细胞转染技术原理及应用（瞬时转染和稳定转染）
各种细胞转染方法比较
相对简便、重复比磷酸钙好，但对细胞有一定的毒副作用，转染时需除血清且一般只用于BSC-1，CV-1，COS细胞系
Sigma-Aldrich(DEAE-Dextran Transfection Kit)
磷酸钙法
磷酸钙DNA复合物吸附细胞膜被细胞内吞
稳定转染，染瞬转染
不适用于原代细胞（所需的DNA浓度较高），操作简便但重复性差，有些细胞不适用
各种细胞转染方法比较
细胞转染方法包括DEAE－葡聚糖法，磷酸钙法，阳离子脂质体法，阳离子聚合物，病毒介导法，Biolistic颗粒传递法（基因枪粒子轰击法），显微注射法，电穿孔法等，对各种方法的原理，应用，特点，厂家产品等信息的比较结果如下表：
转染方法
原理
主要应用
特点
厂家及产品
DEAE－葡聚糖法
带正电的DEAE-葡聚糖与核酸带负电的磷酸骨架相互作用形成的复合物被细胞内吞
稳定转染，瞬时转染，所有细胞
使用方法简单，可携带大片段DNA，通用于各种类型的裸露DNA或RNA，能转染各种类型的细胞，没有免疫原性。虽在体外基因转染中有很高的效率，但在体内，能被血清清除，并在肺组织内累积，诱发强烈的抗炎反应，导致高水平的毒性，这在很大程度上限制了其应用
Invitrogen（Lipofectamine 2000，Lipofectamine，Lipofectin，Lipofectamine Plus，Cellfectin）
瞬时转染，特定宿主细胞
可用于难转染的细胞，需考虑安全因素
中国科学院典型培养物保藏委员会
Biolistic颗粒传递法（基因枪粒子轰击法）
将DNA用显微重金属颗粒沉淀，再将包被好的颗粒用弹道装置投射入细胞，DNA在胞内逐步释放，表达
细胞转染的原理操作步骤以及小技巧
细胞转染的原理操作步骤以及小技巧细胞转染是一种将外源DNA、RNA、蛋白质等分子导入到细胞内的实验技术。
这种技术可以用来研究基因功能、发现新的信号通路和治疗基因疾病等。
下面将介绍细胞转染的原理、操作步骤以及一些小技巧。
一、细胞转染的原理：细胞转染主要通过三种方法实现：物理法、化学法和生物学法。
1.物理法：通过高压、电穿孔、微射流等方式，使细胞膜发生瞬时破裂，从而使DNA、RNA等外源分子进入细胞。
常用的物理法有电穿孔法和基因枪法。
2.化学法：通过化学物质，如聚吡咯、脂质体等，使外源分子与细胞膜结合，从而实现转染。
常用的化学法有聚乙烯亚胺（PEI）法、磷酸钙共沉淀法等。
3.生物学法：通过利用病毒载体将外源基因导入目标细胞，实现基因的转移。
常用的生物学法有腺相关病毒（AAV）转染、逆转录病毒（RETRO）转染等。
二、细胞转染的操作步骤：1.细胞的预处理：根据细胞类型和实验要求，将细胞培养至合适的状态。
通常细胞应处于快速生长期，但还未达到接触抑制的阶段。
对于一些特定的细胞，如悬浮细胞，可能需要将其转接至适当的培养基中。
2.外源分子的准备：将外源DNA、RNA等转染载体制备好。
如将DNA克隆并纯化至高质量的质粒DNA，或将RNA合成或纯化。
根据实验要求选择合适的转染载体。
3.转染方法的选择：根据实验要求选择合适的转染方法，如物理法、化学法或生物学法。
一般情况下，物理法适用于悬浮细胞，化学法适用于贴壁细胞，而生物学法适用于大多数细胞类型。
4.细胞转染操作：a.物理法：i.电穿孔法：将细胞悬浮于含有外源分子的缓冲液中，然后通过电穿孔仪的电极或电穿孔板进行电穿孔。
ii. 基因枪法：使用基因枪将外源分子直接“枪”入目标细胞中。
b.化学法：i.PEI法：将PEI与外源DNA或RNA按一定比例混合，在适当条件下形成复合物，然后添加至目标细胞中。
ii. 磷酸钙共沉淀法：将外源DNA与磷酸钙按比例混合，并静置形成磷酸钙- DNA沉淀，然后加入至目标细胞中。
瞬时转染和稳定转染是什么？
瞬时转染和稳定转染是什么？
瞬时转染：外源⽚段的表达时间短暂。
这主要是因为外源导⼊的裸露的载体整合⼊基因组的⼏率⾮常低，所以以染⾊体外(episomal)形式存在，不能随细胞分裂⽽⼀同复制导致最后拷贝数被稀释导致的。
⽽且考虑到细胞分裂会稀释质粒的量，所以起初转染的质粒拷贝数极⾼。
这就导致瞬时转染呈现⼀个⾼拷贝到低拷贝迅速降低的过程，且⽆法在这个系统上实现可诱导表达。
稳定转染：是相对瞬时转染⽽⾔，进⼊细胞的质粒整合⼊细胞基因组中，并能随细胞分裂稳定传递下去。
在这个系统中，质粒表达稳定，拷贝数低，且能实现诱导表达。
稳定转染并不是⼀种与瞬时转染不同的⽅法，只是对瞬时转染的细胞进⾏筛选，得到稳定整合的细胞株。
稳定整合的⼏率因基因传递的⽅法⽽异，跨度可以从10-8到10-1。
因此，对于有的转染⽅法，⽐如化学试剂介导的转染，其整合⼏乎可以忽略不计。
质粒载体整合的位点并不是完全随机分布，依据不同的基因传递⽅法，呈现不同的靶向倾向性，所以是⼀种半随机整合。
细胞瞬时转染原理
细胞瞬时转染原理
细胞瞬时转染是指将外源DNA转入细胞内，并在短时间内获
得目标基因的表达。
细胞瞬时转染原理主要有两种：
1. 物理方法：包括电穿孔、微注射和基因枪。
其中，电穿孔是最常用的方法。
通过施加电场，使细胞膜通透性增加，使外源DNA能够进入细胞内。
微注射是直接利用微注射针将外源
DNA注入到细胞内。
基因枪则是利用高压气体将外源DNA射入细胞。
2. 化学方法：包括钙磷共沉淀、脂质体介导转染和聚合物转染。
钙磷共沉淀是利用DNA与钙离子和磷酸盐共同形成沉淀，通
过该沉淀进入细胞内。
脂质体介导转染则是利用脂质体与
DNA结合形成复合物，通过与细胞膜融合进入细胞。
聚合物
转染利用带正电荷的聚合物与DNA结合形成复合物，通过静
电相互作用进入细胞。
总的来说，细胞瞬时转染方法通过物理或化学手段使外源
DNA能够进入细胞内，并被细胞内的转录和翻译机器所利用，从而实现目标基因的表达。
细胞瞬时转染 稳定转染
细胞转染摘要：真核蛋白表达细胞转染方式有两种：瞬时转染和稳定转染，本文的主要介绍了两者的定义和适用性及细胞转染一般步骤，影响转染效率的因素，帮助我们提高实验的成功率。
在哺乳动物细胞蛋白表达实验，根据不同的实验目的，将质粒导入细胞有两种方法：瞬时转染和稳定转染。
细胞转染是将外源基因导入真核细胞的过程。
质粒、DNA、RNA将这些外源基因导入到真核细胞内并不容易，要跨越细胞膜的屏障进入细胞质。
瞬时转染瞬时转染是指外源基因导入到细胞后得以表达，但是基因不整合到细胞的基因组上，因此不会随着细胞的生长复制。
因此，瞬时转染的时间有限，通常只持续几天，直到外源基因在细胞生长分裂过程中因各种因素消失为止。
判断细胞是否转染成功，在构建质粒上含有报告基团，以指示目标基因是否存在，一般在转染两天后即能被检测到。
稳定转染稳定转染是在瞬时转染的基础上，瞬时转染时有一小部分的基因会整合到细胞基因组上，并随着细胞的生长分裂，质粒会随机分配到子细胞中从而稀释直至最终丢失，所以稳定转染要进行稳定细胞系的筛选，经过筛选出来的细胞株，此时的质粒已经完全整合到细胞基因组中，随着细胞的生长复制并稳定的遗传给后代。
瞬转稳转适用性瞬时转染表达和稳定转染表达最显著的区别就是在时间上。
瞬时转染在转染后四天即能收获细胞，瞬时转染一般用于基因产物的短期表达、基因敲除、蛋白质的小规模合成。
相对于瞬时转染，稳定转染表达适用于长期的药理学研究遗传调控机制研究及大规模的蛋白质合成，需要大量的周期，因此更费力成本投入高。
目前，在进行哺乳动物细胞蛋白表达蛋白时，因为细胞培养技术的进步和人们对瞬时转染的不断探索，人们已经可以对一些常用细胞进行悬浮培养，实现了瞬时转染对重组蛋白的大规模合成，节省了时间和成本。
细胞转染一般步骤以24孔板进行细胞瞬时转染表达为例，全程操作均为无菌状态，以免造成细胞污染转染前准备，细胞株或者直接培养后的细胞用胰蛋白酶消化后计数，铺板，培养基为含有1ml血清，不含抗性的正常培养基。
细胞转染技术的使用教程
细胞转染技术的使用教程细胞转染技术是生物学研究和生物医学领域中一项重要的实验技术，它能够将外源基因或其他生物分子导入到目标细胞，从而改变细胞的性状和功能。
本篇文章将介绍细胞转染技术的基本原理、常用的转染方法以及技术操作的注意事项。
一、细胞转染技术的原理细胞转染技术通过物理、化学和生物学方法将外源基因或其他生物分子导入到目标细胞中。
常见的转染方式包括病毒介导转染、化学物质介导转染、电穿孔等。
病毒介导转染是利用病毒作为基因载体，通过病毒的复制和传播机制将外源基因导入目标细胞。
化学物质介导转染则是利用化学物质改变细胞膜的通透性，使外源基因进入细胞。
电穿孔则是利用高压电脉冲破坏细胞膜的完整性，使外源基因进入细胞。
二、常用的转染方法1. 病毒介导转染病毒介导转染是细胞转染中最常用的方法之一，常见的病毒载体包括腺病毒（Adenovirus）、慢病毒（Lentivirus）和腺相关病毒（Adeno-Associated Virus，AAV）等。
病毒载体能够高效地将外源基因导入目标细胞，并在细胞内稳定表达。
病毒介导转染具有转染效率高、表达时间长等优点，但也存在一些限制，如细胞感染范围狭窄、潜在的免疫反应等。
2. 化学物质介导转染化学物质介导转染常用的试剂有磷脂体（Liposome）和聚乙烯亚胺（Polyethyleneimine，PEI）等。
这些试剂能够与外源基因形成复合物，通过与细胞膜结合而进入细胞。
化学物质介导转染方法具有转染效率高、适用于多种细胞类型等优点，但也存在一些缺点，如细胞毒性、细胞内溶酪斑形成等。
3. 电穿孔电穿孔是一种利用高压电脉冲破坏细胞膜的完整性，使外源基因进入细胞的方法。
通过施加电场，电穿孔能够短暂地增加细胞膜的通透性，使外源基因能够进入细胞质。
电穿孔方法具有转染效率高、适用于多种细胞类型等优点，但操作相对复杂，需要专业的设备和技术支持。
三、技术操作的注意事项1. 细胞的选择和培养在进行细胞转染实验之前，需要选择适宜的细胞系进行培养。
细胞转染技术课件
研究基因功能
基因表达调控
通过转染特定基因，研究其在细胞内的表达调控机制，有助于深入 了解基因的功能和作用。
基因敲除与敲入
利用转染技术将特定基因敲除或敲入细胞中，以探究基因对细胞生 长、分化等过程的影响。
表观遗传学研究
通过转染特定因子或抑制剂，研究表观遗传修饰对基因表达的调控作 用。
与合作。
降低对细胞的毒性
寻找低毒性的转染试剂
研发和选用对细胞毒性更低的转染试剂，减轻对细胞的损伤。
控制转染条件
优化转染条件，如降低转染浓度、减少转染时间等，以减轻对细胞的毒性。
细胞株的选择
选用对转染更具有耐受性的细胞株，降低转染过程中的毒性。
发展新型的转染技术与方法
非病毒载体转染技术
研究和发展非病毒载体转染技术，如纳米材料、基因 编辑技术等，以实现更高效、安全的基因转移。
体内转染技术
探索和发展体内转染技术，提高基因治疗在临床应用 中的效果和安全性。
跨物种转染技术
研究和发展跨物种转染技术，拓宽基因功能研究和基 因治疗的应用范围。
CHAPTER 06
案例分析：某基因的功能研 究
研究背景与目的
某基因在肿瘤发生发展中的重要作用
近年来，研究发现某基因在多种肿瘤中高表达，可能与肿瘤的发生、发展、转移等过程 密切相关。
提高转染效率的方法
预处理细胞
通过药物处理、电穿孔等方式预处理细胞，可以提高细胞膜的通 透性，有利于转染试剂进入细胞。
共转染
同时转染多个基因或质粒，可以提高转染效率和基因表达水平。
筛选稳定转染细胞株
通过药物筛选或克隆选择等方法，筛选出稳定表达目的基因的细胞 株，可以长期保存和应用。
干货：细胞转染的常用方法
干货：细胞转染的常用方法作为一条标准的实验狗，细胞转染这条路可谓是荆棘丛生，很多实验狗们看见细胞转染率低就把细胞给扔掉了！中洪小编告诉你，千万别这样“作死”，因为实验材料也很贵的啊！！科研道路十分漫长，今天我们来看看细胞转染实验大比拼。
首先我们看看细胞转染有哪些常见方式：细胞转染途径化学介导——利用载体分子包被核酸使其呈现中性电荷或正电荷DEAE磷酸钙法人工脂质体法物理介导——在细胞膜表面产生一个瞬时的孔从而导入DNA 显微注射法电穿孔法基因枪法病毒介导——利用基因工程病毒转染非病毒基因到细胞中逆转录病毒腺病毒（人脐带间充质干细胞转染图，图为本公司实验图，勿盗）小编总结了几种经典的传统方法，在此一一做一个介绍。
1磷酸钙共沉淀原理：该法可用于瞬时或稳定转染。
然而因其对pH、温度和缓冲液盐浓度的微小变化十分敏感，所得结果容易出现差异，且对许多类型的细胞培养物(尤其是原代细胞)具有细胞毒性，转染效率较差。
实验步骤：将核酸与氯化钙在磷酸盐缓冲液中混合，同时控制好pH、温度等条件→ 室温孵育，生成浓缩DNA的极小不溶性颗粒沉淀→ 将颗粒型沉淀分散到细胞中，促进DNA粘附在细胞表面→ 共沉淀通过内吞作用进入胞浆→ 分析细胞瞬时基因表达或者选择稳定性传染。
2人工脂质体法原理：带正电的脂质体与核酸带负电的磷酸基团形成复合物，进而可被细胞内吞稳定转染/瞬时性转染。
这种方法几乎适用于所有细胞，转染效率高、重复型好，但转染时需要去除血清，转染效果随细胞类型变化大。
实验步骤：在单独试管中分别稀释核酸及转染试剂→ 脂质体与核酸的磷酸骨架结合，形成复合物→ 脂质体上的正电荷有助于复合物与细胞膜结合→ 复合物通过内吞作用进入胞浆→ 分析细胞瞬时基因表达或沉默情况。
3病毒转染原理：对于用脂质体不能实现转染的细胞，可以采用病毒转染。
可用于蛋白质过表达或抑制，是临床研究中最常用的方法。
它通过侵染宿主细胞将外源基因整合到染色体中，可用于难转染细胞、原代细胞的稳定性转染。
细胞转染 Protocol
细胞转染是一种常用的生物技术，用于将外源基因或药物引入细胞中。
下面是细胞转染的实验原理、所需试剂和耗材、实验仪器、准备工作、实验方法、注意事项、常见问题及解决方法。
一、实验原理细胞转染是利用细胞膜的通透性，将带有特定基因或药物的载体分子导入细胞内。
常用的载体分子包括病毒载体和非病毒载体。
病毒载体如腺病毒、逆转录病毒等，能将外源基因高效地导入细胞中，但可能对细胞产生一定毒性。
非病毒载体如脂质体、阳离子聚合物等，相对安全，但导入效率较低。
通过细胞转染，可以实现对基因的表达调控，探索基因功能和药物筛选等研究。
二、所需试剂和耗材1.试剂：o培养基：如DMEM、F12等，用于细胞培养。
o血清：如胎牛血清，提供细胞生长所需的营养物质。
o抗生素：如青霉素、链霉素等，用于防止细胞污染。
o转染试剂：如Lipofectamine、Effectene等，用于细胞转染。
o DNA或RNA：携带目的基因的质粒或寡核苷酸。
2.耗材：o细胞培养瓶、板：用于细胞培养。
o离心管：用于细胞转染后洗涤和离心。
o移液器及枪头：用于精确加样。
o过滤器：用于过滤溶液中的杂质。
o无菌水：用于稀释和配制溶液。
三、实验仪器1.实验室搅拌器：用于混合溶液。
2.高速冷冻离心机：用于离心和分离细胞。
3.水浴锅：用于加热溶液。
4.无菌工作台或超净工作台：用于进行无菌操作。
5.分光光度计：用于测量细胞生长状况和转染效率。
6.荧光显微镜：用于观察细胞转染后荧光蛋白的表达情况。
7.CO2培养箱：提供细胞培养所需的气体环境。
四、准备工作1.仔细阅读实验步骤和注意事项，了解所需的试剂和耗材及其使用方法。
2.准备好所需的试剂和耗材，并确保它们处于保质期内。
3.检查实验室内是否具备上述实验仪器，并确保其正常运行。
4.用70%乙醇擦拭实验台面，以确保无菌环境。
5.用高压蒸汽灭菌法灭菌所有的实验器具，包括离心管、移液器等，需在适当的压力和温度下进行灭菌处理，以消除所有潜在的污染源。
细胞转染技术
走近奇妙的细胞转染技术
细胞转染技术是一种基因编辑和药物传递的重要手段。
相比传统
的细胞转染方法，最新的技术在转染效率和安全性上有了显著的提高。
首先介绍一下细胞转染技术的原理。
细胞转染即将外源性DNA、RNA或蛋白质引入细胞内，达到改变细胞物质代谢和功能的目的。
目前常用的转染方式有化学转染、电转染、病毒载体转染和基因枪转染等。
化学转染方法成本低，适用于许多细胞类型，但转染效率有限。
电转
染方法转染效率高，可避免化学试剂的毒性和副作用，但对细胞有一
定的损伤。
病毒载体转染法理论上具有最高的转染效率，但存在毒性
和免疫原性等问题。
基因枪转染法适用于许多植物和哺乳动物细胞，
但存在微小伤口引起的细胞损伤。
在这些传统转染方法的基础上，近年来涌现出一系列新技术。
例
如CRISPR-Cas9系统既可实现靶向基因编辑，又可通过蛋白质转染法
进行外源基因表达，成功地解决了先前基因编辑难以直接转染的问题。
此外，电渗流技术通过产生电场增加细胞膜透过性，提高了转染效率，也避免了致死性的高电流。
胶束递送技术则使用聚合物的自组装能力，形成胶束并包裹负电荷的DNA或RNA分子，在转染效率和防止免疫原
性方面有了良好的表现。
细胞转染技术在医疗和生命科学领域有着广泛的应用。
例如基因
疗法、干细胞分化和药物筛选等研究，都需要细胞转染技术的支持。
当然，促进细胞转染技术的发展，仍需继续探究转染机制，提高转染效率和特异性，减少毒性和副作用，从而更好地发挥其作用。
细胞转染原理
细胞转染原理细胞转染是一种常用的实验技术，用于将外源DNA、RNA或蛋白质等分子引入细胞内，以实现基因敲除、过表达、信号转导研究等目的。
细胞转染技术的原理是利用化学、物理或生物学方法，使外源分子穿过细胞膜，进入细胞内部。
本文将介绍细胞转染的原理及常用的转染方法。
细胞转染的原理主要包括细胞膜渗透性增加、内吞作用和融合作用。
首先，细胞膜渗透性增加是指通过物理或化学手段使细胞膜通透性增加，使外源分子能够穿过细胞膜进入细胞内。
其次，内吞作用是指细胞通过吞噬囊泡将外源分子包裹起来，形成内吞泡，然后将其输送到细胞内部。
最后，融合作用是指外源分子与细胞膜融合，直接进入细胞内。
常用的细胞转染方法包括化学转染、电穿孔法、基因枪法和病毒载体法。
化学转染是利用化学试剂（如聚乙烯亚胺、脂质体等）破坏细胞膜，使外源分子进入细胞内。
电穿孔法是利用电场作用使细胞膜通透性增加，使外源分子进入细胞内。
基因枪法是将外源分子包裹在微粒上，通过高速射击使其穿过细胞膜进入细胞内。
病毒载体法是利用病毒载体将外源分子转染入细胞内。
细胞转染技术在基因工程、细胞治疗、药物筛选等领域具有广泛的应用。
通过转染技术，可以实现基因敲除、外源基因表达、蛋白质功能研究等多种实验目的。
在细胞治疗领域，细胞转染技术可以用于将修饰后的细胞注入患者体内，治疗一些遗传性疾病或癌症。
在药物筛选领域，细胞转染技术可以用于快速筛选药物的活性和毒性，加快新药研发的速度。
总之，细胞转染技术是一种重要的实验手段，可以帮助科研人员进行基因功能研究、新药筛选和细胞治疗等工作。
通过深入了解细胞转染的原理和常用方法，可以更好地应用这一技术，推动科学研究和医学进步。
细胞转染sop
细胞转染步骤细胞转染是将外源分子如DNA，RNA导入真核细胞的技术。
它已成为一种研究基因表达调控，基因突变分析，蛋白质生产的常规方法，其应用范围越来越广。
细胞转染可分为瞬时转染和稳定转染两大类：瞬时转染，外源基因进入受体细胞后，存在于游离载体上，不整合在细胞的染色体上。
此时，外源DNA仍然以附加的形式存在于细胞内，因此，mRNA或蛋白质产物必须在短时间（1-3天）内进行测定或分析，而且质粒的人工构想和拷贝数可能会导致特异性调控元件失活或具有特异功能。
其优点是快捷、简单，易于对结果进行分析，因此成为启动子功能分析的首选方法。
稳定转染，外源DNA整合到宿主细胞的染色体上。
由于外源基因被整合到细胞的染色体中，使得调控区能更精确的模拟正常功能，对随后的转录分析没有时间限制。
缺点是需要进行药物筛选和细胞扩增，因此操作难度大，需要的周期较长。
转染的常见方法有：（一）物理介导法：电击法、显微注射法、基因枪法（二）化学介导法：DEAE-葡聚糖法、磷酸钙法、脂质体法（三）病毒介导法：腺病毒法、逆转录病毒法现在对于很多普通细胞系，常用的是瞬时转染方法中的脂质体法。
下面介绍下细胞转染的具体步骤：1.转染前准备：转染前一天，取生长状况良好的细胞，经胰酶消化成单个细胞后，计数。
根据实验需要，铺合适细胞量在板中，使第二天转染时的细胞密度达到80-90%。
2、细胞转染（1）在做转染实验前一般给细胞更换新鲜的完全培养基，并置于培养箱中继续培养。
最好是加入加血清但不含抗生素的培养基。
（2）准备几个无菌的1.5ml EP管，并做好标记。
一支EP管上标记DNA（即质粒的名字），一支EP管上标记lipofectamine2000。
（3）分别在两支EP管加入50微升的opti-MEM。
（4）在标记质粒的EP管里加入质粒，另一支EP管里加入脂质体。
（5）分别轻轻混匀，室温静置5min。
（6）再将含有质粒的opti-MEM培养基加入到含有脂质体的opti-MEM的培养基中。
瞬时转染实验步骤-概述说明以及解释
瞬时转染实验步骤-概述说明以及解释1.引言1.1 概述瞬时转染实验是一种广泛应用于分子生物学研究的技术手段。
通过该实验，研究人员能够将外源基因材料有效地传递到细胞内，从而实现对基因功能和细胞过程的研究。
瞬时转染实验的步骤相对简单，同时能够快速地获得实验结果，因此在许多研究领域被广泛应用。
本文旨在介绍瞬时转染实验的具体步骤，并讨论其研究结果的分析方法。
首先，我们将详细介绍实验前的准备工作，包括培养细胞、制备转染试剂以及优化实验条件等。
其次，我们将重点介绍瞬时转染的步骤，包括选择适当的转染方法、判断转染效率以及确定最佳转染时间等方面的内容。
最后，我们将展示如何对实验结果进行分析，包括利用荧光染料观察转染效果、使用定量PCR或Western blot等方法检测目标基因的表达水平。
通过本文的研究，我们旨在总结瞬时转染实验的操作步骤，为其他研究人员提供一种快速、高效的细胞转染方法，并探讨转染结果的研究意义。
此外，我们还将展望未来研究方向，包括进一步优化转染方法、完善转染效果评价体系以及探索转染技术在临床治疗中的应用前景等。
通过本文的阅读，读者将能够全面了解瞬时转染实验的实施步骤和结果分析方法，为自己的研究工作提供有价值的参考。
同时，我们也期望读者通过本文的阅读，进一步深入探索转染技术的应用领域，并为未来的基础研究和临床应用做出更多的贡献。
1.2文章结构文章结构：本文主要包括引言、正文和结论三个部分。
引言部分分为概述、文章结构和目的三个小节。
概述部分主要介绍瞬时转染实验的背景及其在生命科学研究中的重要作用，以及当前已有的研究进展和存在的问题。
文章结构部分主要说明整篇文章的组织结构，从而使读者对后续内容有一个整体的了解。
该部分提供了文章的目录，方便读者查阅。
目的部分则明确了本文研究的目标，即通过瞬时转染实验步骤的介绍和实验结果的分析，探索某一具体问题或验证某一假设，为相关研究提供依据。
正文部分主要包括实验准备、瞬时转染步骤和实验结果分析三个小节。
细胞转染方法
细胞转染方法根据不同的试验目的，外源DNA导入哺乳细胞有两种类型：瞬时转染和稳定转染。
瞬时转染是指外源基因进入受体细胞后，存在于游离的载体上，不整合到细胞的染色体上，在外源基因导入细胞1-4天后收获细胞进行分析；稳定转染需要外源基因整合到细胞的染色体上，从而得到稳定的转染细胞株。
下面介绍几种转染方法：DEAE-葡聚糖：这是早在1965年出现的转染方法。
带正电的DEAE-葡聚糖或polybrene(多聚季胺)多聚体可以结合带负电的DNA分子，使得DNA复合物结合在带负电的细胞表面。
通过使用DMSO或甘油获得的渗透休克，也可能是细胞内吞作用使得DNA复合体进入细胞。
DEAE-葡聚糖仅限于瞬时转染，可重复性好，转染时要除掉血清。
磷酸钙共沉淀转染：最早在1973年开始采用。
氯化钙+DNA+磷酸缓冲液按一定的比例混和，形成极小的磷酸钙-DNA复合物沉淀黏附在细胞膜表面，借助内吞作用进入细胞质。
沉淀颗粒的大小和质量对于转染的成功至关重要，pH值、钙离子浓度、DNA浓度、沉淀反应时间、细胞孵育时间乃至各组分加入顺序和混合的方式都可能对结果产生影响，重复性不佳。
此法较易得到稳定转染，但转染原代细胞比较困难。
电穿孔法：通过短暂的高电场电脉冲处理细胞，沿细胞膜的电压差异会导致细胞膜的暂时穿孔。
DNA被认为是穿过孔扩散到细胞内的。
电脉冲和场强的优化对于成功的转染非常重要，因为过高的场强和过长的电脉冲时间会不可逆地伤害细胞膜而裂解细胞。
理论上说电穿孔法可用于各种细胞，且不需要另外采购特殊试剂，但需要昂贵的电转仪。
此法每次转染需要更多的细胞和DNA，因为细胞的死亡率高。
每种细胞电转的条件都需要进行多次优化。
脂质体法：中性脂质体是利用脂质膜包裹DNA，借助脂质膜将DNA 导入细胞膜内。
带正电的阳离子脂质体则不同，DNA并没有预先包埋在脂质体中，而是带负电的DNA自动结合到带正电的脂质体上，形成DNA-阳离子脂质体复合物，从而吸附到带负电的细胞膜表面，经过内吞被导入细胞。
瞬时转染原理及实验步骤
瞬时转染原理及实验步骤哺乳动物细胞瞬时转染能在短期内快速表达高活性蛋白而被广泛应用。
本文主要介绍了细胞瞬时转染的步骤、原理，及血球计数板对细胞计数的原理和方法。
哺乳动物细胞自身具有蛋白折叠和翻译后修饰的功能，获得的蛋白更具有天然活性。
哺乳动物细胞生产蛋白的方式有两种：瞬时转染和稳定转染。
瞬时转染的特点是短期快速表达，满足蛋白的小量制备。
而稳定转染通过构建稳定细胞系能够满足蛋白的大量、长期生产。
瞬时转染是指将构建好的质粒通过某种方式导入到哺乳动物细胞内（主要指HEK293细胞），该质粒上的外源基因不整合到细胞自身的基因组上。
随着细胞的生长分裂，外源基因会逐渐丢失。
质粒在细胞内能够存在3-4天，此时间内，质粒外源基因在细胞内发生转录翻译，得到极为少量的蛋白。
这一整个快速转染得到蛋白的过程就称为瞬时转染表达。
瞬时转染步骤瞬时转染流程简图细胞复苏细胞复苏是将保存在液氮或-80℃冰箱中的细胞株解冻并重新培养的过程。
细胞复苏的关键是快速。
防止在解冻过程中，产生的水珠形成冰晶损伤细胞。
细胞复苏一般步骤如下：1.预先加热水浴锅，温度至37-40℃，并在离心管中准备好10mL培养基2.从液氮罐或冰箱中取出细胞，迅速放进预热的水浴锅中，镊子夹住冻存管晃动，使其受热均匀3.当冻存管内完全融化时，注意用酒精擦拭冻存管消毒，将液体倒入含有10mL培养基的离心管中4.离心5min，去除上清，得到沉淀5.用培养基悬浮沉淀，并接种到培养瓶常规细胞培养细胞复苏后，生长一段时间，95%的细胞贴壁生长，细胞状态良好，说明细胞复苏成功。
瞬转步骤以Lipofectamine转染试剂为例的操作流程，不同转染试剂参考说明书1.将复苏后常规培养的细胞按照1-3x105接种到6孔板中，加入2-4mL的完全培养基，混匀放置在二氧化碳培养箱中37℃过夜2.无菌状态下配置如下溶液：a用100ul的无血清培养基稀释2ug的待转染的质粒b用100ul的无血清培养基稀释25ul的Lipofectamine转染试剂（血清的存在会影响细胞转染效率，因此要使用无血清培养基转染）3.将ab溶液混合并摇匀，室温下放置30min左右4.细胞培养至80%单层左右，用无血清培养基洗涤细胞2次，每孔加入1mL的无血清培养基，并将混合后的ab溶液逐滴加入到每孔，按十字方向轻摇混匀，二氧化碳培养箱中37℃培养24小时5.将转染液倒出，换为完全培养基继续培养，培养3-4天后检测蛋白表达量转染检测收集培养的细胞，采用超声或酶解的方法破碎细胞，离心得到上清。
瞬时转染原理
瞬时转染原理瞬时转染是一种广泛应用于生物医学研究的技术手段，它能够在短时间内将外源DNA导入到细胞内。
这种原理的发现和应用为我们理解细胞功能和研究疾病的机制提供了强有力的工具。
瞬时转染的原理基于细胞膜和细胞内部的特性。
通常，细胞膜具有一定的渗透性，可以允许一些小分子通过，但对于大分子如DNA来说是有限制的。
然而，通过特定的转染方法，我们可以利用细胞膜的这种渗透性，将外源DNA引入到细胞内。
最常用的瞬时转染方法之一是化学瞬时转染法。
这种方法利用电荷特性使DNA与载体形成复合体，然后复合体与细胞膜结合，通过电位差使其转移到细胞内。
其中最常用的化学转染试剂是聚乙烯亚胺（PEI）和二磷脂体（Liposome）。
聚乙烯亚胺是一种阳离子聚合物，通过与DNA形成正电荷，使其与细胞膜上的负电荷相互吸引，进而实现DNA的传递。
而二磷脂体则是由两层磷脂组成的球形结构，可以将DNA包裹在内部，通过与细胞膜融合，将DNA释放到细胞内。
另一种常用的瞬时转染方法是电穿孔法。
该方法利用电场将DNA 直接转移到细胞内。
在电穿孔法中，细胞被置于一个电穿孔仪器中，通过向细胞施加高电压脉冲，可以造成细胞膜的临时孔隙，以便DNA 通过。
一旦电场消失，细胞膜将恢复其正常状态。
除了上述化学法和电穿孔法之外，还有其他的瞬时转染方法，如病毒介导的转染和微粒炮法等。
病毒介导的转染利用病毒作为运载体将外源DNA导入到细胞内。
微粒炮法则是利用高速微粒击打器将DNA包裹在微粒上，然后通过飞速射入细胞，从而实现转染。
通过瞬时转染技术，可以在短时间内将外源DNA导入到细胞内，从而实现对特定基因或蛋白质的功能研究。
这对于理解细胞的信号传导和调控机制非常重要，同时也为研究疾病的发生和治疗提供了重要工具。
通过瞬时转染技术，我们可以观察在特定基因或蛋白质干预下细胞的变化，了解其功能和相互作用关系，从而揭示疾病的发生机制。
在进行瞬时转染实验时，需要注意一些操作细节。
细胞转染技术从入门到精通
细胞转染技术从入门到精通概念：概括地说，转染是使用非病毒感染的手段人工引入核酸（DNA或RNA）进入细胞的过程。
转染的目的是产生重组蛋白，或特异性增强或抑制转染细胞中的基因表达。
转染的类型根据导入的核酸存在于宿主细胞的时间长短，可以分为瞬转和稳转。
根据转染方式可以分为化学，生物，物理方法。
瞬转：因为导入的核酸没有整合到宿主细胞基因组，因此它只会短暂地存在于宿主细胞中，不会随着细胞的分裂而进入到子代细胞中。
然而，导入的遗传物质的高拷贝数导致其在细胞内的蛋白质表达水平较高。
根据所使用的载体的不同，瞬转通常可以1至7天内进行基因检测，但是瞬时转染的细胞通常在转染后24-96小时收获。
当使用超螺旋质粒DNA时，瞬时转染的效果最好，推测是由于超螺旋质粒DNA能更有效地被细胞摄取。
稳转：外源DNA整合到细胞基因组中或作为附加体质粒保留在细胞中。
与瞬时转染不同，稳定转染允许外源DNA在转染的细胞及其后代中的长期维持。
然而，通常是将单拷贝或几个拷贝的外源DNA整合到稳定转染的细胞的基因组中，因此，其表达水平一般低于瞬时转染的表达水平。
由于稳转效率较低，因此选用有效地转染策略和筛选方法很重要。
其中比较可靠地筛选方法是在DNA载体中包含选择性标记，然后在细胞转染短暂性恢复后进行适当地选择性加压。
尽管相对于超螺旋DNA，线性DNA被细胞摄取的效率较低，但其能最有效地整合到宿主基因组中。
目前，由于各种转染试剂的发明，哺乳动物细胞的瞬时转染已经用于生产具有适当折叠和翻译后修饰的重组蛋白。
但表达mg/L-g/L 的重组蛋白主要依赖于稳定细胞系的产生。
瞬转和稳转的比较瞬转稳转导入的DNA没有整合到基因组中，而是保留在细胞核上导入的DNA整合到基因组中导入的遗传物质不传递到子代；遗传改变只是暂时的导入的遗传物质能够代代相传；遗传改变是永久的不需要选择性筛选需要选择性筛选出稳定转染的细胞DNA载体和RNA都可用于瞬时转染只有DNA载体可用于稳定转染；RNA本身不能稳定地导入细胞中导入的遗传物质的高拷贝数导致高水平的蛋白质表达。
稳定转染VS瞬时转染
稳定转染VS瞬时转染生物通报道：转染是将外源遗传物质导入真核细胞的过程，是细胞和分子生物学研究的重要工具，可用于研究基因表达对细胞生理水平的影响。
不论是质粒、DNA还是各种RNA（mRNA、siRNA或microRNA），要将这些外源核酸转入细胞并不容易，它们必须穿过细胞膜这层屏障才能进入细胞质。
转染方法可分为物理转染和化学转染，物理转染方法包括电穿孔、显微注射和基因枪等，化学转染可使用磷酸钙共沉淀、DEAE-Dx或基于阳离子脂质的转染试剂。
上述方法都可以解决转染面临的主要挑战，即让带负电荷的核酸分子穿过带负电的细胞膜。
物理转染方法一般是在细胞膜上打洞来克服静电排斥，使核酸插入。
而化学转染中，一般是利用带正电的转染试剂将带负电的核酸包裹起来。
这些方法都可以实现转染，可谓条条大路通罗马，那么究竟是选瞬时转染好还是选稳定转染好呢？瞬时转染的细胞中，外源基因得以表达但它们并不会整合到细胞的基因组中，也就不会被复制。
细胞中瞬时转染的外源基因表达时间有限，通常仅持续几天，直到外源基因在细胞分裂过程中因各种因素丢失为止我们如何区分细胞是否转染成功了呢？在转染质粒中往往都含有一个报告基因，来指示细胞中目标基因是否存在，这样的报告基因一般可以在转染后一两天内检测到。
稳定转染可以在瞬时转染的基础上建立，只不过需要一个重要的偶发过程：在少数转染细胞中，外源基因能够整合到细胞的基因组中。
外源基因成为细胞基因组的一部分从而得以复制，这就是稳定转染细胞的标志。
稳定转染细胞的子代细胞也同样表达外源基因，由此形成稳定转染的细胞系。
在建立上述稳定转染细胞系时，我们需要使用选择性标记来区分瞬时转染与稳定转染。
将这些选择性标记与基因共表达，我们就可以筛选出外源基因已成功整合到基因组的细胞，同时剔除瞬时转染的细胞。
将外源基因与抗生素抗性基因共转染（如新霉素抗性基因neo）是一种常用方法，随后可用相应抗生素（如geneticin或G418）对转染后的细胞进行筛选。
细胞转染原理
一、转染的途径大致可分为物理介导、化学介导和生物介导三类：1.物理介导：电穿孔法、显微注射和基因枪属于通过物理方法将基因导入细胞的范例。
2.化学介导：方法很多，如经典的磷酸钙共沉淀法、脂质体转染方法、和多种阳离子物质介导的技术。
3.生物介导：方法有较为原始的原生质体转染，和现在比较多见的各种病毒介导的转染技术。
理想细胞转染方法，应该具有转染效率高、细胞毒性小等优点。
病毒介导的转染技术，是目前转染效率最高的方法，同时具有细胞毒性很低的优势。
但是，病毒转染方法的准备程序复杂，常常对细胞类型有很强的选择性，在一般实验室中很难普及。
其它物理和化学介导的转染方法，则各有其特点。
需要指出的一点，无论采用哪种转染技术，要获得最优的转染结果，可能都需要对转染条件进行优化。
影响转染效率的因素很多，从细胞类型、细胞培养条件和细胞生长状态，到转染方法的操作细节，都需要考虑。
二、常规转染技术：1.瞬时转染（transient transfection）：外源DNA/RNA不整合到宿主染色体中，因此一个宿主细胞中可存在多个拷贝数，产生高水平表达，但通常只持续几天，多用于启动子和其他调控元件的分析。
一般来说，超螺旋质粒DNA转染效率较高，在转染后24~72h小时内（依赖于各种不同的构建）分析结果，常常用到一些报告系统和荧光蛋白，β半乳糖苷酶等来帮助检测。
2.稳定转染（Stable transfected）：外源DNA既可以整合到宿主细胞中，也可能作为一种游离体（episome）存在。
尽管线性DNA比超螺旋DNA转入量低但整合率高。
外源DNA整合到染色体中概率很小，大约1/104转染细胞能整合，通常需要通过一些选择性标记。
如来氨丙基转移酶（APH；新霉素抗性基因），潮霉素磷酸转移酶（HPH），胸苷激酶（TK）等反复筛选，得到稳定转染的同源细胞系。
瞬时转染和稳定转染的比较三、转染方式细胞由带负电荷的磷脂双分子层构成，这对大分子物质来说是个不可透过的屏障，比如DNA和RNA的磷酸骨架，其也带负电荷。
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细胞转染技术原理及应用（瞬时转染和稳定转染）常规转染技术可分为两大类，一类是瞬时转染，一类是稳定转染（永久转染）。
前者外源DNA/RNA 不整合到宿主染色体中，因此一个宿主细胞中可存在多个拷贝数，产生高水平的表达，但通常只持续几天，多用于启动子和其它调控元件的分析。
一般来说，超螺旋质粒DNA 转染效率较高，在转染后24-72 小时内（依赖于各种不同的构建）分析结果，常常用到一些报告系统如荧光蛋白，β 半乳糖苷酶等来帮助检测。
后者也称稳定转染，外源DNA 既可以整合到宿主染色体中，也可能作为一种游离体（episome）存在。
尽管线性DNA 比超螺旋DNA 转入量低但整合率高。
外源DNA 整合到染色体中概率很小，大约1/104 转染细胞能整合，通常需要通过一些选择性标记，如来氨丙基转移酶（APH；新霉素抗性基因），潮霉素B 磷酸转移酶（HPH），胸苷激酶（TK）等反复筛选，得到稳定转染的同源细胞系。
转染技术的选择对转染结果影响也很大，许多转染方法需要优化DNA 与转染试剂比例，细胞数量，培养及检测时间等。
一些传统的转染技术，如DEAE 右旋糖苷法，磷酸钙法，电穿孔法，脂质体法各有利弊，其主要原理及应用特点见下表：（各种转染方法的比较）除上述传统方法外，近年来国际上推出了一些阳离子聚合物基因转染技术，以其适用宿主范围广，操作简便对细胞毒性小，转染效率高受到研究者们的青睐。
其中树枝状聚合物（Dendrimers）和聚乙烯亚胺（Polyethylenimine，PEI）的转染性能最佳，但树枝状聚合物的结构不易于进一步改性，且其合成工艺复杂。
聚乙烯亚胺是一种具有较高的阳离子电荷密度的有机大分子，每相隔二个碳个原子，即每“第三个原子都是质子化的氨基氮原子，使得聚合物网络在任何pH 下都能充当有效的“质子海绵”(proton sponge)体。
这种聚阳离子能将各种报告基因转入各种种属细胞，其效果好于脂质聚酰胺，经进一步的改性后，其转染性能好于树枝状聚合物，而且它的细胞毒性低。
大量实验证明，PEI 是非常有希望的基因治疗载体。
目前在设计更复杂的基因载体时，PEI 经常做为核心组成成分。
线型PEI（Line PEI,LPEI）与其衍生物用作基因转染载体的研究比分枝状PEI（Branched PEI,BPEI）要早一些，过去的研究认为在不考虑具体条件，LPEI/DNA 转染复合物的细胞毒性较低，有利于细胞定位，因此与BPEI 相比应该转染效率高一些。
但最近研究表明BPEI 的分枝度高有利于形成小的转染复合物，从而提高转染效率，但同时细胞毒性也增大。
超高分枝的、较柔性的PEI 衍生物含有额外的仲胺基和叔胺基，在染实验中发现这种PEI 的毒性低，但转染效率却较高。
GenEscort 是采用各种分枝状和超高分枝状的小分子PEI 与各种含有生理条件下可降解键的交联剂交联，合成出的一系列高分枝的可降解的PEI 衍生物。
聚合物的分枝结构使得其具有较高的正电性，因此易于高效地包裹各种DNA、RNA 分子及质粒形成小的纳米颗粒，从而提高转染效率，当所形成复合物进入细胞以后，其中所含的生理条件下可降解的化学键在细胞内水解，使交联聚合物分解为无细胞毒性的小分子PEI，这样结构的转染试剂在体外应用可以获得高的转染效率和低的细胞毒性，其可降解性对体内应用也具有重要的意义。
影响转染实验的因素转染技术是指将外源分子如DNA，RNA 等导入真核细胞的技术。
随着分子生物学和细胞生物学研究的不断发展，转染已经成为研究和控制真核细胞基因功能的常规工具。
在研究基因功能、调控基因表达、突变分析和蛋白质生产等生物学试验中，其应用越来越广泛。
影响转染效率的因素有很多，细胞株本身的特性和活性，细胞培养条件，转染的DNA 或RNA 的质量，转染方法，转染试剂的选择等。
常规转染技术可分为两大类，一类是瞬时转染，一类是稳定转染（永久转染）。
前者外源DNA/RNA 不整合到宿主染色体中，因此一个宿主细胞中可存在多个拷贝数，产生高水平的表达，但通常只持续几天，多用于启动子和其它调控元件的分析。
一般来说，超螺旋质粒DNA 转染效率较高，在转染后24-72 小时内（依赖于各种不同的构建）分析结果，常常用到一些报告系统如荧光蛋白，β - 半乳糖苷酶等来帮助检测。
后者也称稳定转染，外源DNA 既可以整合到宿主染色体中，也可能作为一种游离体（episome）存在。
尽管线性DNA 比超螺旋DNA 转入量低但整合率高。
外源DNA 整合到染色体中概率很小，大约1/104 转染细胞能整合，通常需要通过一些选择性标记，如来氨丙基转移酶（APH；新霉素抗性基因），潮霉素B 磷酸转移酶（HPH），胸苷激酶（TK）等反复筛选，得到稳定转染的同源细胞系。
转染效率受多种因素影响，主要因素有下面几个：1．转染试剂不同细胞系转染效率通常不同，但细胞系的选择通常是根据实验的需要，因此在转染实验前应根据实验要求和细胞特性选择适合的转染试剂。
每种转染试剂都会提供一些已经成功转染的细胞株列表和文献，通过这些资料可选择最适合实验设计的转染试剂。
当然，最适合的是高效、低毒、方便、廉价的转染试剂。
2．细胞状态一般低的细胞代数（<50）能确保基因型不变。
最适合转染的细胞是经过几次传代后达到指数生长期的细胞，细胞生长旺盛，最容易转染。
细胞培养在实验室中保存数月和数年后会经历突变，总染色体重组或基因调控变化等而演化。
这会导致和转染相关的细胞行为的变化。
也就是说同一种系的细胞株，在各实验室不同培养条件下，其生物学性状发生不同程度的改变，导致其转染特性也发生变化。
因此，如果发现转染效率降低，可以试着转染新鲜培养的细胞以恢复最佳结果。
3．转染方法不同转染试剂有不同的转染方法，但大多大同小异。
转染时应跟据具体转染试剂推荐的方法，但也要注意，因不同实验室培养的细胞性质不同，质粒定量差异，操作手法上的差异等，其转染效果可能不同，应根据实验室的具体条件来确定最佳转染条件。
（1）细胞培养物健康的细胞培养物是成功转染的基础。
不同细胞有不同的培养基，血清和添加物。
高的转染效率需要一定的细胞密度，一般的转染试剂都会有专门的说明。
推荐在转染前24 小时分细胞，这将提供正常细胞代谢，增加对外源DNA 摄入的可能。
一定要避免细菌，支原体或真菌的污染。
（2）细胞密度细胞密度对转染效率有一定的影响。
不同的转染试剂，要求转染时的最适细胞密度各不相同，即使同一种试剂，也会因不同的细胞类型或应用而异。
转染时过高或者过低的细胞密度会导致转染效率降低，乃至表达水平偏低。
因此如果选用新的细胞系或者新的转染试剂，最好能够进行优化实验并为以后的实验建立一个稳定方法，包括适当的接种量和培养时间等等。
阳离子脂质体具有微量的细胞毒性而往往需要更高的铺板密度或者更多的悬浮细胞数，有的要求细胞90%汇片；而有些多胺或者非脂质体的配方则要求在40%-80%之间，总之是尽量在细胞最适的生理状态下转染，以求最佳的转染效果。
不同的实验目的也会影响转染时的铺板密度，比如研究细胞周期相关基因等表达周期长的基因，就需要较低的铺板密度，所以需要选择能够在较低铺板密度下进行转染的试剂。
一般转染时贴壁细胞密度为50%-90%，但这个需要参考所选转染试剂的说明书。
（3）血清血清一度曾被认为会降低转染效率，老一代的转染方法往往要求转染前后洗细胞或者在无血清培养基条件下转染，但有些对此敏感的细胞如原代细胞会受到损伤，甚至死亡导致转染效率极低。
不过转染产品配方几经革新后的今天，对于主流的转染试剂来说，血清的存在已经不会影响转染效率，甚至还有助于提高转染效率，如阳离子聚合物等，血清的存在会影响DNA—转染复合物的形成，但只要在DNA-转染复合物形成时用无血清培养基或PBS 来稀释DNA 和转染试剂就可以了，在转染过程中是可以使用血清的。
不过要特别注意：对于RNA 转染，如何消除血清中潜在的RNase 污染是值得关注的。
胎牛血清（FCS）经常用到，便宜一点的有马或牛血清。
通常的，血清是一种包含生长因子及其它辅助因子的不确切成分的添加物，对不同细胞的生长作用有很大的差别。
血清质量的变化直接影响细胞生长，因此也会影响转染效率。
新加培养基的预热对细胞转染很有帮助。
（4）抗生素细胞培养过程中往往会添加抗生素来防止污染，但是这些添加剂可能对转染造成麻烦。
比如青霉素和链霉素，就是影响转染的培养基添加物。
这些抗生素一般对于真核细胞无毒，但有些转染试剂增加了细胞的通透性，使抗生素可以进入细胞。
这可能间接导致细胞死亡，造成转染效率低。
目前转染试剂因为全程都可以用有血清和抗生素等添加剂的完全培养基来操作，非常方便，省去了污染等麻烦。
（5）氮磷（N/P）比N/P 比是转染效率的关键（为了换算方便，一般以DNA/转染试剂质量比表示），在一定比例范围内转染效率随N/P 比成比例增高，之后达到平值，但毒性也随之而增加，因此在实验之前应根据推荐比例，确定本实验的最佳转染比例。
（6）DNA 质量DNA 质量对转染效率影响非常大。
一般的转染技术（如脂质体等）基于电荷吸引原理，如果DNA 不纯，如带少量的盐离子，蛋白，代谢物污染都会显著影响转染复合物的有效形成及转染的进行，但对GenEscort 系列转染试剂影响不大。
核酸纯化世界第一品牌德国QIAGEN 公司提供的超纯质粒抽提试剂盒，能达到两倍2×CsCl 梯度离心以上的纯度效果，使您不必为DNA 质量操心。
此外，对一些内毒素敏感的细胞（如原代细胞，悬浮细胞和造血细胞），QIAGEN 还提供可去除内毒素污染的质粒抽提试剂盒，在质粒抽提过程中有效去除脂多糖分子，保证理想的转染效果。
但如果使用GenEscort 转染试剂，一般不需要这么高的DNA 质量要求。
当使用GenEscort 转染试剂时，即使采用传统的酚－氯仿沉淀方法纯化质粒，仍然可达到非常好的转染效果，但所用的质粒量比试剂盒纯化方法的DNA 用量大一些。
4．载体构建转染载体的构建（病毒载体，质粒DNA，RNA，PCR 产物，寡核苷酸等）也影响转染结果。
病毒载体对特定宿主细胞感染效率较高，但不同病毒载体有其特定的宿主，有的还要求特定的细胞周期，如逆转录病毒需侵染分裂期的宿主细胞，此外还需考虑一些安全问题（如基因污染）。
除载体构建外，载体的形态及大小对转染效率也有不同的影响，如前面提到的超螺旋及线性DNA 对瞬时和稳定转染的影响。
如果基因产物对细胞有毒性作用，转染也很难进行，因此选择组成或可调控，强度合适的启动子也很重要，同时做空载体及其它基因的相同载体构建的转染正对照可排除毒性影响的干扰转染技术的要点及转染试剂正确选择转染技术是指将外源分子如DNA，RNA 等导入真核细胞的技术，它是研究基因表达调控，突变分析等的常规工具。