免疫印迹操作步骤
免疫印迹(immunoblotting)
免疫印迹（immunoblotting）免疫印迹（immunoblotting）又称蛋白质印迹（Western blotting），是根据抗原抗体的特异性结合检测复杂样品中的某种蛋白的方法。
该法是在凝胶电泳和固相免疫测定技术基础上发展起来的一种新的免疫生化技术。
由于免疫印迹具有SDS-PAGE 的高分辨力和固相免疫测定的高特异性和敏感性，现已成为蛋白分析的一种常规技术。
免疫印迹常用于鉴定某种蛋白，并能对蛋白进行定性和半定量分析。
主要实验步骤如下：1.蛋白质抽提a．实验对象为组织样品，取适量（250～500mg）新鲜组织样品或正确保存的组织样品，加1ml含蛋白酶抑制剂的总蛋白抽提试剂（或核蛋白抽提试剂），匀浆后抽提总蛋白（或核蛋白）。
b.实验对象为细胞样品，每份样品取1×106～1×107细胞，PBS清洗细胞，去PBS加0.1ml～1ml含蛋白酶抑制剂的总蛋白抽提试剂（或核蛋白抽提试剂）抽提总蛋白（或核蛋白）。
2.蛋白质定量：按KCTMBCA蛋白质定量试剂盒操作说明操作，测定样品浓度。
3.变性聚丙烯酰胺不连续凝胶电泳(SDS-PAGE)将准备好的样品液和生物素标记的蛋白质分子量标准分别上样，标准加进第一个孔中，电泳分离蛋白。
4.蛋白质转移到硝酸纤维膜或PVDF膜按Bio-Rad蛋白转移装置说明组装滤纸凝胶纤维素夹层，30mA恒流条件下，4°C转移过夜。
5.膜的封闭和抗体孵育a．膜在5％BSA溶液中室温孵育1小时以封闭膜上的非特异结合。
b.封闭过的膜加入一级抗体室温孵育1.5小时，抗原抗体结合。
c.加入HRP标记的二级抗体以结合一级抗体及HRP标记的抗生物素抗体以结合分子量标准，室温孵育膜1小时。
加入HRP标记的GAPDH抗体可同时检测GAPDH含量。
6.结果检测：化学发光法检测，膜与化学发光底物孵育，经X胶片曝光显影。
图片扫描保存为电脑文件，并用ImageJ分析软件将图片上每个特异条带灰度值的数字化。
免疫印迹（WB）实验操作具体步骤及详细说明
免疫印迹（WB）实验操作具体步骤及详细说明免疫印迹（WB）实验操作具体步骤及详细说明一、试剂和溶液转印缓冲液：0.025M Tris base , 0.187 M 甘氨酸, 25%甲醇氨基黑溶液：0.1% 酸性黑10B 1×TBST：25mM Tris-HCl ( pH 8.0 ) , 0.2 M NaCl , 0.1%Tween 20 封闭液：TBST 配制的5%牛奶抗体稀释液：TBST 配制的5%牛奶显色系统：ECL 显色二、实验步骤1.电泳：将裂解液进行SDS-PAGE 电泳，80v，30 分钟，120v，90 分钟；2.转膜：PVDF 膜在甲醇中浸泡约30 秒左右，滤纸浸泡在转印缓冲液预湿，半干法转印到PVDF 膜上，10v，150 分钟；3.染色：氨基黑染色5 分钟，甲醇褪去背景色，观察条带；4.膜活化：将PVDF 膜置于甲醇活化1min，用纯水洗膜2 次后再用TBST 洗涤3 次；5.封闭：将膜条置于5%牛奶或2% BSA 中，室温混摇2h；6.一抗孵育：将待检抗体用3%牛奶或2% BSA 稀释到合适浓度（参照抗体说明书，根据客户预实验结果，稀释度上下浮动一个数量级都为正常），将膜放入对应的已稀释待检样品中，置4℃混摇孵育过夜；7.洗涤：取出膜放在TBST 中洗涤3×5min；8.二抗孵育：将膜取出放入稀释好的HRP 标记的二抗（参照二抗说明书进行稀释）中，室温混摇2h；9.洗涤：取出膜放在TBST 中洗涤3×5min；10.ECL 显色：将膜取出放入混匀的ECL 显色液中，孵育3min，将膜取出贴在有荧光角标的胶片上，迅速用保鲜膜包好；11.曝光：把底片放在暗盒中，根据荧光强度分别对X 光胶片作不同时间段的曝光，曝光结束后，将底片取出，1min 显影，30s 清洗，1min 定影，30s 清洗，晾干；12.结果分析：用扫描仪将曝光后的X 光胶片扫描，做后续结果分析。
免疫印迹实验操作具体步骤及详细说明
免疫印迹实验操作具体步骤及详细说明免疫印迹（Western Blotting，简称WB）是一种常用的分子生物学技术，主要用于检测和鉴定蛋白质的存在以及其在不同样本中的表达水平。
下面将详细介绍WB实验的具体步骤。
1.细胞裂解和蛋白质提取：首先将待检测的组织样本或细胞样本通过离心将其收集，并添加适量的裂解缓冲液。
使用超声波或机械破碎手段将细胞打乱，使蛋白质溶解在裂解缓冲液中。
再通过离心去除细胞碎片和细胞核等。
2.蛋白质浓度测定：根据实验需要，采用BCA法、Lowry法或Bradford法等方法测定蛋白质浓度，以确定后续实验的载体中待加载的蛋白质量。
3.蛋白质电泳：将相同量的蛋白质样品加入SDS-凝胶槽中，进行电泳。
电泳时蛋白质在凝胶中向阴极迁移，分子量小的蛋白质迁移速度较快，分子量大的较慢。
电泳结束后，将凝胶转移到膜上。
4.膜上瞬时染色：在转移至膜上后，可以使用Ponceau S染色或其他瞬时染色方法，以确认蛋白质在膜上的存在和转移效果。
5.阻断：在膜上的蛋白质检测之前，需要对膜进行阻断处理，以防止非特异性结合。
常用的方法是在膜上加入牛血清蛋白或脱脂奶粉的溶液，进行阻断。
6.一抗反应：加入已稀释好的一抗抗体，与目标蛋白质特异性结合。
一抗的选择要根据待检测蛋白的特异性来确定。
7.清洗：一抗反应后，用TBST或PBS等缓冲液进行多次清洗，以去除未结合的一抗抗体。
8.二抗反应：9.清洗：二抗反应后，用TBST或PBS等缓冲液进行多次清洗，以去除未结合的二抗抗体。
10.显色和成像：使用显色剂（如ECL）使膜上的蛋白质发生化学发光反应，然后将膜放入X射线片中，进行曝光。
最后使用化学显影废片机或Gel Doc System等设备进行成像。
11.数据分析：使用专业的成像软件分析成像结果，计算蛋白质的相对表达水平，并与内参蛋白进行比较。
需要注意的是，在进行WB实验的过程中，要严格操作，避免污染和交叉反应的出现。
同时，应根据实验需求选择适当的试剂和抗体，并进行标记、保存和储存等操作。
蛋白质免疫印迹(Western Blot )实验步骤和原理及注意事项
蛋白质免疫印迹（Western Blot ）实验步骤和原理及注意事项1.收集蛋白样品(Protein sample preparation)可以使用适当的裂解液。
收集完蛋白样品后，为确保每个蛋白样品的上样量一致，需要测定每个蛋白样品的蛋白浓度。
根据所使用的裂解液的不同，需要采用适当的蛋白浓度测定方法。
因为不同的蛋白浓度测定方法对于一些去垢剂和还原剂等的兼容性差别很大。
BCA法。
2. 电泳(Electrophoresis)(1) SDS-PAGE凝胶配制(2) 样品处理在收集的蛋白样品中加入适量浓缩的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液。
例如2X或5X的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液。
使用5X的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液可以减小上样体积，在相同体积的上样孔内可以上样更多的蛋白样品。
100℃或沸水浴加热3-5分钟，以充分变性蛋白（根据蛋白分子的大小，煮沸时间可适当变化，一般不低于5min。
煮沸只是变性蛋白，而不是分解，一般加了抑制酶不会分解。
煮沸对于SDS-PAGE凝胶电泳是必须的，只有煮沸,才能消除蛋白质的立体二级结构,伸展为一维线性结构,所以一般来讲二聚体都会解体,才能完全按照分子量跑电泳,加的蛋白Marker才有指示分子量的意义。
蛋白样品变性后与SDS充分结合，SDS使每个氨基酸带相同的电荷,使整个蛋白呈线性结构. 抗体因为要是线性表位结合的，100度煮10min 后13000,离心5分钟,取上清电泳,因为沉淀会导致拖尾.也可以取上清到另一管,4度可以放一周备再次电泳）。
(3)电泳i.清洗玻璃板：一只手扣紧玻璃板，另一只手蘸点洗衣粉轻轻擦洗。
两面都擦洗过后用自来水冲，再用蒸馏水冲洗干净后立在筐里晾干。
ii.灌胶与上样（1）玻璃板对齐后放入夹中卡紧。
然后垂直卡在架子上准备灌胶。
（操作时要使两玻璃对齐，以免漏胶。
）（2）配10%分离胶，加入TEMED后立即摇匀即可灌胶。
灌胶时，可用10 ml枪吸取5 ml胶沿玻璃放出，待胶面升到绿带中间线高度时即可。
免疫印迹分析流程
免疫印迹分析流程
免疫印迹分析(Western Blot)是一种常用的蛋白质分析方法。
它的基本流程包括:
1. 样品制备:提取并定量蛋白质样本。
常用的方法有细胞裂解、组织匀浆等。
2. 电泳分离蛋白:使用SDS-PAGE凝胶电泳分离蛋白质。
根据分子量的不同,蛋白质会在凝胶上分离成不同的条带。
3. 转膜:将凝胶中的蛋白转移到NC膜或PVDF膜上。
4. 滤膜:使用5%脱脂奶粉或BSA在室温封闭1小时,以阻断膜胶的非特异性结合位点。
5. 一抗反应:加入特异性的一抗,孵育过夜。
一抗与目标蛋白特异性结合。
6. 二抗反应:洗涤后加入连接HRP的二抗,孵育1-2小时。
二抗与一抗结合。
7. ECL显色:滴加显影液,HRP催化发光底物氧化产生发光信号。
8. 凝胶成像:曝光、扫描和记录结果。
目标蛋白会出现特异性的条带。
9. 数据分析:通过条带的位置和强度分析目标蛋白的相对分子量和表达量。
以上是免疫印迹分析的基本流程。
根据实验目的,可以选择不同的样品制备方法、凝胶系统、转膜系统等,从而实现对蛋白质的分离、定量和功能分析。
免疫印迹(Western blot)法标准操作规程
免疫印迹（Western blot）法标准操作规程
一、适用范围
适用于实验室从事免疫印迹实验的实验技术人员和研究生。
二、操作规程
1、所需试剂：30%的储备胶溶液，1M Tris-HCl pH8.0，1.5M Tris-HCl PH6.8，10%SDS 溶液，TEMED，10% APS溶液，10X电泳缓冲液，2X SDS电泳上样缓冲液，考马斯亮蓝染色液，脱色液，转膜缓冲液（TBS），0.01M PBS，丽春红染液，封闭液（5%的脱脂奶粉TBS），相应的一抗、二抗等。
2、规程：
1）SDS-PAGE电泳规程见SDS-PAGE SOP
2）电泳结束后将胶条割至合适大小，用转膜缓冲液平衡，3次×5min。
3）膜处理：预先裁好与胶条同样大小的滤纸和NC膜，浸入转膜缓冲液中，10min。
4）转膜：转膜装置从下至上依次按阳极（+）碳板、滤纸、NC膜、凝胶、滤纸、阴极（—）碳板的顺序放好，滤纸、凝胶、NC膜精确对齐，每一步去除气泡，装入电泳转移槽中，接通电源，恒流1mA/cm2，转移1.5hr或18V过夜，转移结束后，断开电源将膜取出，割取待测膜条做免疫印迹。
3）封闭：将膜转入一容器中加入封闭液，于摇床上室温振荡2H；
4）加入一抗：弃去封闭液，用0.01M PBS洗膜，5min×3次，按合适稀释比例加入一抗，液体必须覆盖膜的全部，4℃过夜。
5）洗膜：取出NC膜，用PBS洗膜，3次×5min；
6）加入二抗：加入适当比例二抗，于摇床上室温振荡2h；
7）曝光、显影：用PBS洗膜，3次×5min，配制显色液（按说明书要求），将膜浸入其中片刻后压片，通过曝光时间的长短调节蛋白条带的亮度和背景的强弱。
免疫印迹操作步骤
免疫印迹操作步骤western blot 超详细步骤一、蛋白质的样品制备：一、溶液：裂解液及蛋白酶抑制剂（每毫升裂解液加20ulcocktail）二、操作步骤：1、6孔板置于冰上，细胞经预冷的PBS漂洗3次，每孔加入100μl裂解液，5min后用细胞刮刀刮取细胞，用枪头转移至1.5mlEP 管中，编号置于冰上。
2、以上所得的样品用超声细胞破碎仪超声处理，超声时间为3S，间歇时间为10S，重复三次。
3、于4℃离心机（预冷）12000r离心15min，取上清，收集于0.5mlEP管中。
二、蛋白浓度的测定（BCA法测定蛋白浓度）1.取标准蛋白（2mg/ml）备用。
2.于标准蛋白稀释为2mg/ml 1mg/ml 0.5 mg/ml 0.25 mg/ml 0.125mg/ml 0mg/ml，96孔板中每孔加入10ul，设3个复孔，待测蛋白稀释8倍，每孔加入10ul，设3个复孔，每孔加入BCA工作液（A液：B液=50：1混匀）90ul，37℃温浴30min，酶标仪测出各吸光度值，EXCEL输入数据，绘制标准曲线。
测出待测蛋白浓度。
测完蛋白含量后，计算含30、50μl蛋白的溶液体积即为上样量。
按上样量取出样品至0.5ml的EP管中，加入5×SDS 上样缓冲液至终浓度为1×。
后蛋白于95℃煮5min（干湿温箱预热）。
样品于-80℃保存。
三、电泳1.制胶分离胶:电泳凝胶浓度试剂10%H2O(ml) 4.030%丙烯酰胺3.31.5mol/lTris.cl(PH8.8) (ml)2.510%SDS(ml) 0.110%AP(ml) 0.1TEMED(μl) 5总体积(ml) 10浓缩胶试剂浓度(5%)H2O(ml) 230%丙烯酰胺(T: 30%,C: 3%(ml) 0.51.0mol/lTris.cl(PH8.8) (ml) 0.510%SDS(μl) 4010%AP(μl) 30TEMED(μl) 4总体积(ml) 31、玻璃板对齐后放入夹中卡紧。
免疫印迹检测方法
免疫印迹检测方法
免疫印迹检测方法，又称蛋白质印迹或Western Blotting，是一种利用抗
原抗体的特异性结合检测复杂样品中的某种蛋白的方法。
以下是其基本步骤：
1. 取样：取上清液作为样品。
2. 电泳：制备电泳凝胶，进行SDS-PAGE。
3. 转移：通过半干式转移，将电泳后的凝胶上的蛋白质转移到膜上。
这个过程包括割胶、平衡、膜处理、转膜等步骤。
其中，转膜是关键步骤，需要将凝胶上的蛋白质精确转移到NC膜上，滤纸、凝胶、NC膜需要精确对齐，
去除气泡，并在恒流1mA/cm2下转移小时。
4. 免疫检测：在转移后的膜上，利用抗体进行检测。
这一步通常包括一抗和二抗的结合，以及通过化学发光检测或其他方法检测到结合的抗体。
5. 结果分析：通过对比染色结果和标准条带，可以分析出样品中特定蛋白质的表达情况。
此外，阴性对照是以1%BSA取代一抗，其余步骤与实验组相同。
以上信息仅供参考，具体步骤可能会根据实验需求和条件有所不同，建议咨询专业人士获取具体信息。
完整版WesternBlot免疫印迹法实验方法步骤
Western Blot(免疫印迹法)实验方法步骤发布日期:2008-8-25 热门指数:4360Western Blot(免疫印迹法)主要包括以下4个基本步骤：n 样品制备n 电泳分离n 蛋白的膜转移n 免疫杂交与显色――蛋白检测溶液和试剂n 1X 磷酸盐缓冲液(PBS)n Modified RIPA bufferTris-HCl: 50 mM, pH 7.4 ; NP-40: 1% ;Na-deoxycholate: 0.25% ;NaCl: 150 mM ;EDTA: 1 mM ;PMSF: 1 mM ;Aprotinin, leupeptin, pepstatin: 1 microgram/ml each ;Na3VO4: 1 mM ;NaF: 1 mMn 1X SDS 样品缓冲液62.5 mM Tris-HCl (pH 6.8 于25°C), 2% w/v SDS, 10%甘油,50 mM DTT, 0.01% w/v溴酚蓝n 转移缓冲液25 mM Tris base, 0.2 M 甘氨酸, 20%甲醇(pH 8.3)n 10X Tris缓冲盐(TBS)准备1L 10X TBS: 24.2 g Tris base, 80 g NaCl;用1N HCl调pH为7.6n 脱脂奶粉或BSAn 甲醇n TBS/T缓冲液1X TBS, 0.1% Tween-20）TBS/T封闭缓冲液（n1X TBS, 0.1% Tween-20加5% w/v脱脂奶粉或BSAn 一抗的稀释1X TBS, 0.1% Tween-20 加5% BSA (多抗)或5%脱脂奶粉(单抗)Note: 一般来说, BSA被推荐用于多克隆抗体，脱脂奶粉用于单克隆抗体，这样可得到较高的信噪比。
抗体的稀释度参考抗体说明书或根据实验确定。
n 预染的蛋白质Marker，可用于监测转膜的效率样品制备原始样品可为细胞、组织、培养上清、免疫沉淀或亲和纯化的蛋白，以下为定性检测目的蛋白时细胞样品的处理方法，其余的样品制备方法参阅相关文献。
Western印迹法原理、操作步骤及应用
Western印迹法的原理及应用一、原理免疫印迹法（Western印迹法）是将经过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。
以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或放射性核素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。
典型的印迹实验包括三个步骤：①蛋白质的电泳分离；②将电泳后凝胶上的蛋白质转移至固体膜上，用非特异性、非反应活性分子封闭固体膜上未吸附蛋白质区域；③免疫学检测。
免疫印迹法克服了聚丙烯酰胺凝胶电泳后直接在凝胶上进行免疫学分析的弊端，极大地提高了其利用率、分辨率和灵敏度，使其成为使用最广泛的免疫化学方法之一。
二、材料Western印迹法所需材料包括SDS-PAGE试剂，硝酸纤维素薄膜，匀浆缓冲液，转膜缓冲液，膜染色液，显色液，酶标二抗及其底物等。
三、操作步骤（一）样品制备培养细胞及组织样品加匀浆缓冲液，机械或超声波室温匀浆0.5～1分钟。
细菌诱导表达的原核细胞，可通过电泳上样缓冲液直接裂解细胞。
然后4℃，13 000g离心15分钟，取上清液作为样品。
（二）SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝胶电泳是目前对蛋白质进行分离、纯度鉴定及分子量测定的主要方法之一。
十二烷基磺酸钠（SDS）是一种阴离子去污剂，可与蛋白质结合，使蛋白质变性并带上大量负电荷。
SDS-PAGE是最常用的凝胶电泳技术。
它通常采用不连续电泳系统，即用上层胶（成层胶）和下层胶（分离胶）两种不同浓度的凝胶灌制凝胶板。
SDS-PAGE通过其电荷效应、浓缩效应和分子筛效应，达到蛋白质高分辨率的分离效果。
抗原等蛋白样品经SDS处理后带负电荷，在聚丙烯酰胺凝胶中从阴极向阳极泳动，分子量越小，泳动速度就越快。
此阶段分离效果肉眼不可见（只有在染色后才显出电泳区带）。
免疫印迹标准化操作流程
免疫印迹标准操作流程 (磷酸化与去磷酸化实验专用) -----YU lab Contributed by Jia Chen (2014-5-13)1实验原理Western Blot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。
经过PAGE分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。
以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。
该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达。
2 溶液配制a 30%凝胶贮液：29.2g丙烯酰胺，0.8g甲叉双丙烯酰胺，溶于100ml蒸馏水中，滤纸过滤，于4℃暗处贮存；b 1.5M PH8.8 Tris‐HCl 缓冲液（分离胶缓冲液）： Tris碱36.3g溶于蒸馏水，用浓盐酸调至PH8.8，以蒸馏水定容至200ml，过滤后于4℃贮存；c 1M PH6.8 Tris‐HCl 缓冲液（分离胶缓冲液）： Tris12.1g溶于蒸馏水，用浓盐酸调至PH6.8，以蒸馏水定容至100ml，过滤后于4℃贮存；d 10%(w/v)SDS：称取0.5g SDS,加入ddH2O定容到5ml；e 10%(w/v)过硫酸铵（APS）溶液：称取0.5g APS，加入ddH2O定容到5ml,均分装至1.5mL离心管，留一管做实验，其余4管‐20℃冰箱保存备用；f 四甲基乙二胺（TEMED）：g 10×电极缓冲液PH8.3（1L）： Tris30.3g，甘氨酸144.2g，SDS 10g， 溶于蒸馏水并定容至1000ml,使用时稀释10倍。
h 2×SDS上样缓冲液（样品稀释液）： SDS 500mg,巯基乙醇1ml ,甘油 3ml, 溴酚蓝4mg，1mol/L Tris‐HCL (pH6.8)，用蒸馏水溶解并定容至10ml，按每份1ml分装，可在4℃存放数周，或在‐20℃保存数月。
免疫印迹实验步骤及问题解决
免疫印迹实验步骤及问题解决一、实验步骤试剂和缓冲液1x RIPA 缓冲液: 50 mM Tris，150 mM NaCl，0.1% SDS，0.5% SDS，1% Triton X-100 或NP40. 1x PBS 缓冲液: 137 mM NaCl，2.7 mM KCl，2.7 mM Na2HPO4，2.7 mM KH2PO4，pH 7.4 BCA或Bradford蛋白分析试剂盒1.5 M Tris缓冲液（pH 8.8）: 90.68 g Tris-HCl to ddH2O，500 ml溶液pH调节到8.81.0 M Tris缓冲液（pH 6.8）: 60.58 g Tris-HCl to ddH2O，500 ml溶液pH调节到6.810% APS: 100 mg AP 溶于1 ml ddH2O。
用前准备10% SDS: 10 g SDS溶于100 ml ddH2O。
1x Tris-甘氨酸电泳缓冲液: 25 mM Tris，230 mM 甘氨酸（pH 8.3），0.1% SDS。
3x SDS蛋白加样缓冲液: 150 mM Tris （pH 6.8），6% SDS，30% 甘油，30 mM EDTA和0.2% 溴酚蓝1x TTBS: 25 mM Tris（pH 7.5）: 0.15 M NaCl，0.05% Tween-20，0.001% 硫柳汞1x 转移缓冲液: 3 g Tris，14.4 g甘氨酸和200 ml甲醇，加ddH2O 到1L样品准备细胞培养样品贴壁细胞去除培养基，用1X PBS冲洗去掉残留培养基加入预冷的400 ul-1 ml 1X RIPA缓冲液/100 mm平皿。
在冰上孵育5-10 min。
完全刮下细胞并转移到在冰上预冷的1.5 ml离心管中。
（可选）充分混匀或超声处理。
4°C下12,000 rpm离心10-15 min并收集上清总蛋白用前需储存在-20°C。
免疫印迹法基本步骤
免疫印迹法基本步骤
一、蛋白质样品制备
1. 组织或细胞样品：将组织或细胞放入含有蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂的细胞裂解液中，通过超声破碎或匀浆器破碎细胞，释放出胞内蛋白质。
2. 细菌样品：将细菌培养物离心收集菌体，用超声波破碎菌体，释放出蛋白质。
3. 血清样品：直接使用。
二、凝胶电泳
1. 将制备好的蛋白质样品进行SDS-PAGE凝胶电泳，分离出不同大小的蛋白质。
2. 在电泳过程中，蛋白质带电荷量不同，大小也不同，因此会形成不同的条带。
三、转膜
1. 将凝胶上的蛋白质转移到硝酸纤维素膜或PVDF膜上。
2. 在转移过程中，蛋白质通过电荷和疏水作用吸附到膜上，保持原有的相对分子量和特异性。
四、免疫反应
1. 将膜与一抗进行孵育，一抗能够与特定的蛋白质结合。
2. 孵育后清洗掉未结合的一抗，再将膜与二抗孵育。
二抗能够与一抗结合，起到放大的作用。
3. 二抗的标记物可以是酶、荧光物质或放射性同位素等，便于后续的检测和信号放大。
五、检测
1. 根据标记物不同选择相应的检测方法，如化学发光法、荧光法、放射自显影法等。
2. 通过检测器检测膜上的信号强度，分析特定蛋白质的表达情况。
六、结果分析
1. 对电泳图谱和免疫印迹图谱进行比较和分析，确定目标蛋白质的位置和相对表达量。
2. 将实验组与对照组进行比较，判断蛋白质表达的差异。
幽门螺杆菌免疫印迹法使用说明
幽门螺杆菌免疫印迹法使用说明幽门螺杆菌免疫印迹法使用说明：
1、首先，操作者需要准备好幽门螺杆菌免疫印迹法所需的试剂，确保试剂的有效期。
2、将标本放入洗涤液中洗涤，以去除外部污染，然后以pH为7.2的肌苷酸缓冲液稀释标本。
3、将稀释后的标本放入酶标板中，用磁力搅拌机振荡稀释物
5min，以有效地分解和提取质粒DNA。
4、加入测序缓冲液，进行模板DNA复制，2次循环。
5、施加免疫印迹，利用免疫印迹原理将有目的基因片段结合到免疫印迹支架上，做出免疫印迹。
6、清洗、烘干及三次结果叠加分析，以获取准确的结果。
western 实验操作流程
免疫印迹实验操作流程一、培养细胞总蛋白质的提取1. 每200ul预冷的RIPA裂解液中加入2ul PMSF，混匀后置冰上备用；2. 收集细胞，用预冷PBS洗涤细胞两次，尽可能吸干上清；3. 每106个细胞加100ul预冷的RIPA裂解液，与细胞充分混匀，置4℃条件下放置30m，每间隔5分钟吹打混匀；4. 4℃，12000rpm条件下离心5m，将上清转移入另一预冷的离心管中；5. 使用蛋白定量试剂盒及酶标仪对总蛋白质进行定量测定；调整蛋白浓度；6. 依据体积加入6×蛋白上样缓冲液（如不立即使用，置于-80℃待用）；沸水浴煮沸5分钟后准备上样。
二、电泳与转膜7. 清洗玻璃板，制备SDS-聚丙烯酰胺凝胶（10%分离胶和5%积层胶）；8. 蛋白提取液与预染蛋白分子量Marker上样，100V电泳；9. 依据实验要求剪出合适大小的PVDF膜，甲醇漂洗PVDF膜10s，并使用电转液完全浸润PVDF膜、胶板、海绵、滤纸15m；10. 剥胶后，根据预染蛋白分子量Marker确定目的条带的位置并切胶；11. 按阴极至阳极：海绵-滤纸-凝胶-PVDF膜-滤纸-海绵的顺序将转膜板固定于装满电转液的电转槽中，90V电转；12. 电转结束后，在膜上做标记；三、封闭、一抗与二抗孵育、显色13. 将膜条置于含5%脱脂奶粉的TBST中，室温缓慢振荡封闭1h；14. 将膜条转移至含1%脱脂奶粉的TBST稀释的一抗中：抗β-actin小鼠抗人单克隆抗体（1:4000），置4℃条件下缓慢振荡过夜（或室温振荡2h以上）；TBST 液洗膜三次，每次10min；15. 将膜条转移至含1%脱脂奶粉的TBST稀释的二抗中：辣根酶标记山羊抗小鼠IgG（1:4000），室温缓慢振荡1h；TBST液洗膜三次，每次10min；16. 加入配制好的化学发光试剂ECL，室温2min后，X光片曝光、显影、定影。
蛋白质免疫印迹实验步骤
蛋白质免疫印迹实验步骤1. 引言嘿，大家好！今天我们要聊聊一个非常酷炫的实验——蛋白质免疫印迹实验，或者说西方印迹（Western Blot）。
听名字就很高大上对吧？其实就是用来检测特定蛋白质的。
想象一下，你在寻找一颗珍珠，蛋白质就是那颗珍珠，而免疫印迹就是我们的寻宝地图。
别担心，我会一步一步带你走过这条寻宝之路，让我们开始吧！2. 实验准备2.1 材料准备首先，准备好你的材料，这一步可马虎不得哦。
你需要的东西包括样品（这可以是细胞、组织、甚至是你那杯牛奶），裂解缓冲液、凝胶电泳设备、转膜设备、封闭液、抗体（这个可不能少！），还有洗涤液和显色试剂。
听起来有点像是做饭，其实是很简单的，像是在调配一碗美味的汤。
2.2 样品处理接下来，我们要处理样品。
把你的样品和裂解缓冲液混合，轻轻摇晃，让它们充分融合。
接着，要把这些混合液放在冰上静置一段时间，简直就是在给它们来个冷静期，让蛋白质们沉淀下来。
然后，咱们要通过离心机把细胞的碎片和其他杂质去掉。
小心别把珍珠也扔了，哈哈！3. 电泳分离3.1 凝胶制备哎呀，这时候就要准备凝胶了。
其实凝胶就像是个筛子，能让小的蛋白质通过，而大的蛋白质则被挡住。
我们一般用聚丙烯酰胺凝胶，先把它溶解，放到模具里，等它固化。
固化的时候可以去喝杯茶，顺便欣赏一下这小小的“魔法”。
3.2 电泳运行凝胶固化好后，就可以把样品上胶了。
注意哦，别搞得稀里糊涂，把样品挤到槽里。
然后把凝胶放进电泳池，接上电源，开跑！这就像在赛道上，蛋白质们各显神通，争先恐后。
别着急，等到它们跑到适当的地方，再把它们捞出来。
4. 转膜步骤4.1 转膜跑完电泳，接下来是个关键步骤——转膜。
把凝胶和膜叠在一起，放在转膜装置里，接上电源，让蛋白质们转移到膜上。
就像是把书里的内容复制到你的笔记本上，确保每个细节都不漏掉。
转膜的过程可能需要一段时间，但别担心，慢工出细活嘛！4.2 封闭和抗体孵育转完膜后，我们要进行封闭。
immunoblotting免疫印迹法
immunoblotting免疫印迹法免疫印迹法（Immunoblotting）是一种常用的蛋白质检测方法，它通过使用特异性抗体来检测目标蛋白质在复杂的混合物中的存在和量。
免疫印迹法的原理是将蛋白质样品分离后转移到固定膜上，然后用特异性抗体与目标蛋白质结合，最后通过检测抗体标记物的信号来确定目标蛋白质的存在与数量。
免疫印迹法的步骤如下：1.蛋白质分离：首先，将待测样品进行电泳分离。
通常使用聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）进行分离，根据蛋白质的分子量大小将其分离成不同的带状条带。
2.转印：将蛋白质从凝胶转移到固定膜上。
这个步骤通常使用西方半湿法或湿法转印，将凝胶和膜夹在一起，通过电流使蛋白质从凝胶逐渐转移到膜上。
3.阻断：为了减少非特异性结合，需要用饱和蛋白或其他蛋白质进行膜的阻断。
常见的阻断剂包括牛血清白蛋白（BSA）或非脂干奶粉。
4.抗体结合：将特异性的一抗加入到含有阻断剂的缓冲液中，将膜与抗体溶液一同孵育，使抗体与目标蛋白质结合。
5.清洗：将膜用洗涤缓冲液洗涤，以去除未结合的抗体和其他非特异性的成分。
6.检测：将抗体标记物（如荧光素、辣根过氧化物酶等）加入到膜上，使其与结合的抗体发生特异性反应。
通过荧光素的化学反应或辣根过氧化物酶底物的显色反应来产生可见的信号。
这些信号可以通过数字成像系统进行记录和分析。
免疫印迹法的优点包括：能够检测特定蛋白质的存在和量；需要样品量比较小，一般几微克；灵敏度高，可检测到非常低浓度的目标蛋白质；可以同时检测多个蛋白质。
然而，免疫印迹法也存在一些局限性，如需要已知的特异性抗体来进行检测，如果没有可用的抗体，就无法检测目标蛋白质；对于高分子量的蛋白质，由于电泳分离的限制，可能无法很好地分离和转移；部分抗体可能存在交叉反应或非特异性结合问题；荧光或显色信号必须进行定量分析才能获得准确的结果。
总体来说，免疫印迹法是一种常用且可靠的蛋白质检测方法，广泛应用于生物医学研究和临床诊断中。
免疫印迹分析流程
免疫印迹分析流程
一、实验准备
1.准备试剂和设备：免疫印迹分析需要的试剂和设备包括蛋白样本、SDS-凝胶、转膜膜、植物生物素-磷酸化酶、抗体等。
2.蛋白样本制备：将待检测的蛋白样本加入SDS-凝胶中，通过电泳
分离蛋白。
3.封闭：将分离的蛋白转移到转膜膜上，然后使用封闭液（如牛奶或BSA）阻断非特异性结合位点。
4.探测：将转膜膜与目标蛋白特异性的抗体结合，然后添加辅助试剂（如生物素-磷酸化酶）使得信号可检测。
5.探测：将荧光标记的探针（如荧光素-磷酸化物）与辅助试剂结合，产生荧光信号。
6.检测：使用荧光成像系统或其他适当的设备检测荧光信号，分析结果。
二、应用领域
1.蛋白表达分析：免疫印迹可以用于检测蛋白在细胞中的表达水平，
通过比较不同细胞或不同条件下蛋白的表达水平，可以进一步研究蛋白的
功能和调节机制。
2.蛋白相互作用分析：免疫印迹可以用于检测蛋白与其他分子（如受体、配体等）的相互作用，从而揭示蛋白在信号传导通路或代谢途径中的
作用机制。
3.肿瘤标志物检测：免疫印迹可以用于检测肿瘤标志物，帮助早期诊
断和监测肿瘤的进展，为个体化治疗提供依据。
4.免疫原性研究：免疫印迹可以用于检测抗原的免疫原性，用于疫苗
研发和免疫治疗的评估。
5.药物筛选和评价：免疫印迹可以用于评估药物对特定蛋白的作用效果，帮助筛选和优化药物开发。
总之，免疫印迹是一种重要的生物技术方法，可广泛应用于生物学和
医学研究领域，为我们更深入地理解生命的奥秘提供了有效的工具和手段。
免疫印迹步骤
2.6 免疫印迹（Western blot）（1）裂解细胞，提取细胞总蛋白：收集细胞（约2×106），离心洗涤2次，加入100µL RIPA裂解液，置冰上反应30min，4℃12,000r/min离心15min，取上清，蛋白定量后分装，-80℃冻存备用；（2）蛋白定量：Bradford法测定蛋白质含量[35]：①分别在微量离心管中各加入0.5mg/mL BSA 5µL、10µL、15µL及20µL，以0.15mmol/L的NaCl补足至100µL，同时以两管100µL的0.15mmol/L的NaCl作空白对照。
②每管各加入900μL考马斯亮蓝G-250溶液，振荡混匀，室温放置2min。
③用1cm光径的微量比色杯测A595吸光值，取A595吸光值对标准蛋白浓度作图，画出标准曲线，并测量待测样品的A595吸光值，从BSA标准曲线中确定待测样品的浓度。
（3）SDS-PAGE电泳①制胶SDS丙稀酰胺凝胶12％分离胶8％分离胶5％积层胶去离子水 3.3mL 4.6mL 2.7mL1.5mol/L Tris-Cl(pH8.8)2.5mL 2.5mL －1.0mol/L Tris-Cl(pH6.8) －－0.5mL30%丙稀酰胺 4.0mL 2.7mL 0.67mL10% SDS 0.1mL 0.1mL 0.04mL10%APS 0.1mL 0.1mL 0.04mLTEMED 0.004mL 0.004mL 0.004mLTotal 10mL 10mL 4mL其中10%APS和TEMED需等临灌胶之前再加入。
先配制好分离胶，在涡旋混合器上混匀，立刻用吸管将胶缓缓灌入到大小两块玻璃板之间，至胶的最上缘距玻璃板顶端3cm左右。
再用去离子水覆盖在分离胶的上层，封闭空气使胶易于凝固。
室温静置1h左右可看到去离子水和胶之间由于折射率不同而出现一条界限，说明胶已经凝好，可用注射器小心吸出上层的去离子水。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
1．主要内容
检测限为2—20fmol，或约0．1～lng的50kDa蛋白质
有多个操作步骤，需2天(或1天)时间完成。
检测抗原的存在，定量及其大小。
半定量至全定量。
抗原的检测依赖于耐变性的表位。
一般，低亲和力抗体亦可使用。
2．操作步骤
(1)将蛋白质溶解于Laemmli样品缓冲液中。
最终的样品缓冲液条件是2％SDS、100mmol／LDTT(从lmol ／L的储存液中取出，临用前加入，该储存液置于—20℃冷冻保存)、60mmol／LTris(pH6．8)、0。
01％溴酚蓝和10％甘油。
全细胞可直接放在样品缓冲液中进行溶解；纯化或部分纯化的溶液可用2％的样品缓冲液1：1进行稀释。
加热至70℃10min。
最终蛋白质浓度应不超过150ug／每孔(微型胶不超过15pg／每孔)。
(2)将样品放在SDS聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳，移去平板，将凝胶剪成适当大小以进行转印。
在凝胶上作记号以确定方向。
(3)剪1张硝酸纤维素膜和4张吸附滤纸(Whatman 3MM或替代物)，其大小与凝胶相当。
(4)将硝酸纤维素膜放入蒸馏水中润湿。
将膜转入转印缓冲液中浸泡5min。
将吸水纸浸泡于转印缓冲液中。
转印缓冲液1(20 000～400 000kDa蛋白质)：48mmol／LTris，390mmol／L甘氨酸、0．1％(w／v)SDS、20％甲醇加蒸馏水至1000ml。
转印缓冲液2(<80 000kDa蛋白质)：25mmol／LTris、190mol／L甘氨酸、20％甲醇加蒸馏水至1000ml。
(5)将凝胶、印迹膜、滤纸和支持垫浸入转印缓冲液中使其完全浸泡。
小心地将支持垫中的气泡排出。
(6)组装转印夹层组合：依次为支持垫、2张吸水纸、凝胶、膜、2张吸水纸和支持垫。
将组装好的夹层组合放入转印槽中，并使膜靠近正极(阳极，红色电极)。
(7)于4C条件下转印过夜。
分子质量>100 000kDa的蛋白质，先在28V转印1h，然后在84V转印14～16h。
分子质量<100 000kDa的蛋白质，63V转印4～16h。
(8)转印完成后，断开电源。
卸下夹层组合装置，并在硝酸纤维素膜上作记号以保持原来的方向。
(9)用PBS将膜清洗数次。
(10)在室温下将膜放入5％脱脂奶粉／PBS中搅动孵育2h。
然后从封闭液中取出印迹膜并用PBS漂洗2次，每次5min。
(11)加入一抗溶液。
15cmXl5cm印迹膜用10ml。
所有的溶液均用3％BSA／PBS进行稀释。
(12)在室温下将膜和抗体搅动孵育1h。
用PBS将膜漂洗4次，每次换液洗5rain。
(13)加入辣根过氧化物酶标记的二抗试剂。
所有的溶液均用3％BSA／PBS进行稀释。
对组织培养上清可以不稀释或1：10稀释。
这样获得的抗体浓度为1Ps／ml和50ug／ml。
如果是多克隆抗血清或腹水，将10ul 稀释至10ml即可。
如果抗体的浓度尚未知，需作若干稀释度以确定正确的浓度范围。
(14)在室温下搅动孵育1h。
用PBS将膜漂洗4次，每次换液洗5min。
(15)在临用前，新鲜配制化学发光试剂。
由于该试剂的半衰期非常短，故应按需配制。
将膜放入此液内孵育lmin。
(16)用纸巾吸去印迹膜边缘或边角部分过多的化学发光试剂。
将印迹膜放入塑料袋中以确保干的表面与胶片接触。
(17)将印迹膜在暗室中使胶片曝光lmin。
冲洗胶片以确定待测抗原的正确曝光时间。
曝光时间可短至几秒钟，也可长达数小时。