chapter3+植物组培快繁和脱毒技术

离体快繁的一般技术
•培养材料选择及消毒 •材料的初代培养(无菌母株制备) • 试管苗的增殖与继代培养（不定芽增殖） • 试管苗的生根与移栽（完整植株形成）
• 再生植株鉴定
芦荟的植物组织培养过程
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1、培养材料选择及消毒 1）、培养材料的选择 • 种和品种选择
培养部位选择 器官的生理状态和发育年龄 取材季节选择 材料的大小
原球茎形成
3、试管苗的增殖与继代培养
• 1）、试管繁殖速率及计算
• 理论计算： 接种一个芽或一块增殖的培养物，经一段时间 的培养后看能得到多少个芽或苗，从而推算理 论上一年能繁殖出多少苗。
• 实际计算： 接种一个芽或转接一个苗，经过一定的实际繁 殖周期看实际得到多少个苗或成苗，再换算成 每个周期实际繁殖的数量。
茎尖大小
去病毒
成活
茎尖长 叶原基 小植株 脱毒植株 脱毒率
(mm) 数
数
数 （％）
0.12 1
50
24
48
0.27 2
42
18
42.9
0.6
4
64
0
0
2、物理学方法脱毒
其原理是将植物组织置于高于 或低于正常温度的环境中，使内部 的病毒受热（冷）以后部分或全部 钝化（而非杀死），但寄主植物的 组织很少或不会受到伤害。
细胞分裂素可打破顶端优势对腋芽 的抑制作用，组培中常添加细胞分裂素 促进腋芽的不断分化和生长，逐渐形成 芽丛；
不定芽（除现有的芽之外，在任何 器官上的通过器官发生重新形成的芽） 形成，一般使用细胞分裂素高于生长素 的配比，两者配比接近1的也用得很多；
• 一般在含丰富还原氮的培养基上 诱导胚状体形成，加生长素，特 别是2，4——D能诱导胚状体发 生，然后转移到降低浓度或没有 生长素的培养基上使其成熟 。
A、高温处理
又 称 温 热 疗 法 （ thermotherapy ） ， 有两种处理方法：
一是温汤浸渍处理，适用于休眠器官、剪下 的接穗或准备种植的材料，在50℃左右的 温水中浸渍数分钟至数小时，方法简便易 行，但易导致材料受伤。
二是热风处理，将生长的盆栽植物移入温热 治疗室（箱）内，处理温度和时间因植物 种类和器官的生理状况而异，一般为35～ 40℃，短则几十分钟，长可达数月。
• 大蒜 1/8-1/5 • 马铃薯 1/10 • 贝母1/3 • 魔芋1/5
便于运输
• 种苗体积小，自带容器，便于携 带和运输。
• 以马铃薯为例，一亩地4000株计 算，常规薯4000个重200kg （50g/个）,试管薯只有1kg （100-200mg/个）
二 .离体快繁的一般技术
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B、低温处理
又称冷疗法（cryotherapy） 将菊花植株在5℃条件下经4～7.5个 月的处理后，切取茎尖进行培养， 可除去菊花矮化病毒和菊花褪绿斑 驳病毒。
3、化学疗法脱毒
采用许多化学药品包括嘌呤和嘧啶类 似物、氨基酸、抗生素处理，可在某种程 度上抑制植物体内或离体叶片内病毒的合 成，但不能完全抑制病毒使之失活或不活 化。三氮唑核苷（鸟嘌呤类似物）、2—硫 尿嘧啶、放线菌酮和放线菌素—D等也常有 应用。
• 用于有性繁殖变异范围大而自然条件下又 不易繁殖的植物，如非洲菊、紫罗兰等。
四、离体快繁中的有关问题
• 培养物的增殖方式 • 外源生长调节物质对品种典
型性的影响 • 继代次数与变异
第二节 植物的组培脱毒技术
• 为什么要脱毒？ • 怎样脱毒？ • 怎样鉴定无病毒植株？
病毒不仅使人患病，同样也侵害植 物，使植物出现皱叶、黄叶、落叶，以 致品质变劣、花色变淡、花数减少、产 量降低。
1、 茎尖培养脱毒
分生组织能逃避病毒浸染的原因： • 在植物体内，病毒易于通过维管系统而
移动，但在分生组织中不存在维管系统。 • 病毒在细胞间的移动只能通过胞间连丝，
但它的速度很慢，赶不上细胞不断分裂 的生长速度； • 在旺盛分裂的分生细胞中，代谢活性很 高，使病毒无法复制；在茎尖中存在高 水平的生长素，可抑制病毒的增殖。
由于依赖营养繁殖的作物很多，植物 的快速繁殖技术也正是建立在无性繁殖的 基础上，因而脱毒方法就显得尤为重要。
一、 快速繁殖中去除病毒的方法
1、茎尖培养脱毒 2、物理学方法脱毒 3、化学疗法脱毒 4、其他方法脱毒
愈伤组织培养脱毒 珠心胚培养脱毒 茎尖微体嫁接（MGST）
脱毒的方法：
1. 茎尖培养脱毒
快速繁殖新品种，迅速推广
• 周期短（1-3月） • 不受季节限制 • 繁殖系数高
有效保持优良品种的特性
• 离体无性繁殖 • 性状不分离，也不退化 • 避免病虫害侵染 • 是异交作物和无性繁殖品种繁育
的理想途径
生产无病毒种苗，防治品种退化
节约耕地，提高农产品附加值
• 以变态器官作为 繁殖体的作物年 产品用留作种的 比例
3、继代和增殖中应注意的问题
外源激素的积累：
由于长期反复的继代增殖，外 源激素大量积累，会导致不正常生 长和分化，形成各种畸形芽、畸形 茎、透明芽等，影响再生植株的质 量。
解决方法：
继代培养中降低激素的水平。
4、试管苗的生根与移栽
1、生根
A、试管内生根 B、试管外生根
2、移栽
试管苗从试管内移到试管外， 经历了三个重要的转变：
4、其他方法脱毒 •愈 伤 组 织 培 养 脱 毒
•珠心胚培养脱毒
•茎尖微体嫁接（MGST）
二、无（特定）病毒植株的鉴定
每一茎尖或愈伤组织分化产生的植株， 在作为母本生产无病毒原种以前，必须对特 定病毒进行鉴定。
由于许多病毒具有延迟的恢复期，所以 在最初18个月中每隔一定时间仍须进行鉴定， 只有显示持续阴性反应的无病毒植株，才能 供生产上应用。
• 对品种遗传稳定性要求高的作物一 般不采用这一途径。
2）、培养材料的灭菌 A、常用消毒剂 对消毒剂的要求是：
有良好消毒作用 易冲洗或自行分解 不损伤材料，不影响生长
B、培养材料灭菌
• 不同材料其带菌情况不一，选择不同的 消毒剂进行处理。通常先用自来水冲洗， 有的需用肥皂、洗衣粉或吐温等进行洗 涤之后在消毒，消毒完后用无菌水多次 冲洗后方可接种。值得注意的是，常规 灭菌针对培养材料的外生污染菌，对内 生菌无效。内生菌污染问题很难界定并 且很难解决。
外植体接种后，可能通过不同的途 径实现全能性的实现。有的先形成愈伤组 织再进行器官分化；有的直接形成胚状体； 有的先芽后根；有的先根后芽。
愈伤组织发生
• 愈伤组织（Callus） 组织培养中外植体经脱分化形
成的一种无组织结构的团块组织， 由于这种组织以往常见于受创伤的 植物器官和基干表面，故叫愈伤组 织（Wound Callus）。
2、材料的初代培养
1）、初代培养物的建立 做到：保证无菌、条件合适、技术 过关和防止污染和外植体的褐变
• 保证无菌是最基本的前提。 • 选择合适的种类、品种及培养部位； • 选择合适的培养基、激素及其它添加物 • 还要注意掌握适宜的培养条件。
2）、培养反应的观察与统计
植物离体快繁时，由于植物种类不 同，所采用的外植体类型不同及培养基的 化学组成不同，因而器官再生途径有很大 的差异。
根形成
根的起源有两种： • 一种是起源于苗基部切口处形成的愈伤
组织上，由愈伤组织内部形成； • 另一种是起源于苗基部切口处愈伤组织
的上部，直接起源于中柱鞘细胞，由于 发生与茎的中柱相连，故利于移栽成活。
胚状体形成
• 概念： 离体培养下起源
于非合子细胞，经历 了胚胎发生和胚胎发 育过程所形成的类胚 结构。
多数农作物，特别是无性繁殖作物， 都易受到一种或多种病原菌的周身浸染。 病原菌的浸染不一定都会造成植物的死 亡，很多病毒甚至可能不表现任何可见 症状。但在植物中病毒的存在会减少作 物的产量和降低作物的品质。
植物病毒多经无性繁殖而传递，有性 繁殖的植物除豆类一部分作物外，种子均 不会传递病毒。若使用未受侵染个体的种 子进行繁殖，就有可能得到无病毒植株。 不过有性繁殖后代常表现遗传变异性。
增殖方式
腋芽增殖 不定芽增殖 体细胞胚增殖 愈伤组织增殖
腋芽增殖
• 培养方法简单，能高度保持遗传 稳定性，能长期继代增殖。
• 一般不需要添加外源激素，即使 加也要严格控制浓度，防治产生 愈伤组织。
不定芽增殖
• 从现存的芽以外 的任何器官、组 织上通过器官发 生重新形成芽。
• 繁殖系数高 • 遗传稳定性较好 • 继代次数有限
第一节 植物的离体快繁
植物离体快繁（Micropropagation） 又叫微型繁殖或试管繁殖，它是把植物 材料放在试管内，给予人工培养基和合 适培养条件，达到高速增殖，属离体无 性繁殖。
其特点是快速，每年能以千百万倍 的速度繁殖后代，比常规繁殖方法快万 倍到数十万倍。
一 .离体快繁的应用
良种快繁 脱毒良种苗快繁和无病毒苗大量快繁； 特殊育种材料快繁； 制种材料快速繁殖； 自然和人工诱变有用突变体的快繁； 基因工程植株的快繁； 离体保存种质的快繁； 濒危植物的离体快繁.
无病毒植株易被再感染，因此在繁殖的 不同阶段仍需重复进行鉴定。
鉴定方法
1、直观测定法
2、指示植物法
利用病毒在其他植物上 出现症状的特征，作为 鉴别病毒种类的标准， 这种专门用以生产症状 的寄主植物即为指示植 物，又称鉴别寄主。
3、抗血清鉴定法 4、酶联免疫吸附法（ELISA）
5、电子显微镜检查法 6、免疫吸附电镜法
体胚增殖
• 增长率高，双极性免去生根环节 • 但胚状体休眠的诱导和接触难以
把握，成苗率不高。 • 除特殊用途（人工种子），还不
用于快繁
愈伤组织增殖
• 所有植物通过组培方法均可诱导愈 伤组织，再进一步分化形成植株。
• 一切通过其它方式不能成功的植物， 均可通过此途径获得组培苗。
• 成功率高，繁殖系数大，但遗传稳 定性差。
理论计算：
Y＝m×Xn＝mXn
Y——年繁殖数 m——无菌母株苗数 X——每个培养周期增殖的倍数 n——全年增殖次数
月季繁殖速率计算
每5周转接一次（N=10）
甲品种每次增殖3倍，乙品种每次增殖5倍，丙 品种7倍。X=3，5，7
假定一开始都是1个芽（M=1）
那么三品种一年能增殖苗数：
Y甲＝1×310＝5.90×104 Y乙＝1×510＝9.76×106 Y丙＝1×710＝2.82×108
由异养变成自养； 由无菌变为有菌； 由恒温、高湿、弱光向自然变 温、低湿、强光过渡。
三、离体快繁的使用范围
• 用于加速某些难繁殖或繁殖速率很低的植 物，需要加速繁殖的特殊基因型，如名贵 花卉、优质种源、果树芽变分离、工程植 株等。
• 用于自然繁殖极易感染病毒的植株，如马 铃薯、甘蔗、香蕉、石竹、百合等。
• 良种的快速繁殖和推广应用是实 现农业高效生产的一个重要前题。
• 植物组织培养和脱毒技术正是实现 这一重要前题的快繁技术。它已被 广泛用于各种优良品种的迅速繁殖 和推广，在花卉、园艺、农林等方 面发挥重要作用。
• 由植物的一个器官、组织甚至细胞，通 过离体培养，获得一个完整的植株。
• 打破有性生殖的限制，极大提高植物的 繁殖效率。
• 离体培养时，一方面由于材料受 切伤后分泌的伤源激素作用，另 一方面培养基中添加的外源激素 的作用，往往在切口处产生愈伤 组织。生长素,尤其是2，4——D 对愈伤组织诱导形成中作用显著。
芽形成
芽的产生方式有两种： • 从愈伤组织上产生不定芽（除现有的芽
之外，在任何器官上的通过器官发生重 新形成的芽 ）； • 从茎尖、侧枝上产生，即腋芽萌发形成 丛生芽。（由于培养基中添加高细胞分 裂素的作用，促进了腋芽的萌发 ）.
（万） （百万）
（亿）
2）、提高繁殖速度的方法
• A、改进培养基 培养基种类、无机及 有机成分、糖浓度、琼脂，特别是植物 激素都影响试管苗增殖和分化。
• B、改善培养条件 25±2℃恒温培养； 光对增殖的影响；培养基的PH值一般在 5.6～6.0之间；气体条件也影响增殖， 氧气不足也会影响增殖和生长。