稀释吸取5 ul Control DNA (5ng/ul)加入20 ul的DNA dilution buffer(1 ng/ul)2.点膜(1)取1 ul Control DNA D2-D8点于尼龙膜上,与其相平行的一排点上地高辛标记的DNA D2-D8,最后各点一个dilution buffer.如下图所示.O O O O O O O O ControlO O O O O O O O DigD2 D3 D4 D5 D6 D7 D8 dilution buffer将尼龙膜放于滤纸上,在其上再放一张等大的滤纸,于80℃烤箱烘烤2 hour.拿出于室温放置.(2)将膜转移到含有20ml washing buffer的封口袋中,室温振摇2min,弃尽washingbuffer(3)加10 ml 1XBlocking solution振摇孵育30 min, 弃尽Blocking solution(4)加10 ml 稀释了104倍的antibody solution振摇孵育30 min,弃antibody solution(5)加10 ml 1Xwashing buffer 洗膜两次,2X15 min,弃washing buffer(6)加10 ml 1Xdetection buffer振摇平衡2-5 min(7)将膜取出放入有双层薄膜的一层薄膜上,加约4滴的CSPD ready-to-use 横跨尼龙膜表面,将袋子的第二层膜盖在含探针DNA的一层薄膜上,尽量不能有气泡.(8)室温孵育5 min(吸尽过量的液体,将薄膜四边封口)(9)37℃孵育10 min(10)进入暗室,压膜一定时间,把压好的片子先放于以1:9稀释好的100 ml的显影液中显影5 min左右,拿出来放入定影液中定影5 min左右,用水冲洗干净,白光下照相.3.探针结果分析A.D6的荧光强度为理想的标记DNA,如:DNA样品按上述方法稀释的,实际上含有20ng/ul标记探针.B.D5 出现荧光,是足量的标记DNA,如: DNA样品按上述方法稀释的,实际上约含有7 ng/ul标记探针C.D4出现荧光,标记DNA不够(确定DNA探针量后再进行下一步)D.计算出探针浓度后看需要多少的探针溶液来杂交,如:D6做探针时,每ml杂交buffer用1.25ul的20ng/ul DNA探针溶液在Southern blot检测DNA,D5做探针时,每ml杂交buffer用3.75ul的7 ng/ul DNA探针溶液(25 ngDNA 探针) 在Southernblot检测DNA,D4不能当探针,重做一个.三. 探针杂交southern blot DNA探针的杂交流程在琼脂糖上分离DNA样品条带(30min-2h)↓转移DNA到尼龙膜上(southern blot)A.脱嘌呤和变性DNA(1h)B.用毛细管转移DNA到尼龙膜上(过夜)C.烘烤固定DNA(30 min-2h)↓用DIG-Easy Hyh进行预杂交(30 min)↓DIG-labeled DNA与DNA进行杂交A.孵育标记了DNA探针的尼龙膜(4-16h)B.洗膜,将未杂交的探针洗掉(45 min)1.DNA的电泳分离(1)用TBE配置一块琼脂糖凝胶,胶越薄越好.(注:为了得到理想结果,在胶里不能放EB染色或跑过的buffer,(Ethidium)乙啡啶,假如电泳条带跑的不够长可能会引起背景不均匀的问题. (2)点上少量目的DNA,一般地,目的DNA的浓度要低,如:每个泳道点2.5-5ug人类基因组DNA 或假如基因组比人类DNA还复杂的,每个泳道就跑10ug以上或每个泳道跑<1ng的质粒DNA (3)点上分子量的Marker,相应的每泳道点上5ul的DIG-labeled DNA Marker.(注:需要量依赖于杂交产量,确保点的Marker量足够显示出样品同样位置的条带.(4)跑胶直到DNA分离的很好,用30-50V电压跑胶大约5h左右.(5)为了评价目的DNA 的质量,以0.25-0.5ug/ml EB染色,在紫外灯下成像.(15-30 min)2.把DNA转移到尼龙膜上1).凝胶里变性DNA:用变性溶液(0.5M NaOH,1.5M NaCI)浸没凝胶2X15 min,室温温和振摇,之间用无菌双蒸水冲洗凝胶.2).中和:用中和液(0.5M Tris-HCI,PH 7.5;1.5M NaCI )室温浸没凝胶振摇2X15 min ，之间用无菌双蒸水冲洗凝胶3).用20XSSC平衡凝胶,振摇至少10 min4).按照下述进行blot,避免产生气泡:●放一张已经沾有20XSSC溶液的Whatman 3 MM纸于桥上,然后往槽里放20XSSC●把凝胶放在浸湿了的Whatman 3 MM纸上,用无菌吸管在凝胶与纸之间吸走所有气泡●剪一块与凝胶大小的尼龙膜●放这张膜于含有DNA的凝胶上,按上述方法用移液器消除气泡●然后再加上一层Whatman 3 MM纸,一叠纸巾,一快玻璃板和一个重200-500g的重物,完成印记转移的三明治模式.5).印记过夜在20XSSC溶液里转移，如图示(5cm)封口膜或X片20×SSC6).当印记还湿润时,用下面方法固定DNA到印记上●用2XSSC(不含SDS)简单冲洗膜●在80℃烘考此膜1h.7).膜可继续下面实验或者保存干燥印记(用两张Whatman 3 MM纸包裹密封)4℃保存.3.用DIG easy Hyb进行印记杂交1．杂交●注意：在任何时候都不要让膜干燥。

Southern_blot实验方法与步骤

实验名称： Southern blot一、实验目的1．学习核酸杂交的基本过程和操作。

二、实验原理将待检测的DNA分子用限制性内切酶消化后，通过琼脂糖凝胶电泳进行分离，继而将其变性并按其在凝胶中的位置转移到硝酸纤维素薄膜或尼龙膜上，固定后再与同位素或其它标记物标记的DNA或RNA探针进行反应。

如果待检物中含有与探针互补的序列，则二者通过碱基互补的原理进行结合，游离探针洗涤后用自显影或其它合适的技术进行检测，从而显示出待检的片段及其相对大小。

用途：检测样品中的DNA及其含量，了解基因的状态, 如是否有点突变、扩增重排等。

三、试剂与仪器（一）器材：糖瓷盘，台式离心机，恒温水浴锅，电泳仪，水平电泳槽，杂交炉，杂交袋，尼龙膜或硝酸纤维素膜，转印迹装置，滤纸，吸水纸，紫外交联仪，摇床，X线胶片。

（二）试剂：限制性内切酶，DNA加样缓冲液，DNA Ladder Marker，0.25M HCl变性液（0.5M NaOH，1.5M NaCl）中和液（0.5M Tris- HCl PH7.5，3M NaCl）,转印迹液SSC（3M NaCl，0.3M柠檬酸钠，PH7.0）标记探针，20×SSC，预杂交液和杂交液，2×洗液（2×SSC,0.1%SDS）2×洗液(0.5×SSC,0.1%SDS)1×缓冲洗液（0.1M马来酸0.15M NaCl ,PH7.5,0.3%Tween20）1×封阻液[1％(W/V)封阻剂溶于]1×马来酸溶液（0.1M马来酸，0.15M NaCl ,PH7.51×检测液（0.1M Tris- HCl,0.1M NaCl,PH7.5）抗－地高辛－碱性磷酸酶。

四、实验步骤1、制备DNA分子（PCR）2.琼脂糖凝胶电泳分离DNA3电泳结束后，将胶小心从电泳槽中取出，用手术刀将胶中没有DNA样品的四周部分略做修剪，然后将胶放入0.25 N HCl中脱嘌呤，当胶中的溴酚蓝变为黄色取出4将胶从HCl溶液中取出，用ddH2O涮洗两次，然后放入碱变性液（0.5 M NaOH）中处理45 min，使胶中的ds-DNA变为SS-DNA。

Southern blot实验报告

医学分子生物学实验技术实验报告实验名称： Southern blot一、实验目的1．学习核酸杂交的基本过程和操作。

二、实验原理1. Southern blot实验原理根据DNA变性和复性发展的一种实验技术，就是分子杂交（hybridization)。

指两条来源不同但具有同源性的核酸单链在一定条件下，根据碱基互补的原则缔结成双链分子。

Southern杂交是指一种利用标记的探针与膜上靶DNA片段进行杂交的技术，检测靶DNA片段中是否存在与探针同源的序列。

其主要步骤包括：⑴基因组DNA的限制性酶切；⑵DNA 酶切片段的电泳分离和转移；⑶杂交及检测。

三、实验步骤1、基因组DNA的限制性内切酶酶切1.1按如下方案进行基因组的酶切HL60基因组DNA 10 mg 5 ul10×Buffer E 2 ulEcoR I（10 u/ml） 2 ulddH20 11ul总体积 20 ul37℃保温1.5小时。

2、电泳分离2.1保温期间，浇一块凝胶板：称0.6g琼脂糖加60ml1xTAE，微波炉低火加热1分钟，让琼脂糖完全溶解，稍微冷却后，加6 ulGelRed，浇在封好的并已插上梳子的凝胶板上，移去气泡，室温放置40分钟以上。

2.2 DNA酶切后加1/5体积6x加样缓冲液。

2.3 取阳性对照10ul，含c-myc 4.7 kb线性片段300pg，加1/5体积6x加样缓冲液。

2.4取基因组DNA10ug，加ddH2O至10 ul，加1/5体积6x加样缓冲液。

同时去自己抽提的基因组DNA20ul，加1/5体积6x加样缓冲液。

2.5将凝胶放入电泳槽中，加入1xTAE，直到液面高出凝胶1mm，将以上各样品小心加入样品槽中，两组共用一块凝胶，共7个样，从左至右依次为：1未酶切自己基因组，2未酶切老师基因组，3 酶切老师基因组，4阳性对照（4.8kb线性c-myc），5酶切老师基因组，6未酶切老师基因组，7未酶切自己基因组。

Southern-Blotting

Southern Blotting方案8 Southern印迹：毛细管法将DNA转移到膜上DNA的消化及电泳：1. 用一种或几种限制性内切核酸酶消化适当数量的DNA2. 如果需要，消化结束后用乙醇沉淀浓缩DNA片段。

将DNA溶解于约25 ul TE（pH8.0）中。

(加样于凝胶前，需确信DNA溶液中的乙醇已被完全出去。

通常在一个开口的管子里将溶解有DNA的溶液加热至70℃可以充分除去残余的乙醇。

这种处理也破坏了限制性片段的黏性末端直接的碱基对。

)3. 定量DNA浓度。

将适量的消化产物转移到新的微量离心管中。

先取5ul样品，用加有EB的0.7%的胶检测消化程度，如果消化完全，则给样品中加入0.15被体积的蔗糖上样缓冲液，通过琼脂糖凝胶电泳分离DNA片段（对于大部分基因组DNA，可以使用1×TAE或0.5×TBE配置的0.7的凝胶，不含EB。

）对凝胶加一较低的电压（约小于1V/ cm），使DNA以较慢的速率迁移。

（如果消化后的DNA保存于4℃，在加样前需要加热至56℃2～3min。

这种加热处理可以破坏突出的黏性末端可能形成的任何碱基对。

有时，由于DNA溶液不能沉降到加样孔的底部也会引起问题。

为了减少这种问题，首先要确信DNA分散均匀，然后再将样品缓缓加入点样孔。

加样后，静置凝胶数分钟，以便DNA 在加样孔中充分扩散。

）4. 电泳充分后，进行照相。

在凝胶一侧放置一把透明荧光吃以便从照片上直接读出每一DNA条带迁移的距离。

（如果需要，在进行DNA变性以及转移到膜上之前，凝胶可以在这种状态下保存。

用Saran膜将凝胶包好，平放储存于4℃。

由于在保存过程中DNA条带会扩散，因此在进行下一步实验之前，不要将凝胶放置超过一天。

）5. DNA变性，使用下列方法之一将DNA从凝胶上转移到NC膜或者中性或带电荷的尼龙膜上。

准备用于转移的凝胶：6. 电泳分离DNA之后，将凝胶转移到玻璃烤盘中。

用剃须刀片修去凝胶边缘无用的部分，包括加样孔上方的凝胶。

生物化学实验southwestern blotting实验步骤

生物化学实验southwestern blotting
实验步骤
Southwestern blotting 是一种用于检测蛋白质与 DNA 相互作用的技术，以下是该实验的基本步骤：
1. 制备 DNA 探针：选择你感兴趣的 DNA 片段，并使用放射性同位素（通常是 32P）或荧光标记对其进行标记。

2. 制备蛋白质样品：将待检测的蛋白质样品进行聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分离，并通过电转移将蛋白质转移到硝酸纤维素膜或 PVDF 膜上。

3. 膜的预处理：将转移后的膜在Blocking buffer 中孵育，以封闭非特异性结合位点。

4. 杂交：将标记的 DNA 探针与膜上的蛋白质进行杂交。

可以在杂交缓冲液中进行，通常在 42°C 下孵育过夜。

5. 洗膜：在杂交后，用 washing buffer 洗涤膜，以去除未结合的 DNA 探针。

6. 检测：使用放射性自显影或荧光检测方法，检测膜上结合的 DNA 探针。

7. 结果分析：通过观察膜上的杂交信号，确定哪些蛋白质与标记的 DNA 探针发生了相互作用。

需要注意的是，Southwestern blotting 实验步骤可能因具体的实验条件和目的而有所不同。

在进行实验之前，建议仔细阅读相关的实验手册和文献，并根据实际情况进行适当的调整和优化。

Southern-Blot-实验流程(包括原理细节)

Southern Blot 实验流程（包括原理/细节）一、DNA 的提取人和哺乳动物细胞基因组DNA的分离通常是在有EDTA、Sarkosye等一类去污剂存在下，用蛋白酶K消化细胞，随后用酚、氯仿抽提，经RNase 处理和纯化来提取DNA。

(1)取单层细胞，经无钙、镁PBS洗一次，用0.25%胰蛋白酶消化，细胞悬液经PBS洗2次,弃上清，取细胞沉淀。

(2)加入2ml细胞裂解液(10mM Tris HCL，pH8.0，0.1mol/L EDTA，10mmol/L NaCL，1% SDS)充分混匀，加入蛋白酶K 至终浓度为0.5～1g/L、Sarkosye终浓度为0.5%，混匀裂解蛋白呈糊状。

(3)50℃水浴2h，转入37℃水浴过夜，次日加入等体积饱和酚，轻轻颠倒混匀，以防止DN A断裂，约3min。

12000r/min 离心15分钟（室温）(4)取水相，再加入等体积酚/氯仿(1:1),同样颠倒混匀，去除蛋白质12000 r/min 离心15分钟（室温）(5)再重复步骤(4)，再用等体积酚/氯仿(1:1)抽提一次(6)取水相，再加入等体积氯仿，去除酚及蛋白质，颠倒混匀12000 r/min 离心15分钟（室温）(7)取水相，加入2倍体积的预冷无水乙醇，沉淀DNA，混匀-20℃放置1小时12000 r/min 离心15分钟（室温）(8)用70%乙醇洗涤一次，按上法离心将沉淀真空干燥10分钟。

(9)加入RNase A至终浓度100mg/L，37℃水浴消化1小时，消化污染的RNA。

(10)加入蛋白酶K 至终浓度0.4g/L、Sarkosye至终浓度0.5%，混匀，50℃水浴2小时，加入NaAC至终浓度10mmol/L。

(11)用等体积饱和酚各抽提一次，步骤同前。

(12)吸上清，加入氯仿/异戊醇(24:1)，按上法再抽一次。

(13)取水相，加入2倍体积预冷无水乙醇，-20℃1小时。

(14)取沉淀用70%乙醇洗一次，真空干燥10分钟后溶于少量TE中，4℃贮存。

Southern Blot原理及实验方法

Southern Blot原理及实验方法原理：将待检测的DNA分子用/不用限制性内切酶消化后，通过琼脂糖凝胶电泳进行分离，继而将其变性并按其在凝胶中的位置转移到硝酸纤维素薄膜或尼龙膜上，固定后再与同位素或其它标记物标记的DNA或RNA探针进行反应。

如果待检物中含有与探针互补的序列，则二者通过碱基互补的原理进行结合，游离探针洗涤后用自显影或其它合适的技术进行检测，从而显示出待检的片段及其相对大小。

用途：检测样品中的DNA及其含量，了解基因的状态, 如是否有点突变、扩增重排等。

一、试剂变性液：1.5mol/L NaCl，0.5mol/L NaOH。

中和液：0.5mol/L Tris-HCl (pH=7.0)，1.5mol/L NaCl。

20×SSC：3mol/L NaCl，0.3mol/L 柠檬酸钠。

以上溶液均在100Kpa灭菌20分钟。

2×SSC：用无菌移液管吸取20×SSC溶液5mL，加无菌水45mL。

6×SSC：用无菌移液管吸取20×SSC溶液15mL，加无菌水75mL。

二、器材22cm×15cm瓷盘操作方法1. 在琼脂糖凝胶上电泳分离DNA。

取出凝胶，切去边缘多于部分，EB染色，在紫外灯下照相（放一标尺，可从像片中读出DNA迁移的距离）。

2. 将凝胶置于200mL变性液中，浸泡45分钟，并温和地不断振荡，使凝胶上的ds-DNA 转变为ss-DNA，然后用重蒸水冲洗凝胶几次。

3. 用中和液浸泡凝胶并不断地振荡45分钟，将凝胶中和至中性。

防止凝胶的碱性破坏硝酸纤维膜。

4. 取一个瓷盘，在底部放一块玻璃板（或一块海绵）使盛器内的20倍SSC转移滤液低于玻板表面，在玻板表面盖一张3mm的二号滤纸，滤纸两边浸没于20倍SSC溶液中，在玻璃和滤纸之间，赶掉所有的气泡。

5. 把凝胶底面朝上放在滤纸上，赶走两层之间出现的气泡。

6. 裁剪一张硝酸纤维膜，其长与宽大于凝胶1—2mm，并在角上作记号，以确定滤膜方位。

Southern blot实验方法与步骤

•Southern blot实验方法与步骤用于检测重组DNA，也可分析DNA样品中是否有与探针序列同源的DNA片段。

用于基因诊断，也可验证检测片段的分子量大小。

将基因组DNA经限制性内切酶酶切，进行琼脂糖电泳，把分离后定位在凝胶上的不同分子量的DNA经碱变性处理，将凝胶中变性的DNA转移至一固相支持滤膜。

利用标记的某一DNA、RNA或寡核苷酸与固着于滤膜上的DNA发生同源性杂交，利用放射自显影（化学发光法或显色法）检测。

（一）器材：台式离心机，恒温水浴锅，电泳仪，水平电泳槽，杂交炉，杂交袋，尼龙膜或硝酸纤维素膜，转印迹装置，滤纸，吸水纸，紫外交联仪或80℃烤箱，摇床，X线胶片。

（二）试剂：限制性内切酶，DNA加样缓冲液，DNA Ladder Marker，0.25M HCl，变性液（0.5M NaOH，1.5M NaCl），中和液（0.5M Tris- HCl PH7.5，3M NaCl）, 转印迹液20�wSSC （3M NaCl，0.3M柠檬酸钠，PH7.0），标记探针， 2�wSSC，预杂交液和杂交液，2×洗液（2×SSC,0.1%SDS）,0.5×洗液(0.5×SSC,0.1%SDS),1×缓冲洗液（0.1M马来酸，0.15M NaCl ,PH7.5,0.3%Tween20）,1×封阻液[1％(W/V)封阻剂溶于1×马来酸溶液（0.1M马来酸，0.15M NaCl ,PH7.5）]，1×检测液（0.1M Tris- HCl,0.1M NaCl,PH7.5），抗－地高辛－碱性磷酸酶。

注意：若基因组DNA过低，要以较大体积进行限制酶消化，消化完毕后，可以通过乙醇沉淀、浓缩DNA片段，加少量DNA加样缓冲液点样。

2、消化好的样品点样于0.7％琼脂糖凝胶进行电泳；注意：为保证DNA均匀分散于加样孔，应缓慢将样品加至加样孔。

Southern Blot操作步骤及方法

先用30V让样品跑出上样孔，再用50V继续跑，直至溴酚蓝跑至凝胶底部；
4.洗胶
①用SouthernⅠ洗15min，至溴酚蓝完全变成黄色，洗完后快速用去离子水冲洗；（脱嘌呤）
②用SouthernⅡ洗30min，至溴酚蓝完全恢复到原来的蓝色，洗完后快速用去离子水冲洗；（使DNA变性）
用SouthernⅢ洗30min，洗完后快速用去离子水冲洗；
6.紫外交联
转膜结束后拿出尼龙膜（注意标明尼龙膜的正反面，正面为有DNA的一面），待其干后再置于杂交仪中，紫外杂交0.5min。
交联完成后的膜可以在4℃中保存。
7.预杂交
42℃水浴预热杂交液（由7号管配置），再取预杂交液10mL加到杂交管中，注意尽量不要起泡；
将交联后的膜反面贴壁放入杂交管中，拧好管口防止漏液；
地高辛标记探针的制备：
①以烟草总DNA为模板，用探针特异性引物进行PCR扩增，胶回收PCR产物（注意回收的浓度至少在70ng/μL以上）。
②取回收的PCR产物约0.5-1μg，补加ddH2O至8μL；然后沸水浴10min，立即转入冰水混合物中；
③再将其转入分装有2μL DIG-High prime的PCR管中，混匀，微离心，37℃温浴10-20h；
SouthernⅣ洗15min；（中和残留的碱，使DNA析出以便转膜）
5.转膜
将尼龙膜切成11.6×12cm大小，快速在去离子水中浸湿，然后在20×SSC中浸泡15min。
另准备6张11.6×12cm大小的滤纸，一叠同样大小的吸水纸，及一张长条状滤纸。
按如下所示顺序摆放：
注意盐桥与胶，胶与尼龙膜及尼龙膜与滤纸之间不要有气泡，凝胶四周放上Parafilm（膜），防止短路转膜12h以上。
向杂交管中加入1μL抗体，杂交仪中常温杂交30min;

southern blot的中文操作步骤

一. 地高锌-DNA 标记1. 用51-4全长质粒做模板,用BspQ I 和Sca I双酶切,NEBBuffer：10 μLBspQ I： 3 μLSca I ： 2 μL质粒：60ul水：25μL100μL体系先放于37℃的培养箱10小时,然后于50℃水浴, BspQ I作用的温度为50℃, Sca I作用温度为37℃.2.胶回收全长片段(3.2kb)1．100μL酶切产物加loading buffer全上样，电泳后回收3000bp左右的片段。

2．称重加入3倍体积的QG（1g/3mL），50℃水浴10min融胶,其间颠倒2-3次。

3．将液体转移至柱子，13000rpm/min 1min，弃滤液。

4．加入500μLQG，13000rpm/min 1min，弃滤液。

(去除痕量的融胶)5．加入750μL PE，静置5min，13000rpm/min 1-2min.6．13000rpm/min空离2min7．置一新EP管上，加入40μL ddH2O，静置10min，13000rpm/min 1min，收集滤液备用。

用2ul测OD值.(51-4含量:0.28ug /ul)3. 探针反应用H2O 或Tris buffer溶解模板(胶回收的51-4),不能用TE,因为EDTA会抑制探针反应.步骤:1.取4ul 51-4胶回收产物,加双蒸水至16 ul.2. 100℃沸水中放置10min变性,冰上骤冷.3. 混匀DIG-High prime,取4ul DIG-High prime加到上述变性DNA溶液中,混匀,短暂离心,37℃孵化20小时4. 65℃水浴10min二.标记效率的检测1.倍比稀释探针探针反应后的探针量为23000ng .1000ng 模板→20h →probe 2300ng/20ul≈100ng/ul①第一次稀释：10ul probe①加入90ul DNA dilution buffer(10ng/ul)②第二次稀释：5ul ②加入45ul dilution buffer (1ng/ul)③第三次稀释：(2) Control DNA (5ng/ul)的倍比稀释吸取5 ul Control DNA (5ng/ul)加入20 ul的DNA dilution buffer(1 ng/ul)2.点膜(1)取1 ul Control DNA D2-D8点于尼龙膜上,与其相平行的一排点上地高辛标记的DNA D2-D8,最后各点一个dilution buffer.如下图所示.O O O O O O O O ControlO O O O O O O O DigD2 D3 D4 D5 D6 D7 D8 dilution buffer将尼龙膜放于滤纸上,在其上再放一张等大的滤纸,于80℃烤箱烘烤2 hour.拿出于室温放置.(2)将膜转移到含有20ml washing buffer的封口袋中,室温振摇2min,弃尽washingbuffer(3)加10 ml 1XBlocking solution振摇孵育30 min, 弃尽Blocking solution(4)加10 ml 稀释了104倍的antibody solution振摇孵育30 min,弃antibody solution(5)加10 ml 1Xwashing buffer 洗膜两次,2X15 min,弃washing buffer(6)加10 ml 1Xdetection buffer振摇平衡2-5 min(7)将膜取出放入有双层薄膜的一层薄膜上,加约4滴的CSPD ready-to-use 横跨尼龙膜表面,将袋子的第二层膜盖在含探针DNA的一层薄膜上,尽量不能有气泡.(8)室温孵育5 min(吸尽过量的液体,将薄膜四边封口)(9)37℃孵育10 min(10)进入暗室,压膜一定时间,把压好的片子先放于以1:9稀释好的100 ml的显影液中显影5 min左右,拿出来放入定影液中定影5 min左右,用水冲洗干净,白光下照相.3.探针结果分析A.D6的荧光强度为理想的标记DNA,如:DNA样品按上述方法稀释的,实际上含有20ng/ul标记探针.B.D5 出现荧光,是足量的标记DNA,如: DNA样品按上述方法稀释的,实际上约含有7 ng/ul标记探针C.D4出现荧光,标记DNA不够(确定DNA探针量后再进行下一步)D.计算出探针浓度后看需要多少的探针溶液来杂交,如:D6做探针时,每ml杂交buffer用1.25ul的20ng/ul DNA探针溶液在Southern blot检测DNA,D5做探针时,每ml杂交buffer用3.75ul的7 ng/ul DNA探针溶液(25 ngDNA 探针) 在Southernblot检测DNA,D4不能当探针,重做一个.三. 探针杂交southern blot DNA探针的杂交流程在琼脂糖上分离DNA样品条带(30min-2h)↓转移DNA到尼龙膜上(southern blot)A.脱嘌呤和变性DNA(1h)B.用毛细管转移DNA到尼龙膜上(过夜)C.烘烤固定DNA(30 min-2h)↓用DIG-Easy Hyh进行预杂交(30 min)↓DIG-labeled DNA与DNA进行杂交A.孵育标记了DNA探针的尼龙膜(4-16h)B.洗膜,将未杂交的探针洗掉(45 min)1.DNA的电泳分离(1)用TBE配置一块琼脂糖凝胶,胶越薄越好.(注:为了得到理想结果,在胶里不能放EB染色或跑过的buffer,(Ethidium)乙啡啶,假如电泳条带跑的不够长可能会引起背景不均匀的问题. (2)点上少量目的DNA,一般地,目的DNA的浓度要低,如:每个泳道点2.5-5ug人类基因组DNA 或假如基因组比人类DNA还复杂的,每个泳道就跑10ug以上或每个泳道跑<1ng的质粒DNA (3)点上分子量的Marker,相应的每泳道点上5ul的DIG-labeled DNA Marker.(注:需要量依赖于杂交产量,确保点的Marker量足够显示出样品同样位置的条带.(4)跑胶直到DNA分离的很好,用30-50V电压跑胶大约5h左右.(5)为了评价目的DNA 的质量,以0.25-0.5ug/ml EB染色,在紫外灯下成像.(15-30 min)2.把DNA转移到尼龙膜上1).凝胶里变性DNA:用变性溶液(0.5M NaOH,1.5M NaCI)浸没凝胶2X15 min,室温温和振摇,之间用无菌双蒸水冲洗凝胶.2).中和:用中和液(0.5M Tris-HCI,PH 7.5;1.5M NaCI )室温浸没凝胶振摇2X15 min ，之间用无菌双蒸水冲洗凝胶3).用20XSSC平衡凝胶,振摇至少10 min4).按照下述进行blot,避免产生气泡:●放一张已经沾有20XSSC溶液的Whatman 3 MM纸于桥上,然后往槽里放20XSSC●把凝胶放在浸湿了的Whatman 3 MM纸上,用无菌吸管在凝胶与纸之间吸走所有气泡●剪一块与凝胶大小的尼龙膜●放这张膜于含有DNA的凝胶上,按上述方法用移液器消除气泡●然后再加上一层Whatman 3 MM纸,一叠纸巾,一快玻璃板和一个重200-500g的重物,完成印记转移的三明治模式.5).印记过夜在20XSSC溶液里转移，如图示(5cm)封口膜或X片20×SSC6).当印记还湿润时,用下面方法固定DNA到印记上●用2XSSC(不含SDS)简单冲洗膜●在80℃烘考此膜1h.7).膜可继续下面实验或者保存干燥印记(用两张Whatman 3 MM纸包裹密封)4℃保存.3.用DIG easy Hyb进行印记杂交1．杂交●注意：在任何时候都不要让膜干燥。